Abstract
I planter og grønne alger, blir lyset fanget av lys-høsting komplekser (LHCs), en familie av integrerte membranproteiner som koordinerer klorofyll og karotenoider. In vivo, er disse proteinene foldet med pigmenter å danne komplekser som er satt inn i thylakoid membran i kloroplasten. Den høye likhet i de kjemiske og fysiske egenskaper for de medlemmer av familien, sammen med det faktum at de lett kan miste pigmenter under isolasjon, gjør deres rensing i en naturlig tilstand utfordrende. En alternativ tilnærming for å oppnå homogene preparater av LHCs ble utviklet av Plumley og Schmidt i 1987 1, som viste at det var mulig å rekonstruere disse kompleksene in vitro som starter fra rensede pigmenter og ubrettede apoproteiner, noe som resulterer i komplekser med egenskaper meget lik som opprinnelig komplekser. Dette åpnet veien til anvendelse av bakterielle uttrykte rekombinante proteiner for in vitro (f.eks pigmentbindingssteder) eller protein domene (f.eks protein-protein interaksjon, folding). Denne metoden har blitt optimalisert i flere laboratorier og brukes til det meste av lys-høsting komplekser. Protokollen er beskrevet her beskriver metode for rekonstituering av lys-høsting kompleksene in vitro i dag brukes i vårt laboratorium, og eksempler som beskriver anvendelser av fremgangsmåten er gitt.
Introduction
Den fotoapparat av planter og alger omfatter integrerte membranproteiner som binder klorofyll a (CHL a), b (CHL b) og karotenoider (bil). Disse pigment-proteinkomplekser er aktive i høste lysenergi og overføring at eksitasjonsenergien til reaksjonssentre, hvor de benyttes til å fremme ladningsseparasjon 2. De er også involvert i regulatoriske tilbakekoblingsmekanismer som beskytter fotosynteseapparat fra høy lys skade 3,4. De lys høsting komplekser (LHCs) består av en stor familie av relaterte proteiner i planter og alger fem.
Den homogene rensing av hvert medlem av familien er blitt komplisert ved de svært lignende kjemiske og fysiske egenskaper for de komplekser. I tillegg rensefremgangsmåter resulterer ofte i tap av pigmenter eller andre potensielle kofaktorer slik som lipider. In vitro rekonstituering representants en kraftig metode for å overkomme disse problemene. LHC forbundet med photosystem II (LHC-II) ble først rekonstitueres in vitro ved Plumley og Schmidt i 1987 1. Forskerne ekstrahert delipidert protein og pigmenter separat fra plante-kloroplaster, og deretter kombinert varme denaturert protein med pigmentene i nærvær av litium Dodecyl Sulfate (LDS), etterfulgt av tre sykluser med frysing og tining 1. De viste at de spektrale egenskapene til det rekonstituerte LHC komplekser var svært lik komplekser renset fra planter. Den enkle rekonstituering LHC pigment-protein komplekser, sannsynligvis på grunn av noen iboende selvbygging funksjonen, sammen med vanskene med å isolere rensede komplekser fra organismer, førte til rask adopsjon av metoden av andre forskere. Den tilberedning av foto proteiner overuttrykkes i Escherichia coli (E. coli) ble oppnådd ved Paulsen og kolleger i 1990 seks. In E.coli, overuttrykkes membran proteiner er vanligvis finnes i inklusjonslegemer, som anlegg deres rensing. Rekonstituering er oppnådd gjennom varme-denaturering av inklusjonslegemer inneholdende rekombinant protein i nærvær av LDS, etterfulgt av tilsetning av pigmenter som initierer proteinfolding. Folding av LHCII komplekset er en to-trinns prosess: først, er klorofyll a bundet i mindre enn 1 min; andre, er klorofyll b bundet og stabilisert over flere minutter 7.
I tillegg til å gi innsikt i folde dynamikk, har in vitro rekonstituering kombineres med seterettet mutagenese tillot identifisering av spesifikke aminosyrer som er viktige for stabilitet (for eksempel 8,9) eller pigment koordinasjon (f.eks, 10). Manipulering av refolding forhold ved å justere parametere som pigment sammensetning eller vaskemidler har også identifisert elementer critical for riktig folding, slik som kravet xantofyller for LHCII kompleks (f.eks, 1,11). Videre har undersøkelser av egenskapene til de enkelte pigmenter som er bundet til kompleksene vært mulig ved hjelp av komplekser rekonstituert in vivo (for eksempel 10).
Metoden som beskrives her begynner med isolering av pigmenter (klorofyll og karotenoider) fra spinat og grønnalgen Chlamydomonas reinhardtii. Uttrykket og rensing av et LHC protein fra E. coli i form av inklusjonslegemene blir deretter beskrevet, etterfulgt av oppløsning av LHC og påfølgende rensing ved Ni affinitetskolonne. I det siste trinnet, er de rekonstituerte komplekser ytterligere renset ved sukrose-gradient sentrifugering for å fjerne frie pigmenter og utfoldet apoprotein. Denne protokollen representerer en optimalisert fremgangsmåte som omfatter flere modifikasjoner som har blitt introdusert av forskjellige laboratorier fordelttid 1,6,10,12 -14.
Protocol
1. Total Pigment Utvinning fra spinat blader
- Homogenisere en håndfull spinatblader (~ 20 g) i 100 ml kaldt Sliping Buffer (se tabell 1) ved hjelp av en blender for 20 sek.
- Filtrer løsningen gjennom et to lag av nylon tøy med en porediameter på 20 um og sentrifuger filtratet ved 1500 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Resuspender pellet inneholdende kloroplaster med en myk børste kunstnere maling i 1 ml kald vaskebuffer (se tabell 1). Når pelleten resuspenderes, tilsett 50 ml vaskebuffer, og sentrifuger løsningen ved 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten forsiktig (thylakoids) i 50 ml vaskebuffer (se tabell 1).
- Sentrifuger oppløsningen ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C og fjern supernatanten helt. På dette punktet, må du utføre følgende trinn i mørket, for å unngå pigment oksidasjon. Legg til ~ 20 ml av 80% aceton bufret med Na 2 CO 3 (se tabell 1) for å trekke ut de pigmenter. La oppløsningen på is i 10 min, virvling og til.
- Pellet cellulære komponenter ved sentrifugering ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
MERK: Hvis pigmentene ikke er helt trukket ut, vil pelleten har en grønn farge og trinn 1.6 bør gjentas. - Samle supernatanten til en skilletrakt. Legg 0,4 volumer av dietyleter, rist kraftig og åpne ventilen for å ventilere gassen.
- Legg 0,8 volumer av 0,33 M NaCl og blandes kraftig. Tillat ~ 10 min for lagene å skille. Eterfasen på toppen inneholder de ekstraherte pigmenter. Fjern den klare lavere fase.
MERK: Hvis separasjon er ikke klart, fryse og tine løsningen for å forbedre faseseparasjon. - Fjern eter ved å helle den fra toppen av skilletrakten i en egnet glassbeholder. Tørr ved å legge en skje med granmeringen vannfritt natriumsulfat. Virvle løsningen og la ~ 5 min for tørkemiddel til å absorbere vann fra eter.
MERK: Gjenta dette trinnet hvis natriumsulfatet vises helt klumpet seg sammen; det bør være noen frittflytende krystaller når eteren er tilstrekkelig tørket. Hvis et vannlag former, fjerne dette med en Pasteur-pipette før tilsetning av ytterligere vannfritt natriumsulfat. - Dekanter eter til en ny glassbeholder, slik at den faste bak natriumsulfat.
- Fordamp eter i en roterende speedvac eller under en strøm av N2.
- Oppløs pigmentene helt i 10 ml av 100% aceton.
- Fortynn en liten mengde (~ 3 mL) i 1 ml av 80% aceton og måle absorpsjonsspektra og bestemme Chl a / b-forhold og den Chl konsentrasjon med metoden beskrevet av Porra et al. (1989) 15.
- Delmengde og tørk pigmenter i en roterende speedvac eller mindre enn N 2 strømmen til aceton erfullstendig fordampet. Oppbevar de tørkede pigmenter ved -80 ° C.
2. Uttak av Karotenoider fra Spinat
- Følg trinn 1.1 til 1.5. På dette punktet, må du utføre følgende trinn i mørket, for å unngå pigment oksidasjon.
- Resuspender pelleten thylakoid i ~ 50 ml 96% etanol bufret med Na 2 CO 3 (se tabell 1) for å trekke ut de pigmenter. La oppløsningen på is i 5 min.
- Pellet cellulære komponenter ved sentrifugering ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
MERK: Hvis pigmentene ikke er helt trukket ut, vil pelleten har en grønn farge og trinn 2.2 bør gjentas. - Samle supernatanten og tilsett 0,1 volum av 80% KOH (w / v) for å initiere forsåpning.
- La oppløsningen ved 4 ° CO / N, tett forseglet og beskyttet fra lys.
- Samle løsningen i en skilletrakt. Tilsett 1 volum dietyleter og bland forsiktig.
- Legg 0.8 volvolumer av 0,33 M NaCl og bland forsiktig. Tillat ~ 10 min for lagene å skille. Den oransje eter fase på toppen inneholder forsåpnings karotenoider. Fjern den grønne nedre fase ved å drenere gjennom stengeventilen av trakten.
- Tilsett 3 volumdeler vann og blandes forsiktig for å fjerne kaliumhydroksyd. Tillate lagene å skille. MERK: Hvis det øverste fasen er uklar, det legger en liten mengde NaCl (f.eks 3 g NaCl i 200 ml oppløsning) og virvle forsiktig for å løse.
- Fjern den nedre fase ved å drenere gjennom stengeventilen av trakten.
- Følg trinn 01.10 til 01.13.
- Fortynn en liten mengde (~ 3 mL) i 1 ml av 80% aceton og måle absorpsjonen spektra ved 440 nm i 80% aceton. Å bestemme konsentrasjonen, bruker den gjennomsnittlige koeffisient utryddelse for karotenoider (ε 440 = 255) 16 i følgende formel: Bil [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (optisk bane) = 1 cm.
- Delmengde og tørk carotenoiDS i en speedvac eller yngre N 2 stream til all dietyleter er fordampet. Oppbevar de tørkede pigmenter ved -80 ° C.
3. Totalt Pigment og Karotenoidekstraksjon fra Chlamydomonas reinhardtii
- Grow C. reinhardtii på solid TAP medium 17 i en petriskål ved å spre en liten mengde væskekultur på overflaten. Vokse under kontinuerlig belysning flux på 20 mikromol bilder PSA m -2 sek -1 til en grønn lag av celler er synlig.
- Ved hjelp av en steril sløyfe inokulering, høste en liten mengde av C. reinhardtii fra solid TAP medium og sette cellene i 500 ml TAP medium 17 i en 1 L kolbe. Dyrk kulturen ved 25 ° C med 170 rpm omrøring under en kontinuerlig belysning fluks av 20 pmol bilder PSA m sek -2 -1.
- Etter 5-6 dager, bør kulturen når slutten av den logaritmiske fase (6 x 10 6 celler / ml2-2,5 eller optisk tetthet ved 750 nm). Sentrifuger kulturen ved 4000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- For total pigment utvinning, følger du trinn 01.06 til 01.15.
- Utbyttet av totalt pigment ekstrakt som starter fra 500 ml kultur i full vekst C. reinhardtii er rundt 5 ml løsning med en konsentrasjon på 0,5 mg CHL a + b / ml.
- For karotenoider utvinning, følger du trinn 02.02 til 02.12.
4. Rensing av inklusjonslegemer
- Klon den kodende sekvens av LHC protein av interesse inn i en ekspresjonsvektor som resulterer i et smeltet C-terminal His-koden ved bruk av standard molekylærbiologiske prosedyrer. Forvandle denne konstruksjonen i E. coli vertsstammen som BL21 (DE3).
- Forbered Lysis buffer, vaskemiddel-buffer, Triton buffer, DE (tabell 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) og LB-medium 18 med de riktige antibiotika.
- Plukk en single E. coli-koloni som inneholder det uttrykk klon fra et ferskt stripete platen i ~ 5 ml LB-medium med de riktige antibiotika ved hjelp av standard prosedyrer 6. Vokse ved 37 ° C med 220 rpm omrøring i minst 16 timer.
- Legg 2,5 ml av O / N kultur i en 1 L Erlenmeyer-kolbe med 250 ml LB supplert med egnede antibiotika.
- Dyrke cellene i 2-3 timer (eller inntil OD 600 er ~ 0,6) ved 37 ° C ved 220 rpm.
- Legg IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Fortsett å dyrke cellene ved 37 ° C med 220 rpm i 3-4 timer.
- Sentrifuger kulturen i 10 min ved 5000 x g ved 4 ° C i en pre-veid sentrifugerør. Kast supernatanten grundig og bestemme vekten pelleten ved å veie igjen og trekke sentrifugerør vekt.
- Resuspender E. coli cellepelleten i 0,8 ml / g av Lysis-buffer ved kraftig virvling.
MERK: Alternativt kan cellepelleten fryses ved -80C for senere bruk. Hvis du starter med en frossen pellet, la den tine helt før du legger lysis buffer. - Tilsett 2 mg lysozym per gram celler, og inkuberes på våt is med leilighetsvis risting i 30 min.
- Tilsett 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 mikrogram / ml RNAse. Vortex og satt på is i 30 min.
- Tilsett 2 dl kaldt vaskemiddel buffer per gram av celler. Bland godt og holde RT i 5 min.
- Overføring til 2 ml sentrifugerør (delt inn i to rør om nødvendig). Sentrifuger i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C for å pelletere de inklusjonslegemer.
- Tilsett 1 ml kald buffer og Triton resuspendere pelleten ved lydbehandling (3 pulser x 5 sek x 50% kraft med 20 sek intervaller). MERK: Ha røret i et lite beger omgitt av isvann for å holde det kaldt om lydbehandling. I tilfelle av flere rør, kombiner de resuspenderte inklusjonslegemer i ett rør etter resuspendering.
- Sentrifuger i 10 min ved 12 000xg ved 4 ° C for å pelletere de inklusjonslegemer.
- Gjenta trinn 4.13 og 4.14 to ganger.
- Resuspender inklusjonslegemer i 1 ml kald TE med lydbehandling for en endelig vask for å fjerne Triton buffer. Sentrifuger i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C for å pelletere de inklusjonslegemer.
- Resuspender pellet i 1 ml kald TE etter lydbehandling.
- Utrede proteinkonsentrasjonen ved hjelp av standardmetoder som for eksempel Bradford assay 19. Oppbevar porsjoner av inklusjonslegemer ved -20 ° C.
5. Rekonstituering
Denne protokollen gir typisk 1-2 ml rekonstituert protein med en OD på 4 når absorbans måles i Qy regionen (600-750 nm). Mengden kan justeres som ønsket, selv om forsiktighet må utvises for å opprettholde de riktige forholdstall under prosedyren.
- Forbered følgende løsninger som er beskrevet i Tabell 1: 2x rekonstitusjonsbuffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Utfør følgende sTeps i svakt lys.
- Resuspender 800 ug LHC inklusjonslegemer i en total av 400 ul TE i en 2 ml mikro-sentrifugerør. Tilsett 400 mL av 2x rekonstitusjonsbuffer og virvle kort.
- Tilsett 0,6 mL av β-merkaptoetanol (lager 14.8 M) for å få en sluttkonsentrasjon på 10 mM. Varm protein i 1 min ved 98 ° C. Vortex kort og sted ved RT i 3 min.
- Resuspender 500 mikrogram av totalt tørket klorofyllpigmenter pluss 80 pg karotenoid-pigmenter i 30 pl 100% EtOH ved kraftig virvling i 1 minutt eller i stedet i et bad sonikator i 1-2 min.
- Snurr pigment mix ~ 30 sek på 15 800 xg ved 4 ° C og bekrefter at det er ingen pellet. Hvis det er en pellet, gjentar vortexblanding og / eller lydbehandling. VIKTIG: Etter resuspensjon og spinn, umiddelbart legge pigment til protein, eller det kan samle og må resuspenderes igjen.
- Tilsett langsomt pigmentet blanding til den avkjølte protein mens virvling. Fortsett til vortex 5-10 sec og plasser røret på våt is. Vær forsiktig så du ikke vortex altfor kraftig da proteinet kan renne over toppen av røret.
- Legg 94 mL av 20% Octyl β-D-glukopyranosid (OG) (endelig konsentrasjon 2%), vortex kort og holde på is i 10 min.
- Legg 90 pl av 2 M KCl (sluttkonsentrasjon 150 til 200 mM), vortex kort og holde på is i 20 min. MERK: kolonne forberedelse (§ 6) kan initieres på dette tidspunktet.
- Spin 10 min ved 15 800 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten (utfelt LDS) til et 10 ml rør. Hold kaldt og beskyttet mot lys.
6. Nickel Column Rensing
- Forbered følgende løsninger som beskrevet i Tabell 1: OG-buffer, OG skyllebuffer, elueringsbuffer.
- Koble en Ni-Sepharose-kolonne (1 ml) eller tilsvarende til en peristaltisk pumpe som sikrer at ingen luft kommer inn i kolonnen i løpet av dette trinn, og de følgende trinn.
- Hastigheten på than pumpe til 1 ml / min, og skylle kolonnen med 5 til 10 ml vann for å fjerne lagringsløsning.
- Ekvilibrere kolonnen med 3-4 ml av OG-buffer.
- Legg 3-4 ml av OG-buffer til proteinet prøven og lasten til kolonnen. MERK: hvis proteinet har blitt sittende på is i mer enn 10 min etter fjerning av LDS, spinne igjen ved 15.800 x g ved 4 ° C i 1 min for å fjerne eventuelle ytterligere LDS utfelling.
- Vask kolonnen med 5 ml av OG-buffer.
- Vask kolonnen med 2 ml av OG skyllebuffer.
- Eluer bundet protein med 3 ml elueringsbuffer. Samle det grønne Elute som inneholder rekonstituerte protein. MERK: Dette er vanligvis ca 1 ml totalt.
7. Sukrose gradientsentrifugering
- Forbered følgende løsninger som beskrevet i Tabell 1: Sukrose løsning, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.
- Fyll ultrasentrifuge-rør med sukroseløsning og fryse på -20 ° CO / N or -80 ° C i minst 1 time.
- Fjern røret fra fryseren og tines for å tillate uforstyrret ved 4 ° C. MERK: fryse / tine prosessen skaper en gradient 0,1 til 1 M sukrose. En 15 ml tube typisk tiner i ca 3 timer.
- Forsiktig fjernes fra toppen samme volum som den grønne fraksjonen eluert fra nikkel Sepharose-kolonnen i trinn 6.8. Deretter legger den rekonstituerte prøven på toppen sakte for å unngå å forstyrre graderingen.
- Balanse rør og spinn på 200.000 xg ved 4 ° C i en ultrasentrifuge ved hjelp av en SW-41 eller SW-60 svingende bøtte rotor 18 timer, satt til å bremse akselerasjon og stopp uten bremser.
- Forsiktig ta ut gradient fra røret holder med tang. Bruke en sprøyte med en lang nål som har en stump åpning for å samle fraksjonen fra toppen. MERK: Alternativt, samler fraksjoner fra bunnen ved gjennomhulling av røret med en nål og samle dråper.
Representative Results
Denne protokollen detaljer en metode for å rekonstituere chorophyll a / b bindingsproteiner in vitro. Denne teknikken tillater folding av disse pigment-proteinkomplekser in vitro med start fra den apoprotein, som kan fås ved overekspresjon i et heterologt system, og pigmenter utvunnet fra planter eller alger. Etter rekonstituering refolded pigment-proteinkompleks renset fra overskudd av pigmenter, og den utbrettede apoprotein i to trinn. Det første trinnet (figur 1 AB) er basert på tilstedeværelsen av His-tag ved C-terminalen av proteinet, noe som tillater fjerning av en stor del av de ikke-bundne pigmenter. Den andre rensetrinn benytter sukrose-densitets-gradient sentrifugering (figur 2), hvor den utbrettede proteinet migrerer som regel langsommere enn det grønne båndet inneholdende det rekonstituerte protein. Målet for rekonstitusjon in vitro er å oppnå komplekser med samme riktigbånd som de innfødte seg. For å illustrere dette utfallet, er de spektroskopiske egenskapene til en in vivo lys-høsting kompleks sammenlignet med samme LHC kompleks rekonstituert in vitro 13,20,21. Den absorbsjonsspektrum av LHCs i det synlige området (350 nm og 750 nm), avhenger av pigmentsammensetningen av komplekset, så vel som på pigmentet miljø (som inkluderer protein), og det er således et følsomt verktøy for å kontrollere kvaliteten av rekonstitusjon. I figur 3, absorbsjons-spekteret av CP24, en klorofyll a / b-bindende protein fra Arabidopsis thaliana, rekonstituert in vitro, blir sammenlignet med spekteret for det samme komplekset renset fra Arabidopsis thylakoids 21. I spektrene, er det mulig å gjenkjenne Qy og Soret overgangen av Chl a (topper ved 671/439 nm) og Chl b (topper ved 649/466 nm). De innfødte og rekonstituert komplekser viser identisk absorption spektra, som indikerer en nesten identisk pigment sammensetning og organisasjon. Fluorescens spektroskopi kan brukes til å vurdere kvaliteten på den rekonstituerte kompleks. Fluorescens emisjonsspektrene er målt ved eksitasjon ved forskjellige bølgelengder som vekker fortrinnsvis forskjellige pigmenter: Chl a ved 440 nm, b Chl ved 475 nm, og xantofyller ved 500 nm. I en korrekt foldet protein-kompleks pigment, Chl b og xantofyller overfører sin magnetisering energi primært til Chl en i løpet av få picosekunder og fluorescensen stammer fra en termisk ekvilibrert system som resulterer i en enkelt topp med samme form og maksima i det hele tatt tre eksitasjon bølgelengder (Figur 4A-B). Tilstedeværelsen av CHL b ikke koordinert til protein kan bli gjenkjent av en ekstra topp eller skulder rundt 650 nm på 475 nm eksitasjon (figur 4C). Tilstedeværelsen av gratis CHL en i stedet førertil ytterligere utslipp rundt 675 nm, som er i hovedsak til stede ved 440 nm eksitasjon. Fluorescens emisjonsspektrene ved 475 nm eksitasjon av både rekonstituert og native CP24 komplekser (figur 4D) viser en enkelt topp ved 681 nm, noe som indikerer at rekonstituert kompleks er korrekt foldet. En ytterligere bekreftelse på at pigment-protein-komplekset er fullstendig rekonstituert kommer fra sirkulær dikroisme- (CD) målinger. CD-signalet i det synlige området er avhengig av excitonic interaksjoner mellom pigmenter, og det er derfor meget følsom for selv små forandringer i organiseringen av kromoforer 22. Figur 5 viser CD-spektra av rekonstituert og native CP24, med de typiske topper på fingeravtrykk 681 nm, 650 nm og 481 nm. konklusjon, den høye likheten mellom de spektroskopiske egenskapene innfødte og det rekonstituerte CP24 bekrefter at omdanningsprosedyren rentene innfødt-lignende komplekser suita gjengelig for in vitro-studie av lys-høsting proteiner.
Figur 1. Representasjon av rensing av rekombinante LHC proteiner med en Hans tag bruke en nikkel kolonne. (A) Under rensing, Hans-tagget protein, som består av både rekonstituert komplekser (grønn sekskant) og un-rekonstituert / aggregert protein (oransje sekskant) er bundet til overflaten av Ni-Sepharose (blå flekk), mens ubundet pigment (små fargede flekker) strømme gjennom. (B) Når kolonnen er vasket med elueringsbuffer inneholdende imidazol, blir rekonstituert og un-rekonstituert proteiner samles i strømnings gjennom.
hres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Sukrose gradient av rekonstituert LHCII etter rensing ved kolonnekromatografi nikkel. Rekonstituerte kompleksene blir separert fra den frie pigment ved densitetsgradient. Den mørke grønne båndet representerer rekonstituert LHCII og blek grønn bakgrunn er sammensatt av frie pigmenter.
Figur 3. Absorpsjon spektra av rekonstituerte protein CP24 (rCP24, rød linje) og den opprinnelige ene (nCP24, sort linje) isolert fra Arabidopsis thaliana. På begge spektra, er det mulig å gjenkjenne Qy og Soret overgangen av Chl a (topper på 671/439 nm) og CHL b (topper på 649/466 nm). Dette tallet er blitt modifisert fra Passarini et al. 2014 21.
Figur 4. Fluorescens emisjonsspektra. Fluorescens emisjonsspektra av rekonstituert CP24 villtype-komplekset (A) og normalisert til den maksimale (B) viser effektiv energioverføring fra Chl b og Xanthophyls til Chl a. (C) fluorescensemisjon spektra av rekonstituert CP24 (rCP24) og den innfødte kompleks (nCP24) isolert fra Arabidopsis thaliana. Spektrene er normalisert til det maksimale av toppen (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Rundskriv dikroisme- Spectra. Rekonstituert CP24 (rCP24, rød linje) og den innfødte kompleks (nCP24, sort linje) isolert fra Arabidopsis thaliana viser svært lik spektra.
Figur 6. Absorpsjon spektra av CP29 villtype (CP29_WT) og mutert CP29 (CP29_A2). Den grønne linjen viser forskjellene mellom de to tomter.
| Alle bufferne kan lagres ved 4 ° C. | ||||||
| Komponenter | Endelig konsentrasjon | Flere merknader | ||||
| Sliping Buffer | Sorbitol | 0,4 M | ||||
| Tricine | 0,1 M | pH 7.8 | ||||
| NaCl | 10 mm | |||||
| MgCl2 | 5 mm | |||||
| Milk Powder | 0,5% w / v | |||||
| Wash Buffer | Sorbitol | 50 mm | ||||
| 5 mm | pH 7.8 | |||||
| EDTA | 10 mm | pH 8 | ||||
| Lysis Buffer | Tris | 50 mm | pH 8 | |||
| Sukrose | 2,5% w / v | |||||
| EDTA | 1 mm | pH 8 | ||||
| Vaskemiddel buffer | NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| Deoxycholic syre | 1% w / v | |||||
| 1% w / v | ||||||
| Tris | 20 mm | pH 7.5 | ||||
| EDTA | 2 mm | pH 8 | ||||
| beta-mercaptoethanol | 10 mm | |||||
| Triton Buffer | Triton X-100 | 0,5% w / v | ||||
| Tris | 20 mm | pH 7.5 | ||||
| beta-mercaptoethanol | 1 mm | |||||
| Buffer TE | Tris | 50 mm | pH 8 | |||
| EDTA | 1 mm | pH 8 | ||||
| Rekonstitusjonsbuffer | HEPES | 200 mm | ||||
| Sukrose | 5% w / v | |||||
| Lithiumdodecylsulfate (LDS) | 4% w / v | |||||
| Benzamidine | 2 mm | |||||
| Aminokapronsyre | 10 mm | |||||
| OG Buffer | Octylglukosid | 1% w / v | ||||
| 12,5% w / v | ||||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| HEPES | 20 mm | |||||
| Imidazol | 10 mm | |||||
| OG Skyll Buffer | n-Dodecyl-beta-D-Maltoside (β-DM) | 0,06% w / v | ||||
| HEPES | 40 mm | pH 7,5 til 9 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Elueringsbuffer | Imidazol | 0,5 M | ||||
| 0,06% w / v | ||||||
| HEPES | 40 mm | pH 8 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Sukroseløsning | Sukrose | 20% w / v | ||||
| n-Dodecyl-beta-D-Maltoside (β-DM) | 0,06% w / v | |||||
| HEPES | 0,01 M | pH 7.6 | ||||
| Aceton 80% bufret med natriumkarbonat | Aceton | 80% v / v | Natriumkarbonat | 1 M | ||
| Etanol 96% bufret med natriumkarbonat | Etanol | 96% v / v | ||||
| Natriumkarbonat | 1 M | |||||
Tabell 1. Liste over buffere og løsninger som brukes i denne protokollen.
| Chla a / b mix | Chla | CHL en | CHL b | Neo | Viola | Lute | CHL tot | CHL / Bil | |
| nCP26 | - | 2.2 ± 0.05 | 6.2 | 2.8 | 0,61 | 0,38 | 1.02 | 9 | 4.5 ± 0.1 |
| rCP26 | 8 | 2.71 ± 0.05 | 6.57 | 2.43 | 0,72 | 0,32 | 0.97 | "> 93.9 ± 0.04 | |
| rCP26 | 5.5 | 2.25 ± 0.05 | 6.23 | 2.77 | 0.77 | 0.3 | 0.96 | 9 | 4.0 ± 0.1 |
| rCP26 | 3 | 2.08 ± 0.04 | 6.08 | 2.92 | 0,76 | 0.3 | 1.04 | 9 | 4.1 ± 0.1 |
| rCP26 | 1 | 1.7 ± 0.05 | 5.7 | 3.3 | 0.7 | 0.3 | 0.9 | 9 | 4.3 ± 0.05 |
| rCP26 | 0.3 | 1.11 ± 0.04 | 4.7 | 4.28 | 0.7 | 0.3 | 0.9 | 9 | 4.2 ± 0.2 |
| 0,05 | 0,23 ± 0,01 | 1.4 | 5.6 | 0.58 | 0,24 | 1.11 | 7 | 3.1 ± 0.06 | |
| rCP26 | <0.01 | 0,11 ± 0,01 | 0.7 | 0.64 | 0.3 | 1.08 | 7 | 3.06 ± 0.06 |
Tabell 2. pigmentinnhold av CP26 innfødte kompleks i forhold til rekonstituert protein-pigment komplekser med forskjellige CHL a / b prosenter 39.
Discussion
Membran proteiner er ikke så lett å studere. Isolering av innfødte membranproteiner er komplisert ved behovet for å oppløse lipidet bilaget med vaskemidler, som kan skade proteinet og fjerne nødvendige kofaktorer. Disse proteiner kan også være til stede i lave nivåer i biologiske membraner, eller blandes med nært beslektede proteiner, som i tilfelle av de lette høsting komplekser, som gjør rensing av enkelt-komplekser vanskelige. Heterologt protein ekspresjon i E. coli og in vitro rekonstituering gir mulighet for å unngå disse problemene. In vitro rekonstituering og rensing av foldede proteiner resulterer i komplekser som har egenskaper som var svært like de av de innfødte komplekser 20,21,23 og dermed kan brukes til å studere komplekser som ikke kan renses til homogenitet 24 - 27.
Denne metoden benytter spinat, som er lett attainable året rundt, som en kilde for den totale pigment og karotenoid-preparater. For noen reconstitutions proteiner innfødte for alger, er bruken av pigmenter renset fra alger foretrukket på grunn av forskjellige pigmentblandinger. Den Chl a / b-forhold og CHL / bil forholdet forblir den samme uavhengig av pigment kilde.
Det er viktig å være klar over at effektiviteten av rekonstituering er vanligvis rundt 35% 28. Således er det nødvendig å fjerne de ikke-bundne pigmenter og utbrettet apoprotein fra oppløsningen etter rekonstituering. En to-trinns rensing protokollen er presentert i denne protokollen (se også resultater). Imidlertid bør det bemerkes at sukrosegradient trinnet ikke tillater fullstendig atskillelse av Apo og holo-protein. For de fleste analyser er dette ikke et problem, som apoprotein ikke inneholder pigmenter, og dermed ikke forstyrre de funksjonelle målingene. Imidlertid, i tilfelle det er nødvendig å fullstendig fjerne apoprotein fra frhandling inneholdende rekonstituert kompleks (for eksempel for å beregne pigment til protein støkiometri), kan en anionisk bytterkolonne benyttes (se Passarini et al. 2009 29 for detaljer).
Kapasiteten til rekombinante refold lette høsting proteiner med isolerte pigmenter in vitro gir en mulighet til å "manipulere" kompleksene ved å endre rekonstituering "miljø" på ulike måter, for derved å endre egenskapene av det resulterende kompleks. For eksempel kan endre pigmentsammensetningen under rekonstitusjonen resultere i et kompleks med endret pigmentsammensetning. Denne funksjonen kan bli anvendt for å studere innflytelsen forskjellige pigmenter har på strukturen og stabiliteten av komplekset. Vanligvis pigmentet preparat oppnådd fra spinat har et Chl a / b-forhold på 3: 1 og en Chl / car-forhold på 2,9: 1. Dette forholdet gir vanligvis en rekonstituerte protein med samme egenskaper som den nAtive en. Imidlertid kan justeringen av Chl a / b-forhold ved tilsetning av renset Chl a eller b påvirke bindingen av forskjellige pigmenter på grunn av varierende selektivitet av bindingsstedene 30-33. Dette er mulig fordi de fleste av pigment bindingssteder er ikke helt selektiv for CHL en eller CHL b, men har plass til begge, men med forskjellig affinitet 10,30,34. På en lignende måte ble de karotenoide bindingssteder også vist å være i stand til å romme mer enn en xanthophyll arter 8,35 - 38. Forskjellige reconstitutions av CP26, et annet pigment-proteinkompleks av høyere planter, ved hjelp av forskjellige pigment sammensetninger er vist i tabell 2. 39. Reconstitutions Disse ble brukt til å vurdere affiniteten til bindingssteder for bestemte pigmenter 39. Det er interessant å merke seg at for å få et kompleks med samme pigment cSAMMENSETNING som native en må Chl a / b-forhold av pigment blanding være 3: 1. Dette synes å være tilfelle for alle LHC komplekser av høyere planter 20,40.
Kombinasjonen av molekylærbiologi med rekonstituering teknikken gir egenskapene for et Chl-bindende kompleks som skal utredes nærmere. Betydningen av ulike protein domener på stabilitet og folding av kompleksene, eller deres engasjement i protein-protein interaksjoner, er fastsatt av avkorting apoprotein eller utføre tilfeldig mutagenese 8,41 - 44. Enkeltaminosyrerester som er viktige for koordinering av forskjellige pigmenter kan bli endret ved sete-rettet mutagenese for å analysere egenskapene til de enkelte pigmenter eller vurdere deres bidrag til funksjonen og stabiliteten av komplekset 10,28,29,45 - 52. Figur 6 viser rekonstituert Lhcb4 (CP29) meden mutasjon av histidin i posisjon 216 53. En sammenligning av pigmentsammensetningen av villtype og mutante komplekser viser at mutasjoner forårsaker tap av en Chl et molekyl, som indikerer at det målsøkte setet kan tilpasses en Chl a i WT-komplekset. Forskjellen i absorpsjon spektra av WT og mutant, ved normalisering til pigmentinnhold, viser også de absorpsjons egenskapene til den tapte pigment. I dette tilfellet, kan forskjellen bli sett i hoved topp på 680 nm, noe som indikerer at CHL en koordinert av His216 absorberer på dette bølgelengde (for mer informasjon om dette mutant og spektroskopiske egenskaper se Mozzo et al. 2008 53). Kan også brukes Mutation analyse for å bestemme effekten av miljøet på de spektroskopiske egenskaper av pigmentene 54.
Som konklusjon kan lette høsting proteiner lett rekonstitueres in vitro som fører til pigment-Proteinkonn komplekser med svært like egenskaper som innfødte komplekser. På denne måten, er vanskelighetene med å isolere innfødte proteiner eliminert, samtidig levere protein forberedelse med høy kapasitet og renhet for videre studier. Betydningen av en 3: 1 Chl a / b-forhold på å produsere en autentisk komplekset er understreket, og eksempler på rekonstituert villtype og mutante LHCs er gitt for å illustrere anvendelser av teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Nylon cloth | 20 μm pores | ||
| Soft artists paint brush | |||
| NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
| Beta-DM | Sigma | D4641 | |
| DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
| Milk Powders | |||
| RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
| Sonicator | |||
| Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
| Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
| TAP medium | see reference 17 | ||
| LB medium | see reference 19 |
References
- Plumley, F. G., Schmidt, G. W. Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting complexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 146-150 (1987).
- Croce, R., van Amerongen, H. Light-harvesting and structural organization of Photosystem II from individual complexes to thylakoid membrane. Journal of photochemistry and photobiology B Biology. 104 (1-2), 142-153 (2011).
- Li, Z., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and responding to excess light. Annual review of plant biology. 60, 239-260 (2009).
- De Bianchi, S., Ballottari, M., Dall’osto, L., Bassi, R. Regulation of plant light harvesting by thermal dissipation of excess energy. Biochemical Society transactions. 38 (2), 651-660 (2010).
- Neilson, J. A. D., Durnford, D. G. Structural and functional diversification of the light-harvesting complexes in photosynthetic eukaryotes. Photosynthesis research. 106 (1-2), 57-71 (2010).
- Paulsen, H., Rümler, U., Rüdiger, W. Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta. 181 (2), 204-211 (1990).
- Horn, R., Grundmann, G., Paulsen, H. Consecutive binding of chlorophylls a and b during the assembly in vitro of light-harvesting chlorophyll-a/b protein (LHCIIb). Journal of molecular biology. 366 (3), 1045-1054 (2007).
- Cammarata, K. V., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of a light-harvesting gene product: deletion mutagenesis and analyses of pigment binding. Biochemistry. 31 (10), 2779-2789 (1992).
- Paulsen, H., Hobe, S. Pigment-binding properties of mutant light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 205 (1), 71-76 (1992).
- Bassi, R., Croce, R., Cugini, D., Sandonà, D. Mutational analysis of a higher plant antenna protein provides identification of chromophores bound into multiple sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (18), 10056-10061 (1999).
- Paulsen, H., Finkenzeller, B., Kühlein, N. Pigments induce folding of light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 215 (3), 809-816 (1993).
- Caffarri, S., Croce, R., Cattivelli, L., Bassi, R. A look within LHCII differential analysis of the Lhcb1-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis. Biochemistry. 43 (29), 9467-9476 (2004).
- Giuffra, E., Cugini, D., Croce, R., Bassi, R. Reconstitution and pigment-binding properties of recombinant CP29. European journal of biochemistry / FEBS. 238 (1), 112-120 (1996).
- Rogl, H., Kosemund, K., Kühlbrandt, W., Collinson, I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBS letters. (1-2), 21-26 (1998).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
- Davies, B. H. Identification of carotenoids by their absorption characteristics. Biochem J. 103 (2), (1967).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wientjes, E., Croce, R. The light-harvesting complexes of higher-plant Photosystem I Lhca1/4 and Lhca2/3 form two red-emitting heterodimers. The Biochemical journal. 433 (3), 477-485 (2011).
- Passarini, F., Xu, P., Caffarri, S., Hille, J., Croce, R. Towards in vivo mutation analysis knock-out of specific chlorophylls bound to the light-harvesting complexes of Arabidopsis thaliana - the case of CP24 (Lhcb6). Biochimica et biophysica acta. , (2014).
- Georgakopoulou, S., van der Zwan, G., Bassi, R., van Grondelle, R., van Amerongen, H., Croce, R. Understanding the changes in the circular dichroism of light harvesting complex II upon varying its pigment composition and organization. Biochemistry. 46 (16), 4745-4754 (2007).
- Croce, R., Müller, M. G., Caffarri, S., Bassi, R., Holzwarth, A. R. Energy transfer pathways in the minor antenna complex CP29 of photosystem II a femtosecond study of carotenoid to chlorophyll transfer on mutant and WT complexes. Biophysical journal. 84 (4), 2517-2532 (2003).
- Schmid, V. H., Cammarata, K. V., Bruns, B. U., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730 heterodimerization is required for antenna pigment organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (14), 7667-7672 (1997).
- Castelletti, S., Morosinotto, T., Robert, B., Caffarri, S., Bassi, R., Croce, R. Recombinant Lhca2 and Lhca3 subunits of the photosystem I antenna system. Biochemistry. 42 (14), 4226-4234 (2003).
- Storf, S., Jansson, S., Schmid, V. H. R. Pigment binding, fluorescence properties, and oligomerization behavior of Lhca5, a novel light-harvesting protein. The Journal of biological chemistry. 280 (7), 5163-5168 (2005).
- Mozzo, M., Mantelli, M., Passarini, F., Caffarri, S., Croce, R., Bassi, R. Functional analysis of photosystem I light-harvesting complexes (Lhca) gene products of Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et biophysica acta. 1797 (2), 212-221 (2010).
- Remelli, R., Varotto, C., Sandonà, D., Croce, R., Bassi, R. Chlorophyll binding to monomeric light-harvesting complex. A mutation analysis of chromophore-binding residues. The Journal of biological chemistry. 274 (47), 33510-33521 (1999).
- Passarini, F., Wientjes, E., Hienerwadel, R., Croce, R. Molecular basis of light harvesting and photoprotection in CP24 unique features of the most recent antenna complex. The Journal of biological chemistry. 284 (43), 29536-29546 (2009).
- Giuffra, E., et al. Analysis of some optical properties of a native and reconstituted photosystem II antenna complex, CP29 pigment binding sites can be occupied by chlorophyll a or chlorophyll b and determine spectral forms. Biochemistry. 36 (42), 12984-12993 (1997).
- Pagano, A., Cinque, G., Bassi, R. In vitro reconstitution of the recombinant photosystem II light-harvesting complex CP24 and its spectroscopic characterization. The Journal of biological chemistry. 273 (27), 17154-17165 (1998).
- Kleima, F. J., et al. Decreasing the chlorophyll a/b ratio in reconstituted LHCII structural and functional consequences. Biochemistry. 38 (20), 6587-6596 (1999).
- Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et biophysica acta. 1556 (1), 29-40 (2002).
- Hobe, S., Trostmann, I., Raunser, S., Paulsen, H. Assembly of the major light-harvesting chlorophyll-a/b complex Thermodynamics and kinetics of neoxanthin binding. The Journal of biological chemistry. 281 (35), 25156-25166 (2006).
- Croce, R., Weiss, S., Bassi, R. Carotenoid-binding sites of the major light-harvesting complex II of higher plants. The Journal of biological chemistry. 274 (42), 29613-29623 (1999).
- Hobe, S., Niemeier, H., Bender, A., Paulsen, H. Carotenoid binding sites in LHCIIb. Relative affinities towards major xanthophylls of higher plants. European journal of biochemistry / FEBS. 267 (2), 616-624 (2000).
- Jahns, P., Depka, B., Trebst, A. Xanthophyll cycle mutants from Chlamydomonas reinhardtii indicate a role for zeaxanthin in the D1 protein turnover. Plant Physiology and Biochemistry. 38 (5), 371-376 (2000).
- Wehner, A., Grasses, T., Jahns, P. De-epoxidation of violaxanthin in the minor antenna proteins of photosystemII, LHCB4, LHCB5, and LHCB6. The Journal of biological chemistry. 281 (31), 21924-21933 (2006).
- Croce, R., Canino, G., Ros, F., Bassi, R. Chromophore organization in the higher-plant photosystem II antenna protein CP26. Biochemistry. 41 (23), 7334-7343 (2002).
- Caffarri, S., Passarini, F., Bassi, R., Croce, R. A specific binding site for neoxanthin in the monomeric antenna proteins CP26 and CP29 of Photosystem II. FEBS letters. 581 (24), 4704-4710 (2007).
- Hobe, S., Förster, R., Klingler, J., Paulsen, H. N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex. Biochemistry. 34 (32), 10224-10228 (1995).
- Kuttkat, A., Hartmann, A., Hobe, S., Paulsen, H. The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex. European journal of biochemistry / FEBS. 242 (2), 288-292 (1996).
- Rupprecht, J., Paulsen, H., Schmid, V. H. Protein domains required for formation of stable monomeric Lhca1- and Lhca4-complexes. Photosynthesis research. 63 (3), 217-224 (2000).
- Yang, C., et al. The negatively charged amino acids in the lumenal loop influence the pigment binding and conformation of the major light-harvesting chlorophyll a/b complex of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (11), 1463-1470 (2008).
- Rogl, H., Kühlbrandt, W. Mutant trimers of light-harvesting complex II exhibit altered pigment content and spectroscopic features. Biochemistry. 38 (49), 16214-16222 (1999).
- Yang, C., Kosemund, K., Cornet, C., Paulsen, H. Exchange of pigment-binding amino acids in light-harvesting chlorophyll a/b protein. Biochemistry. 38 (49), 16205-16213 (1999).
- Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. Mutation analysis of Lhca1 antenna complex. Low energy absorption forms originate from pigment-pigment interactions. The Journal of biological chemistry. 277 (39), 36253-36261 (2002).
- Morosinotto, T., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. The nature of a chlorophyll ligand in Lhca proteins determines the far red fluorescence emission typical of photosystem I. The Journal of biological chemistry. 278 (49), 49223-49229 (2003).
- Ballottari, M., Mozzo, M., Croce, R., Morosinotto, T., Bassi, R. Occupancy and functional architecture of the pigment binding sites of photosystem II antenna complex Lhcb5. The Journal of biological chemistry. 284 (12), 8103-8113 (2009).
- Croce, R., et al. Origin of the 701-nm fluorescence emission of the Lhca2 subunit of higher plant photosystem I. The Journal of biological chemistry. 279 (47), 48543-48549 (2004).
- Morosinotto, T., Mozzo, M., Bassi, R., Croce, R. Pigment-pigment interactions in Lhca4 antenna complex of higher plants photosystem I. The Journal of biological chemistry. 280 (21), 20612-20619 (2005).
- Mozzo, M., Morosinotto, T., Bassi, R., Croce, R. Probing the structure of Lhca3 by mutation analysis. Biochimica et biophysica acta. 1757 (12), 1607-1613 (2006).
- Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., Croce, R. Photoprotection in higher plants the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (10), 1263-1267 (2008).
- Wientjes, E., Roest, G., Croce, R. From red to blue to far-red in Lhca4 how does the protein modulate the spectral properties of the pigments. Biochimica et biophysica acta. 1817 (5), 711-717 (2012).
