Abstract
I växter och grönalger, är ljuset fångas upp av de ljus skörd komplex (LHCs), en familj av integrerade membranproteiner som samordnar klorofyller och karotenoider. In vivo, är dessa proteiner viks med pigment för att bilda komplex som är införda i thylakoid membranet i kloroplasten. Den höga likhet i de kemiska och fysikaliska egenskaperna hos medlemmarna i familjen, tillsammans med det faktum att de lätt kan förlora pigment under isoleringen, gör deras rening i ett naturligt tillstånd utmanande. Ett alternativt tillvägagångssätt för att erhålla homogena beredningar av LHCs utvecklades av Plumley och Schmidt 1987 1, som visade att det var möjligt att rekonstruera dessa komplex in vitro med början från renade pigment och ovikta apoproteiner, vilket resulterar i komplex med egenskaper mycket liknar den för infödda komplex. Detta öppnade vägen för användningen av bakteriella uttryckta rekombinanta proteiner för in vitro- (t.ex. pigmentbindningsställen) eller proteindomän (t.ex. protein-proteininteraktion, vikning). Denna metod har optimerats i flera laboratorier och appliceras på de flesta av de ljus skörd komplex. Protokollet som beskrivs här preciseras metoden för rekonstitution av ljus-skörd komplexen in vitro som för närvarande används i vårt laboratorium, och exempel som beskriver tillämpningar av metoden tillhandahålls.
Introduction
Den fotosyntetiska apparaten i växter och alger ingår integrerade membranproteiner som binder klorofyll a (CHL a), b (chl b) och karotenoider (bil). Dessa pigment-proteinkomplex är aktiva inom skördeljusenergi och överföra denna excitationsenergi till reaktionscentra, där det används för att främja laddningsseparation 2. De är också involverade i regulatoriska återkopplingsmekanismer som skyddar fotosyntetiska apparaten från hög ljusskador 3,4. De lätta skörd komplex (LHCs) är sammansatta av en stor familj av besläktade proteiner i växter och alger 5.
Den homogena rening av varje familjemedlem har komplicerats av de mycket liknande kemiska och fysikaliska egenskaper komplexen. Dessutom reningsförfaranden resulterar ofta i förlust av pigment eller andra potentiella kofaktorer såsom lipider. In vitro rekonstituering reprets en kraftfull metod för att övervinna dessa problem. LHC förknippas med fotosystem II (LHC-II) först rekonstitueras in vitro genom Plumley och Schmidt i 1987 1. Forskarna extraherades avlipidiserade protein och pigment separat från växt kloroplaster, och sedan kombineras den värmedenaturerat protein med pigment i närvaro av litium Dodecyl Sulfate (LDS), följt av tre cykler av frysning och upptining 1. De visade att de spektrala egenskaperna hos de ombildade LHC komplexen var mycket lika komplex som renats från växter. Lättheten att rekonstituera LHC pigment-protein-komplex, sannolikt på grund av någon inneboende självsammansättning funktionen, tillsammans med svårigheten att isolera renade komplexen från organismer, ledde till ett snabbt antagande av metoden av andra forskare. Den beredning av fotosyntetiska proteiner överuttryckt i Escherichia coli (E. coli) uppnåddes genom Paulsen och kollegor 1990 6. I E.coli, överuttryckta membranproteiner är i regel förpackat i inklusionskroppar, vilka anläggningar deras renings. Rekonstitution åstadkommes genom värmedenaturering av de inklusionskroppar innehållande rekombinant protein i närvaro av LDS, följt av tillsats av pigment, vilka initierar proteinveckning. Vikning av LHCII komplexet är en två-stegsprocess: först, är klorofyll a bunden på mindre än 1 min; andra, klorofyll b bunden och stabiliserades under flera minuter 7.
Förutom att ge en inblick i de fällbara dynamik, in vitro-beredning i kombination med riktad mutagenes har tillåtit att identifiera specifika aminosyror som är viktiga för stabiliteten (t.ex. 8,9) eller pigment samordning (t.ex. 10). Manipulering av återveck villkor genom att justera parametrar såsom pigmentsammansättning eller tvättmedel har också identifierat element critical för korrekt vikning, exempelvis kravet på xantofyller för LHCII komplexet (t.ex. 1,11). Dessutom har undersökningen av egenskaperna hos de enskilda pigmenten som är bundna till de komplex som varit möjligt med användning av komplexen rekonstitueras in vivo (t ex 10).
Den metod som beskrivs här börjar med isolering av pigment (klorofyller och karotenoid) från spenat och den gröna algen Chlamydomonas reinhardtii. Uttrycket och rening av LHC protein från E. coli i form av inklusionskroppar därefter detalj, följt av beredning av LHC och efterföljande rening genom Ni-affinitetskolonn. I det slutliga steget, är de rekonstituerade komplexen renades ytterligare genom sackaros-gradientcentrifugering för att avlägsna fria pigment och ovikt apoprotein. Detta protokoll utgör en optimerad förfarande innehåller flera ändringar som har införts av olika laboratorier övertid 1,6,10,12 -14.
Protocol
1 Totalt Pigment Extraktion från spenatblad
- Homogenisera en handfull spenatblad (~ 20 g) i 100 ml kall Grinding buffert (se tabell 1) med hjälp av en mixer för 20 sek.
- Filtrera lösningen genom ett två skikt av nylontyg med en pordiameter av 20 um och centrifugera filtratet vid 1500 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Suspendera pelleten innehåller kloroplaster med en mjuk konstnärer målar pensel i 1 ml kall tvättbuffert (se tabell 1). När pelleten återsuspenderas, tillsätt 50 ml tvättbuffert och centrifugera lösningen vid 10.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och försiktigt suspendera pelleten (tylakoider) i 50 ml tvättbuffert (se tabell 1).
- Centrifugera lösningen vid 10.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten fullständigt. Vid denna punkt, utföra följande steg i mörkret, för att undvika pigment oxidation. Lägg ~ 20 ml 80% aceton buffrad med Na 2 CO 3 (se tabell 1) för att extrahera pigment. Låt lösningen på is i 10 minuter, vortexa då och då.
- Pellets de cellulära komponenterna genom centrifugering vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
OBS: Om pigmenten inte helt utvinns, kommer pelleten har en grön färg och steg 1,6 bör upprepas. - Samla upp supernatanten i en separationstratt. Lägg 0,4 volymer av dietyleter, skaka kraftigt och öppna ventilen för att ventilera gas.
- Lägg 0,8 volymer 0,33 M NaCl och blanda kraftigt. Tillåt ~ 10 min för skikten separera. Eterfasen ovanpå innehåller de extraherade pigment. Ta den klara undre fasen.
OBS: Om separationen är inte klart, frysa och tina lösningen för att förbättra fasseparation. - Avlägsna etern genom att hälla den från toppen av separationstratt in i en lämplig glasbehållare. Torka genom att lägga en sked granular vattenfritt natriumsulfat. Virvla lösningen och låt ~ 5 min för torkmedel för att absorbera vatten från etern.
OBS: Upprepa detta steg om natriumsulfat verkar helt hopklumpade tillsammans; det bör finnas några fritt flytande kristaller när etern är tillräckligt torkas. Om ett vattenskikt former, ta bort detta med en Pasteur-pipett innan tillsats av ytterligare vattenfritt natriumsulfat. - Häll av eter en ny glasbehållare, lämnar natriumsulfat fast bakom.
- Indunsta eter i en roterande speedvac eller under en ström av N2.
- Lös pigmenten fullständigt i 10 ml 100% aceton.
- Späd en liten mängd (~ 3 | j, l) i 1 ml 80% aceton och mät absorptionsspektra och bestämma Chl a / b-förhållandet och Chl koncentrationen med metoden beskriven av Porra et al. (1989) 15.
- Fördela och torka pigmenten i en roterande speedvac eller under N2 ström tills aceton äravdunstas fullständigt. Förvara de torkade pigment vid -80 ° C.
2 Extraktion av karotenoider från Spenat
- Följ steg 1.1 till 1.5. Vid denna punkt, utföra följande steg i mörkret, för att undvika pigment oxidation.
- Resuspendera thylakoid pelleten i ~ 50 ml 96% etanol buffrad med Na 2 CO 3 (se tabell 1) för att extrahera pigment. Låt lösningen på is under 5 min.
- Pellets de cellulära komponenterna genom centrifugering vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
OBS: Om pigmenten inte helt utvinns, kommer pelleten har en grön färg och steg 2,2 bör upprepas. - Samla upp supernatanten och tillsätt 0,1 volymer av 80% KOH (vikt / volym) för att initiera förtvålning.
- Lämna lösningen vid 4 ° CO / N, tätt tillslutna och skyddas från ljus.
- Samla lösningen i en separationstratt. Lägg en volym dietyleter och blanda försiktigt.
- Lägg 0,8 volmerna av 0,33 M NaCl och blanda försiktigt. Tillåt ~ 10 min för skikten separera. Den orangefärgade eterfasen på toppen innehåller den förtvålade karotenoider. Ta den gröna undre fasen genom att dränera genom kranen i tratten.
- Tillsätt 3 volymer vatten och blanda försiktigt för att ta bort kaliumhydroxid. Låt skikten separera. OBS: Om den övre fasen är grumlig, tillsätt en liten mängd NaCl (t.ex. 3 g NaCl i 200 ml lösning) och snurra försiktigt för att lösa.
- Ta bort den nedre fasen genom att dränera genom kranen i tratten.
- Följ steg från 1,10 till 1,13.
- Späd en liten mängd (~ 3 | j, l) i 1 ml 80% aceton och mät absorptionsspektra vid 440 nm i 80% aceton. För att bestämma koncentrationen används den genomsnittliga koefficienten utrotas för karotenoider (ε 440 = 255) 16 i följande formel: Bil [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (optisk väg) = 1 cm.
- Alikvotera och torka carotenoids i en speedvac eller under N2 ström tills allt dietyleter har avdunstat. Förvara de torkade pigment vid -80 ° C.
3 Total Pigment och Karotenoid Extraction från Chlamydomonas reinhardtii
- Väx C. reinhardtii på fast TAP mediet 17 i en petriskål genom att sprida en liten mängd flytande kultur på ytan. Väx under ständig belysning flöde på 20 umol bilder PSA m -2 s -1 tills ett grönt lager av celler är synligt.
- Med en steril inokulering slinga, skörda en liten mängd C. reinhardtii från den fasta TAP-medium och placera cellerna i 500 ml vattenledningsmediet 17 i en 1-liters kolv. Odla kulturen vid 25 ° C med 170 rpm omrörning under en kontinuerlig belysning flöde på 20 mikromol bilder PSA m -2 s -1.
- Efter 5-6 dagar, bör kulturen når slutet av den logaritmiska fas (6 x 10 6 celler / mleller 2-2,5 optisk densitet vid 750 nm). Centrifugera kultur vid 4000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- För total pigment utvinning, följ steg 1,6-1,15.
- Utbytet av totala pigmentextrakt från 500 ml full tillväxt kultur av C. reinhardtii är cirka 5 ml lösning med en koncentration av 0,5 mg chl a + b / ml.
- För karotenoider utvinning, följ steg 2,2-2,12.
4. Rening av inklusionskroppar
- Klona den kodande sekvensen för den LHC proteinet av intresse i en expressionsvektor, som resulterar i en sammansmält C-terminal His-markör med användning av molekylärbiologiska standardförfaranden. Omvandla denna konstruktion till E. coli-värdstam såsom BL21 (DE3).
- Förbered Lysbuffert, Detergent buffert, Triton buffert, TE (Tabell 1), 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och LB-medium 18 med lämpliga antibiotika.
- Välj en single E. coli-koloni innehållande expressions klon från en nyligen streaked plattan i ~ 5 ml LB-medium med lämpliga antibiotika med användning av standardförfaranden 6. Odla vid 37 ° C med 220 rpm omröring under minst 16 tim.
- Lägg 2,5 ml av O / N-kulturen till en 1 L Erlenmeyer-kolv med 250 ml LB kompletterat med lämpligt antibiotikum.
- Odla cellerna under 2-3 h (eller tills OD 600 är ~ 0,6) vid 37 ° C vid 220 rpm.
- Lägg IPTG till en slutkoncentration av 1 mM. Fortsätt att odla cellerna vid 37 ° C med 220 rpm 3-4 tim.
- Centrifugera kultur under 10 min vid 5000 xg vid 4 ° C i en i förväg vägd centrifugrör. Kasta supernatanten noga och bestämma vikten pelleten genom vägning igen och subtrahera centrifugrör vikten.
- Resuspendera E. coli cellpelleten i 0,8 ml / g lysbuffert genom kraftig virvling.
OBS: Alternativt kan cellpelleten frysas vid -80C för senare användning. Om du börjar med en frusen pellet, låt tina helt innan du lägger lysbufferten. - Lägg 2 mg lysozym per gram celler, och inkubera på våt is med tillfällig virvling under 30 minuter.
- Lägg 20 ^ g / ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 | ag / ml RNAs. Vortex och sätta på is i 30 min.
- Tillsätt 2 ml kall Tvättmedels buffert per gram celler. Blanda väl och hålla RT i 5 min.
- Överföring till 2 ml centrifugrör (delas upp i två rör vid behov). Centrifugera i 10 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C för att pelletera inklusionskropparna.
- Tillsätt 1 ml kall Triton buffert och helt suspendera pelleten genom ultraljudsbehandling (3 pulser x 5 sek x 50% effekt med 20 sek intervall). OBS: Har röret i en liten bägare omgiven av isvatten för att hålla det kallt under ultraljudsbehandling. Vid flera rör, kombinera de suspenderade inklusionskroppama i ett rör efter blandning.
- Centrifugera under 10 min vid 12.000xg vid 4 ° C för att pelletera inklusionskropparna.
- Upprepa steg 4.13 och 4.14 två gånger.
- Resuspendera inklusionskroppar i 1 ml kall TE med ultraljudsbehandling för en slutlig tvätt för att avlägsna Triton buffert. Centrifugera i 10 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C för att pelletera inklusionskropparna.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml kall TE efter sonikering.
- Bedöm proteinkoncentrationen genom standardmetoder såsom Bradford-analysen 19. Förvara alikvoter av inklusionskroppar vid -20 ° C.
5. Rekonstitution
Detta protokoll ger normalt 1-2 ml rekonstituerad protein med en OD av 4 när absorbansen mäts i Qy området (600-750 nm). Kvantitet kan justeras efter önskemål, men försiktighet bör vidtas för att upprätthålla rätt förhållanden under förfarandet.
- Bered följande lösningar som beskrivs i tabell 1: 2x rekonstitutionsbuffert, 20% OG, 2 M KCl, TE. Utför följande spakterna i svagt ljus.
- Resuspendera 800 xg LHC inklusionskroppar i sammanlagt 400 | il TE i ett 2 ml mikrofugrör. Tillsätt 400 pl av 2x rekonstitutionsbuffert och skaka snabbt.
- Lägg 0,6 pl av β-merkaptoetanol (lager 14,8 M) för att få en slutlig koncentration av 10 mM. Värm protein för en min vid 98 ° C. Vortexa en kort stund och plats vid RT under 3 min.
- Resuspendera 500 pg av totala torkade klorofyllpigment plus 80 ug karotenoidpigment i 30 pl 100% EtOH genom kraftig virvelbildning i 1 min eller plats i ett badsonikator i 1-2 minuter.
- Snurra pigmentmixen ~ 30 sekunder vid 15.800 xg vid 4 ° C och kontrollera att det inte finns någon pellet. Om det finns en pellet, upprepa virvling och / eller sonikering. VIKTIGT: Efter resuspension och spinn, omedelbart lägga pigment till proteinet, eller det kan aggregera och måste suspenderas på nytt.
- Långsamt pigmentmixen till den kylda protein medan vortexa. Fortsätt att vortex 5-10 sec och placera röret på våt is. Var noga med att inte Vortexa alltför kraftigt eftersom proteinet kan svämma över den övre delen av röret.
- Lägg 94 l av 20% Oktyl β-D-glukopyranosid (OG) (slutkoncentration 2%), skaka snabbt och hålla på is 10 min.
- Lägg 90 l av KCl 2 M (slutkoncentration 150-200 mM), skaka snabbt och hålla på is 20 min. OBS: förberedelse kolonn (§ 6) kan initieras vid denna tidpunkt.
- Spin 10 min vid 15.800 xg vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten (utfälld LDS) till en 10 ml tub. Håll kallt och skyddas från ljus.
6. nickelkolonn Rening
- Bered följande lösningar som beskrivs i tabell 1: OG-buffert, OG sköljbuffert, Elueringsbuffert.
- Anslut en Ni-Sepharose-kolonn (1 ml) eller motsvarande till en peristaltisk pump säkerställa att ingen luft kommer in i kolonnen under detta steg och de följande stegen.
- Ställ in hastigheten på than pump till 1 ml / min och skölj kolonnen med 5 till 10 ml vatten för att avlägsna förvaringslösning.
- Jämvikta kolonnen med 3-4 ml OG-buffert.
- Lägg 3-4 ml OG buffert i provproteinet och last till kolonnen. OBS: om proteinet har suttit på is längre än 10 minuter efter avlägsnande av LDS, snurra igen vid 15.800 xg vid 4 ° C under 1 min för att avlägsna eventuella ytterligare LDS nederbörd.
- Skölj kolonnen med 5 ml OG-buffert.
- Skölj kolonnen med 2 ml OG sköljbuffert.
- Eluera det bundna proteinet med 3 ml elueringsbuffert. Samla gröna eluatet som innehåller rekonstituerade protein. OBS: Detta är vanligen ca 1 ml totalt.
7. sackarosgradientcentrifugering
- Bered följande lösningar som beskrivs i tabell 1: Sackaros lösning, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.
- Fyll ultracentrifugrör med sackaroslösningen och frysa vid -20 ° CO / Nor -80 ° C under minst en timme.
- Ta bort röret från frysen och låt dem tina ostörd vid 4 ° C. OBS: frysning / tining process skapar en gradient från 0,1 till 1 M sackaros. Ett 15 ml rör tinar typiskt i ca 3 tim.
- Ta försiktigt bort från toppen samma volym som den gröna fraktionen eluerades från nickel Sepharose-kolonnen i steg 6.8. Lägg sedan det rekonstituerade provet ovanpå långsamt för att undvika att störa lutning.
- Balans rör och centrifugera vid 200.000 xg vid 4 ° C i en ultracentrifug med en SW-41 eller SW-60 svängrotor under 18 timmar, inställd på långsam acceleration och stopp utan bromsar.
- Ta försiktigt ut gradienten från röret hållaren med pincett. Använd en spruta med en lång nål som har en trubbig öppning för uppsamling av fraktionen från toppen. OBS: Alternativt samla fraktioner från botten genom att sticka hål på röret med en nål och samla droppar.
Representative Results
Detta protokoll detaljer en metod för att rekonstituera chorophyll a / b-bindande proteiner in vitro. Denna teknik tillåter vikningen av dessa pigment-proteinkomplex in vitro med början från apoprotein, som kan erhållas genom överexpression i ett heterologt system, och pigment extraherade från växter eller alger. Efter beredning är det återveckade pigmentproteinkomplex renas från överskottet av pigment och ovikta apoprotein i två steg. Det första steget (figur 1 AB) är baserad på närvaron av His-tag vid C-terminalen av proteinet, vilket medger avlägsnande av större delen av de obundna pigment. Det andra reningssteget utnyttjar sackarosdensitetsgradientcentrifugering, (figur 2), där den ovikt proteinet migrerar oftast långsammare än det gröna bandet som innehåller den rekonstituerade proteinet. Målet för rekonstitution in vitro är att erhålla komplex med samma ordentligband som de infödda sådana. För att illustrera detta resultat, är de spektroskopiska egenskaperna för en in vivo-ljus-skörd komplex jämfört med samma LHC komplex rekonstitueras in vitro 13,20,21. Den absorptionsspektrum av LHCs inom det synliga området (350 nm och 750 nm) är beroende av pigmentkomposition av komplexet, såväl som på pigment miljö (som inkluderar proteinet) och det är således ett känsligt verktyg för att kontrollera kvaliteten rekonstitutionskragens. I fig 3, absorptionsspektrumet för CP24, en klorofyll a / b-bindande protein från Arabidopsis thaliana, rekonstitueras in vitro, jämföres med det spektrum av samma komplex renat från Arabidopsis tylakoider 21. I spektra, är det möjligt att känna igen Qy och Soret övergång Chl a (toppar vid 671/439 nm) och Chl b (toppar vid 649/466 nm). De infödda och ombildade komplex visar identiska absorption spektra, vilket tyder på en i stort sett identisk pigment sammansättning och organisation. Fluorescens-spektroskopi kan användas för att bedöma kvaliteten på den färdigberedda komplexet. Spektra fluorescensemission mäts efter excitation vid olika våglängder, som exciterar preferentiellt olika pigment: Chl A vid 440 nm, Chl b vid 475 nm, och xantofyller vid 500 nm. I en korrekt vikt protein-pigmentkomplex, Chl b och xantofyller överföra sina excitationsenergi främst Chl a inom några pikosekunder, och fluorescensen härstammar från ett termiskt till jämvikt systemet resulterar i en enda topp med samma form och maxima vid alla tre excitation våglängder (Figur 4A-B). Förekomsten av Chl b inte samordnat till proteinet kan kännas igen av en extra topp eller knuffar omkring 650 nm vid 475 nm excitation (Figur 4C). Närvaron av fri Chl a istället ledertill ytterligare emission kring 675 nm, som huvudsakligen är närvarande vid 440 nm excitation. Den fluorescensemissionsspektra vid 475 nm excitation av både rekonstituerade och de nativa CP24 komplex (Figur 4D) visar en enda topp vid 681 nm, vilket indikerar att rekonstituerade komplexet är korrekt veckat. Ytterligare en bekräftelse på att pigmentproteinkomplex är korrekt rekonstituerade kommer från cirkulär dikroism (CD) mätningar. CD-signalen i det synliga området beror på excitoniska interaktioner mellan pigment och det är därför mycket känslig för även små förändringar i organisationen av kromoforerna 22. Figur 5 visar CD-spektra av rekonstituerad och infödda CP24, med de typiska fingeravtrycks topparna vid 681 nm, 650 nm och 481 nm. Sammanfattningsvis hög likhet mellan de spektroskopiska egenskaper infödda och den beredda CP24 bekräftar att rekonstitueringsproceduren ger infödda-liknande komplex Suita rar för in vitro-studie av ljus-skörd proteiner.
Figur 1 Representation av rening av rekombinanta LHC proteiner med en His tagg med hjälp av en nickelkolonn. (A) under reningen, His-märkt protein, som består av både ombildade komplex (grön hexagon) och un-rekonstituerade / aggregerat protein (orange hexagon) är bundna till ytan av Ni-Sepharose (blå fläck), medan obundna pigment (små färgade fläckar) flödar genom. (B) När kolonnen tvättas med elueringsbuffert innehållande imidazol är de ombildade och un-rekonstituerade proteiner samlas i flödet genom.
hres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. sackarosgradient av rekonstituerad LHCII efter rening genom nickelkolonn. De rekonstituerade komplexen separeras från den fria pigmentet genom densitetsgradient. Den mörkgröna bandet representerar rekonstituerade LHCII och ljusgrön bakgrund består av fria pigment.
Figur 3 Absorptionsspektra färdigberedd protein CP24 (rCP24, röd linje) och personen en (nCP24, svart linje) isolerad från Arabidopsis thaliana. I båda spektra, är det möjligt att känna igen Qy och Soret övergång Chl a (toppar vid 671/439 nm) och Chl b (toppar vid 649/466 nm). Denna siffra har modifierats Passarini et al. 2014 21.
Figur 4 Fluorescens emissionsspektra. Det fluorescensemissionsspektra för rekonstituerade CP24 vildtyp komplexet (A) och normaliseras till det maximala (B) som visar effektiv energiöverföring från Chl b och Xanthophyls att CHL en. (C) fluorescens emissionsspektra rekonstituerad CP24 (rCP24) och personen komplex (nCP24) isolerad från Arabidopsis thaliana. Spektra är normaliserade till det maximala av toppen (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 cirkulär dikroism-spektra. Utspädd CP24 (rCP24, röd linje) och den nativa komplexet (nCP24, svart linje) isolerad från Arabidopsis thaliana visar mycket liknande spektra.
Figur 6 Absorptionsspektra av CP29 vildtyp (CP29_WT) och muterat CP29 (CP29_A2). Den gröna linjen visar skillnaderna mellan de två tomter.
| Alla buffertarna kan lagras vid 4 ° C. | ||||||
| Komponenter | Slutlig koncentration | Ytterligare anmärkningar | ||||
| Malning Buffert | Sorbitol | 0,4 M | ||||
| Tricin | 0,1 M | pH 7,8 | ||||
| NaCl | 10 mM | |||||
| MgCl2 | 5 mM | |||||
| Mjölkpulver | 0,5% vikt / volym | |||||
| Tvättbuffert | Sorbitol | 50 mM | ||||
| 5 mM | pH 7,8 | |||||
| EDTA | 10 mM | pH 8 | ||||
| Lysis Buffer | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| Sackaros | 2,5% vikt / volym | |||||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| Detergent buffert | NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| Deoxicholsyra | 1% vikt / volym | |||||
| 1% vikt / volym | ||||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| EDTA | 2 mM | pH 8 | ||||
| beta-merkaptoetanol | 10 mM | |||||
| Triton buffert | Triton X-100 | 0,5% vikt / volym | ||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| beta-merkaptoetanol | 1 mM | |||||
| Buffert TE | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| Rekonstitutionsbuffert | HEPES | 200 mM | ||||
| Sackaros | 5% vikt / volym | |||||
| Lithiumdodecylsulfate (LDS) | 4% vikt / volym | |||||
| Bensamidin | 2 mM | |||||
| Aminokapronsyra | 10 mM | |||||
| OG-buffert | Oktylglukosid | 1% vikt / volym | ||||
| 12,5% vikt / vol | ||||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| HEPES | 20 mM | |||||
| Imidazol | 10 mM | |||||
| OG Rinse Buffer | n-dodecyl-beta-D-maltosid (β-DM) | 0,06% vikt / volym | ||||
| HEPES | 40 mM | pH 7,5-9 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Elution Buffer | Imidazol | 0,5 M | ||||
| 0,06% vikt / volym | ||||||
| HEPES | 40 mM | pH 8 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Sackaroslösning | Sackaros | 20% vikt / vol | ||||
| n-dodecyl-beta-D-maltosid (β-DM) | 0,06% vikt / volym | |||||
| HEPES | 0,01 M | pH 7,6 | ||||
| Aceton 80% buffrad med natriumkarbonat | Aceton | 80% volym / volym | Natriumkarbonat | En M | ||
| Etanol 96% buffrad med natriumkarbonat | Etanol | 96% volym / volym | ||||
| Natriumkarbonat | En M | |||||
Tabell 1 Förteckning över buffertar och lösningar som används i detta protokoll.
| Chla a / b mix | Chla | Chl en | Chl b | Neo | Viola | Lute | Chl tot | Chl / Bil | |
| nCP26 | - | 2,2 ± 0,05 | 6,2 | 2,8 | 0,61 | 0,38 | 1,02 | 9 | 4,5 ± 0,1 |
| rCP26 | 8 | 2,71 ± 0,05 | 6,57 | 2,43 | 0,72 | 0,32 | 0,97 | "> 93,9 ± 0,04 | |
| rCP26 | 5,5 | 2,25 ± 0,05 | 6,23 | 2,77 | 0,77 | 0,3 | 0,96 | 9 | 4,0 ± 0,1 |
| rCP26 | 3 | 2,08 ± 0,04 | 6,08 | 2,92 | 0,76 | 0,3 | 1,04 | 9 | 4,1 ± 0,1 |
| rCP26 | 1 | 1,7 ± 0,05 | 5,7 | 3,3 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4,3 ± 0,05 |
| rCP26 | 0,3 | 1,11 ± 0,04 | 4,7 | 4,28 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4,2 ± 0,2 |
| 0,05 | 0,23 ± 0,01 | 1,4 | 5,6 | 0,58 | 0,24 | 1,11 | 7 | 3,1 ± 0,06 | |
| rCP26 | <0,01 | 0,11 ± 0,01 | 0,7 | 0,64 | 0,3 | 1,08 | 7 | 3,06 ± 0,06 |
Tabell 2 Pigment innehåll CP26 infödda komplex jämfört med ombildade protein-pigmentkomplex med olika Chl a / b nyckeltal 39.
Discussion
Membranproteiner är inte så lätt att studera. Isolering av nativa membranproteiner kompliceras av behovet att lösa lipidbilagret med rengöringsmedel, vilket kan skada proteinet och ta bort viktiga kofaktorer. Dessa proteiner kan också vara närvarande i låga halter i biologiska membran, eller blandas med närbesläktade proteiner, som i fallet av de lätta skörd komplexen, som gör rening av enstaka komplex svåra. Heterolog proteinexpression i E. coli och in vitro-beredning erbjuder möjligheten att undvika dessa problem. In vitro beredning och rening av vikta proteiner leder komplex som besitter egenskaper som mycket liknar de hos de infödda komplex 20,21,23 och därmed kan användas för att studera komplex som inte kan renas till homogenitet 24 - 27.
Den här metoden använder spenat, som är lätt attainable året runt, som en källa för den totala pigment och karotenoidpreparat. För vissa reconstitutions av proteiner nativa för alger, är användningen av pigment som renats från alger föredrages på grund av olika pigmentkompositioner. CHL a / b-förhållande och Chl / bil förhållandet är detsamma oavsett pigmentkälla.
Det är viktigt att inse att effektiviteten i beredning är vanligtvis runt 35% 28. Därför är det nödvändigt att avlägsna de icke bundna pigment och ovikt apoprotein från lösningen efter beredning. Ett två-stegs reningsprotokoll presenteras i detta protokoll (se även resulterar). Emellertid bör det noteras att den sackarosgradient steg inte medger fullständig separation av apo-och holo-proteinet. För de flesta analyser är detta inte ett problem, eftersom det apoprotein inte innehåller pigment och sålunda inte stör de funktionella mätningar. Men det är nödvändigt om att helt ta bort apoprotein från frhandling som innehåller den färdigberedda komplexet (till exempel för att beräkna pigmentet till protein stökiometri), kan en anjonisk bytarkolonn användas (se Passarini et al. 2009 29 för mer information).
Förmågan att återvecka rekombinanta ljus skörd proteiner med isolerade pigment in vitro ger en möjlighet att "manipulera" komplexen genom att modifiera beredning "miljö" på olika sätt och på så sätt ändrar egenskaperna hos det resulterande komplexet. Till exempel kan ändra pigmentkompositionen under rekonstitution resulterar i ett komplex med förändrad pigmentkomposition. Den här funktionen kan användas för att studera inverkan av olika pigment har på strukturen och stabiliteten av komplexet. Vanligtvis pigmentet preparaten av spenat har Chl a / b förhållande på 3: 1 och en Chl / bil-förhållande på 2,9: 1. Detta förhållande ger typiskt en rekonstituerad protein med samma egenskaper som de ntivt en. Emellertid kan justeringen av Chl a / b-förhållande genom tillsättning av renat Chl a eller b påverka bindningen av olika pigment på grund av varierande selektivitet av bindningsställena 30-33. Detta är möjligt eftersom de flesta av de pigmentbindningsställen inte är helt selektiva för Chl a eller Chl b, men rymmer båda, fastän med olika affinitet 10,30,34. På ett liknande sätt, var karotenoid bindningsställen också visat att kunna rymma mer än en xantofyll arter 8,35 - 38. Olika reconstitutions av CP26, ett annat pigment-protein-komplex av högre växter, genom att använda olika pigmentkompositioner visas i tabell 2 39. Dessa reconstitutions användes för att utvärdera affiniteten för bindningsställen för specifika pigment 39. Det är intressant att notera att i syfte att erhålla ett komplex med samma pigment cSAMMANSÄTTNING som det nativa ett måste Chl a / b förhållandet mellan pigment mix vara 3: 1. Detta verkar vara fallet för alla LHC komplex av högre växter 20,40.
Kombinationen av molekylärbiologi med beredning teknik medger egenskaperna för en Chl bindande komplex som ska studeras mer i detalj. Betydelsen av olika proteindomäner på stabiliteten och vikning av komplexen, eller deras engagemang i de protein-proteininteraktioner, har fastställts genom att trunkera apoprotein eller utför slumpmässig mutagenes 8,41 - 44. Single aminosyror viktiga för samordningen av olika pigment kan förändras genom riktad mutagenes för att analysera egenskaperna hos enskilda pigment eller bedöma deras bidrag till funktion och stabilitet i komplexa 10,28,29,45 - 52. Figur 6 visar rekonstituerade Lhcb4 (CP29) meden mutation av histidin vid position 216 53. En jämförelse av pigmentkompositionen av vildtyp och mutanta komplex visar att mutationen inducerar förlusten av ett Chl en molekyl, vilket indikerade att den målsökta platsen rymmer ett Chl en i WT-komplexet. Skillnaderna i absorptionsspektra för WT och mutant, upon normalisering till pigmentinnehåll, visar också på absorptionsegenskaperna för den förlorade pigmentet. I detta fall kan skillnaden ses i huvud toppen vid 680 nm, vilket indikerar att Chl ett samordnat av His216 absorberar vid denna våglängd (för mer information om denna mutant och spektroskopiska egenskaper ser Mozzo et al. 2008 53). Mutationsanalys kan också användas för att bestämma effekten av miljön på de spektroskopiska egenskaperna hos pigmenten 54.
Sammanfattningsvis kan lätta skörd proteiner lätt beredas in vitro resulterar i pigment-protein komplex med mycket liknande egenskaper som infödda komplex. På detta sätt är svårigheterna att isolera naturliga proteiner elimineras, samtidigt leverera proteinpreparat med högt utbyte och renhet för vidare studier. Vikten av en 3: 1 Chl a / b-förhållandet i producera en autentisk komplex betonas, och exempel på rekonstituerad vildtyp och mutanta LHCs tillhandahålls för att illustrera tillämpningar av tekniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Nylon cloth | 20 μm pores | ||
| Soft artists paint brush | |||
| NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
| Beta-DM | Sigma | D4641 | |
| DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
| Milk Powders | |||
| RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
| Sonicator | |||
| Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
| Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
| TAP medium | see reference 17 | ||
| LB medium | see reference 19 |
References
- Plumley, F. G., Schmidt, G. W. Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting complexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 146-150 (1987).
- Croce, R., van Amerongen, H. Light-harvesting and structural organization of Photosystem II from individual complexes to thylakoid membrane. Journal of photochemistry and photobiology B Biology. 104 (1-2), 142-153 (2011).
- Li, Z., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and responding to excess light. Annual review of plant biology. 60, 239-260 (2009).
- De Bianchi, S., Ballottari, M., Dall’osto, L., Bassi, R. Regulation of plant light harvesting by thermal dissipation of excess energy. Biochemical Society transactions. 38 (2), 651-660 (2010).
- Neilson, J. A. D., Durnford, D. G. Structural and functional diversification of the light-harvesting complexes in photosynthetic eukaryotes. Photosynthesis research. 106 (1-2), 57-71 (2010).
- Paulsen, H., Rümler, U., Rüdiger, W. Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta. 181 (2), 204-211 (1990).
- Horn, R., Grundmann, G., Paulsen, H. Consecutive binding of chlorophylls a and b during the assembly in vitro of light-harvesting chlorophyll-a/b protein (LHCIIb). Journal of molecular biology. 366 (3), 1045-1054 (2007).
- Cammarata, K. V., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of a light-harvesting gene product: deletion mutagenesis and analyses of pigment binding. Biochemistry. 31 (10), 2779-2789 (1992).
- Paulsen, H., Hobe, S. Pigment-binding properties of mutant light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 205 (1), 71-76 (1992).
- Bassi, R., Croce, R., Cugini, D., Sandonà, D. Mutational analysis of a higher plant antenna protein provides identification of chromophores bound into multiple sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (18), 10056-10061 (1999).
- Paulsen, H., Finkenzeller, B., Kühlein, N. Pigments induce folding of light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 215 (3), 809-816 (1993).
- Caffarri, S., Croce, R., Cattivelli, L., Bassi, R. A look within LHCII differential analysis of the Lhcb1-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis. Biochemistry. 43 (29), 9467-9476 (2004).
- Giuffra, E., Cugini, D., Croce, R., Bassi, R. Reconstitution and pigment-binding properties of recombinant CP29. European journal of biochemistry / FEBS. 238 (1), 112-120 (1996).
- Rogl, H., Kosemund, K., Kühlbrandt, W., Collinson, I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBS letters. (1-2), 21-26 (1998).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
- Davies, B. H. Identification of carotenoids by their absorption characteristics. Biochem J. 103 (2), (1967).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wientjes, E., Croce, R. The light-harvesting complexes of higher-plant Photosystem I Lhca1/4 and Lhca2/3 form two red-emitting heterodimers. The Biochemical journal. 433 (3), 477-485 (2011).
- Passarini, F., Xu, P., Caffarri, S., Hille, J., Croce, R. Towards in vivo mutation analysis knock-out of specific chlorophylls bound to the light-harvesting complexes of Arabidopsis thaliana - the case of CP24 (Lhcb6). Biochimica et biophysica acta. , (2014).
- Georgakopoulou, S., van der Zwan, G., Bassi, R., van Grondelle, R., van Amerongen, H., Croce, R. Understanding the changes in the circular dichroism of light harvesting complex II upon varying its pigment composition and organization. Biochemistry. 46 (16), 4745-4754 (2007).
- Croce, R., Müller, M. G., Caffarri, S., Bassi, R., Holzwarth, A. R. Energy transfer pathways in the minor antenna complex CP29 of photosystem II a femtosecond study of carotenoid to chlorophyll transfer on mutant and WT complexes. Biophysical journal. 84 (4), 2517-2532 (2003).
- Schmid, V. H., Cammarata, K. V., Bruns, B. U., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730 heterodimerization is required for antenna pigment organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (14), 7667-7672 (1997).
- Castelletti, S., Morosinotto, T., Robert, B., Caffarri, S., Bassi, R., Croce, R. Recombinant Lhca2 and Lhca3 subunits of the photosystem I antenna system. Biochemistry. 42 (14), 4226-4234 (2003).
- Storf, S., Jansson, S., Schmid, V. H. R. Pigment binding, fluorescence properties, and oligomerization behavior of Lhca5, a novel light-harvesting protein. The Journal of biological chemistry. 280 (7), 5163-5168 (2005).
- Mozzo, M., Mantelli, M., Passarini, F., Caffarri, S., Croce, R., Bassi, R. Functional analysis of photosystem I light-harvesting complexes (Lhca) gene products of Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et biophysica acta. 1797 (2), 212-221 (2010).
- Remelli, R., Varotto, C., Sandonà, D., Croce, R., Bassi, R. Chlorophyll binding to monomeric light-harvesting complex. A mutation analysis of chromophore-binding residues. The Journal of biological chemistry. 274 (47), 33510-33521 (1999).
- Passarini, F., Wientjes, E., Hienerwadel, R., Croce, R. Molecular basis of light harvesting and photoprotection in CP24 unique features of the most recent antenna complex. The Journal of biological chemistry. 284 (43), 29536-29546 (2009).
- Giuffra, E., et al. Analysis of some optical properties of a native and reconstituted photosystem II antenna complex, CP29 pigment binding sites can be occupied by chlorophyll a or chlorophyll b and determine spectral forms. Biochemistry. 36 (42), 12984-12993 (1997).
- Pagano, A., Cinque, G., Bassi, R. In vitro reconstitution of the recombinant photosystem II light-harvesting complex CP24 and its spectroscopic characterization. The Journal of biological chemistry. 273 (27), 17154-17165 (1998).
- Kleima, F. J., et al. Decreasing the chlorophyll a/b ratio in reconstituted LHCII structural and functional consequences. Biochemistry. 38 (20), 6587-6596 (1999).
- Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et biophysica acta. 1556 (1), 29-40 (2002).
- Hobe, S., Trostmann, I., Raunser, S., Paulsen, H. Assembly of the major light-harvesting chlorophyll-a/b complex Thermodynamics and kinetics of neoxanthin binding. The Journal of biological chemistry. 281 (35), 25156-25166 (2006).
- Croce, R., Weiss, S., Bassi, R. Carotenoid-binding sites of the major light-harvesting complex II of higher plants. The Journal of biological chemistry. 274 (42), 29613-29623 (1999).
- Hobe, S., Niemeier, H., Bender, A., Paulsen, H. Carotenoid binding sites in LHCIIb. Relative affinities towards major xanthophylls of higher plants. European journal of biochemistry / FEBS. 267 (2), 616-624 (2000).
- Jahns, P., Depka, B., Trebst, A. Xanthophyll cycle mutants from Chlamydomonas reinhardtii indicate a role for zeaxanthin in the D1 protein turnover. Plant Physiology and Biochemistry. 38 (5), 371-376 (2000).
- Wehner, A., Grasses, T., Jahns, P. De-epoxidation of violaxanthin in the minor antenna proteins of photosystemII, LHCB4, LHCB5, and LHCB6. The Journal of biological chemistry. 281 (31), 21924-21933 (2006).
- Croce, R., Canino, G., Ros, F., Bassi, R. Chromophore organization in the higher-plant photosystem II antenna protein CP26. Biochemistry. 41 (23), 7334-7343 (2002).
- Caffarri, S., Passarini, F., Bassi, R., Croce, R. A specific binding site for neoxanthin in the monomeric antenna proteins CP26 and CP29 of Photosystem II. FEBS letters. 581 (24), 4704-4710 (2007).
- Hobe, S., Förster, R., Klingler, J., Paulsen, H. N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex. Biochemistry. 34 (32), 10224-10228 (1995).
- Kuttkat, A., Hartmann, A., Hobe, S., Paulsen, H. The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex. European journal of biochemistry / FEBS. 242 (2), 288-292 (1996).
- Rupprecht, J., Paulsen, H., Schmid, V. H. Protein domains required for formation of stable monomeric Lhca1- and Lhca4-complexes. Photosynthesis research. 63 (3), 217-224 (2000).
- Yang, C., et al. The negatively charged amino acids in the lumenal loop influence the pigment binding and conformation of the major light-harvesting chlorophyll a/b complex of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (11), 1463-1470 (2008).
- Rogl, H., Kühlbrandt, W. Mutant trimers of light-harvesting complex II exhibit altered pigment content and spectroscopic features. Biochemistry. 38 (49), 16214-16222 (1999).
- Yang, C., Kosemund, K., Cornet, C., Paulsen, H. Exchange of pigment-binding amino acids in light-harvesting chlorophyll a/b protein. Biochemistry. 38 (49), 16205-16213 (1999).
- Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. Mutation analysis of Lhca1 antenna complex. Low energy absorption forms originate from pigment-pigment interactions. The Journal of biological chemistry. 277 (39), 36253-36261 (2002).
- Morosinotto, T., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. The nature of a chlorophyll ligand in Lhca proteins determines the far red fluorescence emission typical of photosystem I. The Journal of biological chemistry. 278 (49), 49223-49229 (2003).
- Ballottari, M., Mozzo, M., Croce, R., Morosinotto, T., Bassi, R. Occupancy and functional architecture of the pigment binding sites of photosystem II antenna complex Lhcb5. The Journal of biological chemistry. 284 (12), 8103-8113 (2009).
- Croce, R., et al. Origin of the 701-nm fluorescence emission of the Lhca2 subunit of higher plant photosystem I. The Journal of biological chemistry. 279 (47), 48543-48549 (2004).
- Morosinotto, T., Mozzo, M., Bassi, R., Croce, R. Pigment-pigment interactions in Lhca4 antenna complex of higher plants photosystem I. The Journal of biological chemistry. 280 (21), 20612-20619 (2005).
- Mozzo, M., Morosinotto, T., Bassi, R., Croce, R. Probing the structure of Lhca3 by mutation analysis. Biochimica et biophysica acta. 1757 (12), 1607-1613 (2006).
- Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., Croce, R. Photoprotection in higher plants the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (10), 1263-1267 (2008).
- Wientjes, E., Roest, G., Croce, R. From red to blue to far-red in Lhca4 how does the protein modulate the spectral properties of the pigments. Biochimica et biophysica acta. 1817 (5), 711-717 (2012).
