Introduction
Контроль Движение основных функций центральной нервной системы (ЦНС). Моторики является основным измеримое выход функции ЦНС и главным возможность для людей, чтобы взаимодействовать с внешним миром. Понимание принципов двигательной функции и механизмы, которые лежат в основе изучение двигательной задачи является в настоящее время одним из самых больших проблем в области неврологии. Морфологические, физиологические и молекулярные изменения были найдены при приобретении нового двигателя задачи. Например, форма и число синапсов изменяются в ответ на квалифицированной подготовки 1-5 двигателя, и наблюдались функциональные изменения синаптической техники после изучения двигателя. Synaptic ответы были выше в соединениях передних конечностей, представляющих области тренированного моторной коры по сравнению с неподготовленных полушарии и того же животного или к ответах неподготовленных животных 6,7. Электрофизиологические наблюдения также показывают, что долгосрочное потенцирование (LTP) и долгосрочной-ной депрессия (LTD), как механизмы состоится во время обучения новой двигательного навыка, и что в диапазоне синаптической работы, который определяется между предельными границами LTP и LTD насыщения, изменяется 8. Кроме того, было показано, что маркеры активности и пластичности, способствующие молекулы, такие как С-FOS, GAP-43, или BDNF, но также пластичности ингибирующих молекул, таких как Nogo-дисплея нормативных ролей обучения, связанных с нейронной пластичности 9-16.
Эти достижения в направлении лучшего понимания механизмов, лежащих в основе двигателя обучения может быть достигнута только при использовании поведенческих парадигм, которые позволяют точно контролировать приобретение нового двигательного навыка, например, опытный передней конечности идущего. Только хорошо структурирована поведенческая задача позволяет контролировать и захватить коррелятивные изменения, которые происходят на обучение и выполнение соответствующей задачи. Здесь мы визуально продемонстрировать модифицированную версию опытного передних конечностейодного осадок достижении задача у крыс, адаптированных из Буитраго др. 17 Представленные парадигмы позволяет проводить анализ приобретения движение в ежедневной тренировке (в сессии), представляющий быстрый компонент обучения и первичного приобретения, а также квалифицированную обучения двигателя в течение нескольких сессий (между-сессии), представляющий медленную составляющую обучения и технического обслуживания узнал задачи 18. Важно отметить, что это поведенческая парадигма увеличивает степень сложности и сложности двигательных навыков задачи из-за двух особенностей: во-первых, крысы обучаются развернуться своей оси после каждого хватки и, таким образом, чтобы выровнять свое тело до следующей гранул досягаемости и возобновить Ориентация тела, предотвращая выполнение постоянное движение под тем же углом. Во-вторых, гранулы извлекаются из вертикального столба, помещенного в передней части клетки. Из-за небольшого диаметра сообщению, гранулы могут быть легко стартовал требующих точного понимание для успешного поиска и рreventing просто вытягивать осадку по отношению к животным.
Такой комплекс поведенческих тестирование позволяет глубже понять механизмы, лежащие в основе двигателя обучения. По сравнению с мышами, крысы превосходят в их исполнении сложных поведенческих задач и, таким образом, лучше всего подходит для сложных парадигм, как представлено в данном исследовании. Учитывая возрастающие возможности генетические доступны для крыс 19,20, сочетание точных и хорошо контролируемых методов тестирования поведения с генетическими манипуляциями, изображений и физиологических методов представляет собой мощный набор инструментов, чтобы лучше понять нейробиологические основы двигательной обучения и памяти.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами ветеринарного бюро кантона Цюрих, Швейцария.
1. Животное Обращение и Привыкание
- Животное Обращение
Примечание: за 5 дней до начала эксперимента, выполнить шаг 1.1.1 ежедневно.- Для поведенческих экспериментов, приучить животных к экспериментатору. У ежедневно обращении сессий продолжительностью 10-15 мин на одно животное. Очистите окно после сессии каждого животного.
- Первоначально, поместите руку экспериментатора в клетку, позволяющей животному, чтобы исследовать и запах ознакомится с экспериментатором.
- Далее, аккуратно поднимите животное с рукой экспериментатора в безопасной манере, держа тело крысы между фронт- и задние лапы, позволяющих дальнейшее ознакомление.
- Взвесьте каждое животное ежедневно, чтобы получить базовые массы тела до лишения пищи.
- Аппарат Привыкание и пищевой Ознакомление
- Взвесьте каждое животное ежедневно, чтобы получить базовые массы тела до лишения пищи.
- Начните пищу лишая крыс 3 дня до начала предварительной подготовки на стандартной лабораторной диете. Дайте крыс 0,05 г пищи на 1 г веса тела в день (например, крысы весом 200 г, начать с 10 г корма). Убедитесь, вес тела не снижалась более чем на 10% в день, контролируя вес тела в день.
- Если несколько животных проводятся в одной клетке, доминирующие крыс может съесть больше, чем меньше доминирующих. В случае веса тела уменьшается животных, кормить животное отдельно, а группа кормления. Дайте воды вволю.
- Познакомить крысу с схватив аппарат, поместите животное в учебном поле (Рисунок 1). У сахарные шарики, размещенные в учебном поле в непосредственной близости от отверстия щели для ознакомления животное с пищей гранул. Выполните эту улEP 10-15 мин ежедневно в течение 3 дней.
2. Предварительная подготовка и двигательных навыков обучения
- Предварительно обучение
- Однажды после ознакомления, поместите животное в учебном поле и поместите шарик близко к открытию щели, так что может быть достигнуто путем языка животного. Исключить животных, которые получают гранулы с их передних конечностей во время предварительной подготовки
Примечание: На этом этапе, поиск гранул с языком имеет решающее значение, и, как правило, метод животного выбора. Пеллеты должны быть ни в коем случае захваченного с передних конечностей до первого дня квалификации обучения двигателя, чтобы обеспечить достаточное мониторинг ученого идущей задачи. Пелле поиска с передних конечностей во время предварительной подготовки является критерием исключения и является в большинстве случаев не наблюдается. - Научите крысу либо бежать в задней части клетки и вернуться к открытию щели или шаг назад и поверните вокруг своей оси для того, чтобы получить следующий шарик пищи сязык. Дайте время для животного, чтобы исследовать клетку, бегите к задней и вернуться к открытию щели. Если животное не правильно выполнить задание, используйте щипцы, чтобы мягко нажмите на конец задней части клетки и привлечь внимание животного. После того, как животное сзади, мягко нажмите на клетку перед направлять животное к открытию щели.
Примечание: После того, как животное достигает определенного стандартное значение (например, 50 успешных извлечений на пеллетах с языка менее чем 15 мин), животных квалифицируется на этапе обучения умение двигателя. На день 1 и 2 предварительной подготовки, учащиеся уже можно отличить от не-учащихся. Номера для учащихся могут быть исключены из исследования на этом этапе. Это уменьшает вероятность наличия большого числа лиц, не являющихся учащимися во время стадии обучения двигателя (2.2). - Во время предпроектной подготовки, еда лишить крыс на стандартной лабораторной диете. Дайте воды вволю. Монитор веса тела в день на протяжении всего исследования. СделатьНе используйте тот же номер для обучения мужчин и женщин крыс. Обеспечить спокойствие и бесшумное среды для животного.
- Однажды после ознакомления, поместите животное в учебном поле и поместите шарик близко к открытию щели, так что может быть достигнуто путем языка животного. Исключить животных, которые получают гранулы с их передних конечностей во время предварительной подготовки
- Определение Paw Домашние и двигательных навыков обучения
- Во время первой сессии двигательного навыка обучения, заменить слайд в передней части окна с должности. Поместите сахар гранул около 1,5 см от окна на пост, так что животное не может добраться до гранул с его языка, но только получить его точное передних конечностей и, схватив достигает движение.
- Для применения извлечение окатышей на передней конечности, используйте щипцы, чтобы мягко принести таблетку, близкий к рту животного и убрать осадок, а животное пытается потребление языком. Провести эту задачу повторно, пока животное не протягивает передних конечностей и захватывает осадок.
- Поместите пост центральное место в оконном проеме. Чтобы определить предпочтения лапы, внимательно наблюдать первые 10 испытаний на обучение день 1. Более 70% реакцияхХин попытки (т.е. 7 из 10) должны быть выполнены с той же передней конечности. Если это не достигается, по-прежнему с очередного раунда испытаний 10 до 70% порог не достигнут.
- После определения предпочтений лапа, переложить пост к предпочтительному передних конечностей и выравнивания центральной границы оконного проема. Предпочтительные выравнивания лапы означает запись сдвигается в отличие от соответствующей лапе, чтобы оптимальный угол для достижения (фиг.1В, C).
- Оцените судебного разбирательства, определенного в качестве нового осадка, представленного животного, как успешный (достижения, понять, извлекать и съесть таблетку), падение (достижения, понять и потерять шарик во время получения) или не (стук осадок от должности). Запишите каждый процесс в листе и анализировать данные после эксперимента.
- Выполните один ежедневный сеанс, состоящий из определенного числа испытаний (например, 150) или максимальное время (например, 1 час) для каждого животного.
- Исследовать точность и тонкой настройкив движение с помощью первого анализа попытки. Первая попытка определяется схватив из гранул в единый монолитный движения без разрушения, колебаний или повторения отдельных компонентов движения. Тщательно соблюдайте каждый понимание крысой.
- Если крыса колеблется или убирается во время близости или пытается несколько попыток, чтобы правильно понять гранул, обратите внимание на соответствующий процесс как успех, но не с первой попытки. Если животное успешно захватывает осадок в единый монолитный досягаемости, запишите соответствующий процесс как успешный первой попытки в отдельной колонке в листе.
- Во время квалификации обучения двигателя, питание лишить крыс на стандартной лабораторной диете. Дайте воды вволю. Монитор веса тела в день на протяжении всего исследования.
- Во время первой сессии двигательного навыка обучения, заменить слайд в передней части окна с должности. Поместите сахар гранул около 1,5 см от окна на пост, так что животное не может добраться до гранул с его языка, но только получить его точное передних конечностей и, схватив достигает движение.
- Для поведенческих экспериментов, приучить животных к экспериментатору. У ежедневно обращении сессий продолжительностью 10-15 мин на одно животное. Очистите окно после сессии каждого животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное приобретение двигательных навыков достигается только через постоянную практику. Несмотря тщательного рассмотрения всех аспектов, некоторые крысы не узнать задачу (рисунок 2). Эти «не-учащихся либо не хватает мотивации в результате нескольких отсутствующих или попытки поиска пеллет с начала эксперимента или вообще потерять интерес в достижении для гранул, ведущих к постоянно неудачных попыток. Напротив, некоторые животные показать агрессивную и более мотивированное поведение в результате поспешное и бросился хватать попытки, которые приводят к сбоям. Третья группа неудачных учащихся являются те животные, которые начинаются с высоким уровнем успеха и не делают значительное улучшение, ведущие к стагнации или даже снизились обучения кривые.
Успешное обучение двигательных навыков состоит из двух фаз: быстрой компоненты обучения, представляющий основной приобретение, как правило, наблюдается в течение первого дня обучения двигателя (в ходе сессии;
Для анализа производительности во время каждого ежедневного сеанса (в ходе сессии) анализа, разделите общее количество испытаний в 25 судебных бункеров (например, 6 бункеров для 150 испытаний). После эксперимента, вычислить процент успешно захваченных гранул для каждого бункера путем деления числа успехов в соответствующем бункере от общего числа испытаний на соответствующий день.
Следует учитывать, что приобретение двигательных навыков может меняться в зависимости от индивидуальных животных. Различные крыс нужно разное количество дней, чтобы достичь уровня плато. Таким образом, индивидуальные кривые обучения являются обычнымиLY не так гладко, как в среднем кривой обучения.
Другим выражением успешного обучения двигателя анализ тонкой настройки обучения двигателя. Для оценки этого аспекта, мы измерили количество гранул захваченных с первой попытки во время движения монолитного без колебаний или перебоев в сравнении со всеми успешно измеренных гранул (рис 5).
Примеры на рисунке 2 - 5 показывают кривые обучения 150 захваченных гранул / сутки в течение 6 дней. День 1 относится к первому дню автомобильного обучения.
Рисунок 1: Проектирование учебного крысы поле () обучение окно с соответствующим размерам.. Чтобы избежать извлечения гранул, которые были потеряны внутри коробки, основание учебного камеры выполнен из металлических стержней , Через которые теряется гранулы падают. (Б) Закрыть вид открытии щели и должность. Обратите внимание на положение пост в соответствие центральное отверстие щели. (С) Пример крысы успешно захватывая осадок через отверстие щели. Примечание сдвинутый сообщению позицию и в результате угол к животного предпочтительной передних конечностей (в данном случае справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Пример животного, не проявляют успешное приобретение двигательного навыка на протяжении 6 дней уровень успеха застаивается около 20%, без улучшения по дальнейшего обучения.
объявления / 53010 / 53010fig3.jpg "/>
Рисунок 3: В день анализ же, например, как показано на рисунке 4. Шанс делится на 6 бункеров 25 таблеток, иллюстрирующих улучшение двигательной обучения на протяжении одного ежедневного сеанса. Обратите внимание на начальную скорость успеха в течение первых 25 испытаний первых 2 дней по сравнению с средней скоростью успеха соответствующих дней в рисунке 4, а также общего улучшения в течение дня 1 и 2 в сравнении с Рисунок 4.
Рисунок 4:. Пример животного с типичной успешной кривой обучения на протяжении 6 дней процент успешно захваченных гранул (успеха) увеличивается во время первых 3 дней и достигает плато в течение оставшихся дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Парадигма показано в этом исследовании, взята из Буитраго др 18 и отличается от классического одной гранулы достигает парадигму 17 в основном в двух аспектах.:
Во-первых, изучая в течение сеанса улучшение позволяет анализ ученого задачи в один день, который может обеспечить различный уровень информации, такой как исследования быстрой компоненты обучения по сравнению с медленной компоненты обучения, представленной в среднем суточных значений (см рисунки 3 и 4). Во-вторых, поведенческие парадигмы, представленные здесь повышает степень сложности и сложности задачи двигательного навыка. Животное вынуждено перестроить свое тело и достижения ориентации до каждого извлечения гранул. Это предотвращает выполнение повторных простой движение с той же углом и требует глубокого пространственную ориентацию. Кроме того, гранулы извлекаются из тонкой вертикальной стойке, что находится перед гое клетки и соответствует диаметру гранул, таким образом, требующей точного схватывание для успешного поиска и предотвращение простой вытягивания гранул по отношению к животным.
Важным шагом учит животное бежать к задней части клетки и вернуться к отверстию щели во время предварительной подготовки. Намекая крысу в нужное место с помощью щипцов и аккуратно постукивая по задней панели Кейджа помогает животному понять задачу. Экспериментатор должен использовать этот инструмент осторожно, как overtapping производит слишком много шума и раздражает животное. После того, как крыса вернулась к передней части клетки, поместить несколько сахарных гранул на открытии щели для животных, чтобы привыкнуть с вкус, запах и расположение гранул. Еще одним важным шагом является поиск осадок с передних конечностей в первый день автомобильного обучения. Животное часто продолжает попытки получения гранул с языком, как узнал во время предварительной подготовки. Использование щипцов, чтобы мягко принести йе осадок близко ко рту животного и втягивания таблетки, а потребление попытки животных с языком усиливает крысу растянуть переднюю конечность для успешного поиска пеллет. Цель, чтобы животное, чтобы понять осадок от щипцов, используя переднюю конечность и извлекать сахар осадок в его рот. После того, как это было достигнуто, гранулы могут быть размещены в почтовом и лапы определения предпочтений могут быть оценены. Эти два шага являются наиболее важными частями всего эксперимента и требуют тщательного подхода к животному, а также терпение экспериментатора.
Важно отметить, что различия в обучении существуют между отдельными животными, а также между пола (самцы узнать медленнее, чем у женщин 18) и штаммов (в соответствии с нашим наблюдением, Sprague-Dawley крыс, используемые в этом исследовании, и Лонг-Эванс крысах показывают превосходную обучения по сравнению с например, крыс Льюиса). Таким образом, для того, чтобы удовлетворить сложной требуютменты задачи, показатели успеха может потребоваться изменение парадигмы в зависимости от пола и деформации. Чтобы сохранить дисперсию низко, не следует смешивать штаммов и пол в экспериментальной серии.
Хорошо структурированная и управляемые поведенческие парадигмы имеют решающее значение для исследований следственных клеточные корреляты основные механизмы патологического и физиологического поведения. Более сложные поведенческие задачи, что крысы способны узнать, представляют собой важное преимущество над крыс мышей. Продолжающиеся успехи в технологиях для генетических манипуляций у крыс позволит в ближайшем будущем проводить эксперименты на крысах, которые были до сих пор можно только на мышах 19-21. В сочетании с новыми технологиями визуализации и методов, позволяющих целенаправленного воздействия нейронных цепей, поведенческие парадигмы в крыс может открыть новые возможности к пониманию физиологических и патологических принципов функций нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантами Швейцарского национального научного фонда (грант 31003A-149315-1 МОН и Грант IZK0Z3-150809 к AZ), чтобы AZ Хайди Деметриадес Foundation, МОН Европейский исследовательский совет ('Nogorise') и Кристофер и Дана Рив Фонд (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Yu, X., Zuo, Y.
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290, 533-536 (2000).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Hess, G., Donoghue, J. P. Strengthening of horizontal cortical connections following skill learning. Nature neuroscience. 1, 230-234 (1998).
- Rioult-Pedotti, M. S., Donoghue, J. P., Dunaevsky, A.
- Fritsch, B., et al. Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning. Neuron. 66, 198-204 (2010).
- Ghiani, C. A., Ying, Z., de Vellis, J., Gomez-Pinilla, F. Exercise decreases myelin-associated glycoprotein expression in the spinal cord and positively modulates neuronal growth. Glia. 55, 966-975 (2007).
- Josephson, A., et al. Activity-induced and developmental downregulation of the Nogo receptor. Cell and tissue research. 311, 333-342 (2003).
- Karlen, A., et al. Nogo receptor 1 regulates formation of lasting memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20476-20481 (2009).
- Kleim, J. A., Lussnig, E., Schwarz, E. R., Comery, T. A., Greenough, W. T. Synaptogenesis and Fos expression in the motor cortex of the adult rat after motor skill learning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 4529-4535 (1996).
- Mironova, Y. A., Giger, R. J. Where no synapses go: gatekeepers of circuit remodeling and synaptic strength. Trends in neurosciences. 14, 7-23 (2013).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. Neuroscience. 14, 7-23 (2013).
- Zemmar, A., et al. Neutralization of Nogo-A enhances synaptic plasticity in the rodent motor cortex and improves motor learning in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 8685-8698 (2014).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural brain research. 41, 49-59 (1990).
- Buitrago, M. M., Ringer, T., Schulz, J. B., Dichgans, J., Luft, A. R. Characterization of motor skill and instrumental learning time scales in a skilled reaching task in rat. Behavioural brain research. 155, 249-256 (2004).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tews, B., et al. Synthetic microRNA-mediated downregulation of Nogo-A in transgenic rats reveals its role as regulator of synaptic plasticity and cognitive function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 681-683 (2013).
