Introduction
Control de movimiento es una función básica del sistema nervioso central (SNC). Motricity es la principal salida mensurable de la función del SNC y la posibilidad principal para que las personas interactúan con el mundo externo. La comprensión de los principios de la función motora y los mecanismos que subyacen en el aprendizaje de una tarea motora es actualmente uno de los grandes retos de la neurociencia. No se encontraron cambios morfológicos, fisiológicos y moleculares en la adquisición de una nueva tarea motora. Por ejemplo, la forma y el número de sinapsis cambian en respuesta al entrenamiento motor experto 1-5, y no se observaron cambios funcionales de la maquinaria sináptica después de aprendizaje motor. Las respuestas sinápticas fueron mayores en las conexiones de la región de la extremidad anterior-representación de de la corteza motora entrenado en comparación con el hemisferio no entrenado del mismo animal o a las respuestas procedentes de animales no entrenados 6,7. Observaciones electrofisiológicas también sugieren que la potenciación a largo plazo (LTP) y largo-término depresión (LTD) como mecanismos tienen lugar durante el aprendizaje de una nueva habilidad motora, y que el rango de operación sináptica, que se define entre las fronteras limitantes de LTP y la saturación LTD, se modifica 8. Además, se ha demostrado que los marcadores de actividad y plasticidad que promueven moléculas tales como c-fos, GAP-43, o BDNF, sino también de plasticidad moléculas inhibidoras tales como Nogo-A de visualización de funciones de regulación para el aprendizaje relacionadas con la plasticidad neuronal-9-16.
Estos avances hacia una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de aprendizaje motor sólo podrían lograrse con el uso de paradigmas de comportamiento que permiten un control preciso de la adquisición de una nueva habilidad motora, por ejemplo, llegar a la extremidad anterior cualificados. Sólo una tarea conductual bien estructurada permite monitorizar y capturar los cambios correlativos que se producen en el aprendizaje y la ejecución de la tarea en cuestión. Aquí se demuestra visualmente una versión modificada de la extremidad anterior expertouna sola pastilla llegar tarea en ratas adaptados de Buitrago et al. 17 El paradigma presentado permite el análisis de la adquisición de movimiento dentro de una sesión de entrenamiento al día (dentro del período de sesiones), que representa el componente de rápido aprendizaje y adquisición de primaria, así como el aprendizaje motor calificado en varias sesiones (entre sesiones) que representa el componente de aprendizaje lento y mantenimiento de la tarea aprendida 18. Es importante destacar que este paradigma de comportamiento aumenta el grado de dificultad y complejidad de la tarea de habilidades motoras debido a dos características: en primer lugar, las ratas están capacitados para dar vuelta alrededor de su eje después de cada agarre y por lo tanto para realinear su cuerpo antes de la siguiente alcance de pellets y renovar la orientación del cuerpo, impidiendo la ejecución movimiento constante desde el mismo ángulo. En segundo lugar, los gránulos se recuperan de un poste vertical colocado delante de la jaula. Debido al pequeño diámetro del puesto, los pellets pueden ser fácilmente iniciaron requiere un conocimiento preciso para la recuperación y la p exitosareventing sencilla tirando de la pastilla hacia el animal.
Estas pruebas de comportamiento complejo permite una visión más profunda de los mecanismos subyacentes aprendizaje motor. En comparación con los ratones, las ratas son superiores en su desempeño de las tareas de comportamiento complejas y por lo tanto más adecuado para paradigmas complejos tal como se presenta en este estudio. Teniendo en cuenta las crecientes posibilidades genéticas disponibles para ratas 19,20, la combinación de los métodos de prueba de comportamiento precisas y bien controlados con manipulaciones genéticas, imágenes y técnicas fisiológicas representa una potente caja de herramientas para comprender mejor las bases neurobiológicas de aprendizaje motor y la memoria.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de la Oficina Veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza.
1. Animal Manipulación y habituación
- Manejo Animal
Nota: 5 días antes del comienzo del experimento, realizar el paso 1.1.1 diaria.- Para los experimentos de comportamiento, acostumbrar a los animales para el experimentador. Han manejo diario de sesiones que duran 10-15 minutos por animal. Limpie la caja después de la sesión de cada animal.
- Inicialmente, coloque la mano del experimentador en una jaula que permite al animal para explorar y oler a familiarizarse con el experimentador.
- A continuación, levante suavemente el animal con la mano del experimentador de una manera segura sujetando el cuerpo de la rata entre las patas delanteros y traseros que permiten mayor familiarización.
- Pesar cada animal al día para obtener un peso corporal basal antes de la privación de alimentos.
- Aparato habituación y familiarización de Alimentos
- Pesar cada animal al día para obtener un peso corporal basal antes de la privación de alimentos.
- Iniciar alimentos privando ratas 3 días anteriores al inicio del pre-entrenamiento con una dieta estándar de laboratorio. Dé ratas 0,05 g de alimento por 1 g de peso corporal por día (por ejemplo, una rata de pesaje 200 g, comenzar con 10 g de alimento). Asegúrese de peso corporal a no disminuir más de 10% por día mediante el control de peso corporal al día.
- Si varios animales se llevan a cabo en una jaula, ratas dominantes pueden comer más que las menos dominantes. En caso de que el peso del cuerpo de una disminución de los animales, alimentar a los animales por separado en lugar de alimentación de grupos. Danos agua ad libitum.
- Dar a conocer a la rata con el aparato de captación, coloque el animal en el cuadro de la formación (Figura 1). Tener gránulos de azúcar colocados en el cuadro de la formación en la proximidad de la abertura de ranura para familiarizar al animal con las bolitas de comida. Realice este step 10-15 minutos al día durante 3 días.
2. Pre-entrenamiento y aprendizaje de habilidades motoras
- Pre-entrenamiento
- Un día después de la familiarización, coloque el animal en el cuadro de la formación y colocar la pastilla de cerca a la abertura de ranura por lo que se puede llegar por la lengua del animal. Excluir los animales que recuperan pellets con su extremidad anterior durante la pre-entrenamiento
Nota: En esta etapa, la recuperación de pellets con la lengua es crucial y por lo general el método del animal de elección. Los pellets deben ser en ningún caso captado con la extremidad anterior hasta el primer día de aprendizaje de habilidades motoras para permitir un seguimiento adecuado de la tarea de llegar a aprender. La recuperación de pellets con la extremidad anterior durante la pre-formación es un criterio de exclusión y se encuentra en la mayoría de los casos no observados. - Enseñe a la rata ya sea correr hacia la parte trasera de la caja y volver a la abertura de ranura o un paso atrás y girar sobre su propio eje con el fin de recibir la siguiente bola de comida conla lengua. Dé tiempo para que el animal pueda explorar la jaula, correr hacia atrás y volver a la abertura de ranura. Si el animal no se ejecuta correctamente la tarea, utilice una pinza para golpear suavemente en la parte trasera final de la jaula y atraer la atención del animal. Una vez que el animal es en la parte trasera, golpee suavemente en la parte delantera jaula para guiar el animal a la abertura de ranura.
Nota: Una vez que el animal alcanza un valor estándar definido (por ejemplo, 50 recuperaciones de pellets de éxito con la lengua en menos de 15 min), el animal califica para la etapa de aprendizaje de habilidades motoras. El día 1 y 2 de la pre-formación, los alumnos ya pueden distinguirse de los no estudiantes. Los no principiantes pueden ser excluidos del estudio en este paso. Esto disminuye la probabilidad de tener un alto número de no estudiantes durante la etapa de aprendizaje motor (2.2). - Durante la pre-entrenamiento, comida privar ratas con una dieta estándar de laboratorio. Danos agua ad libitum. Vigilar el peso corporal al día durante todo el estudio. HacerNo utilice misma habitación para entrenar ratas machos y hembras. Asegurar un ambiente tranquilo y libre de ruidos para el animal.
- Un día después de la familiarización, coloque el animal en el cuadro de la formación y colocar la pastilla de cerca a la abertura de ranura por lo que se puede llegar por la lengua del animal. Excluir los animales que recuperan pellets con su extremidad anterior durante la pre-entrenamiento
- Determinación de Preferencia de la pata y el aprendizaje de habilidades motoras
- Durante el primer período de sesiones de aprendizaje de habilidades motoras, reemplace la diapositiva en frente de la ventana con un mensaje. Coloque la pastilla de azúcar alrededor de 1,5 cm de distancia de la ventana en el post para que el animal no puede llegar a la pastilla con la lengua, pero sólo recuperarlo por un miembro anterior preciso alcanzar y agarrar el movimiento.
- Para hacer cumplir la recuperación de pellet por la extremidad anterior, utilizar un fórceps para llevar suavemente el sedimento cerca de la boca del animal y retraiga el sedimento mientras el animal intenta consumo con la lengua. Llevar a cabo esta tarea de forma repetitiva hasta que el animal se extiende la extremidad anterior y agarra un pellet.
- Coloque el poste central de la abertura de la ventana. Para determinar la preferencia de la pata, observar cuidadosamente los primeros 10 ensayos en la jornada de formación 1. Más del 70% de la reacintentos hing (es decir, 7 de cada 10) tienen que ser ejecutados con la misma extremidad anterior. Si esto no se logra, continúe con otra ronda de 10 ensayos hasta que se alcanza el umbral del 70%.
- Después de la determinación de preferencias de la pata, cambiar el mensaje hacia la extremidad anterior preferido y alinear central en el borde de la abertura de la ventana. La alineación de la pata preferido significa el poste se desplaza en contra de la respectiva pata para permitir un ángulo óptimo para llegar a (Figura 1B, C).
- Clasifique un juicio, que se define como una nueva pastilla presentado al animal, el mismo éxito (alcanzar, agarrar, recuperar y comer la pastilla), gota (alcanzar, agarrar y perder pellet durante la recuperación) o no (knock pellet en el poste). Tome nota de cada prueba en su hoja y analizar los datos después del experimento.
- Realice una sesión diaria que consiste en un número definido de ensayos (por ejemplo, 150) o un tiempo máximo (por ejemplo, 1 hr) para cada animal.
- Investigar la precisión y la puesta a puntodel movimiento usando primer análisis intento. Un primer intento se define por el agarre del pellet en un solo movimiento monolítico sin interrupción, vacilación o repetición de componentes de movimiento individuales. Observe cuidadosamente cada uno agarre por la rata.
- Si la rata vacila o se retrae durante un alcance o intente varios ensayos para comprender correctamente la pastilla, tenga en cuenta el juicio respectivo como el éxito, pero no el primer intento. Si el animal capta con éxito el precipitado en un solo alcance monolítico, anotar el juicio respectivo tan exitoso primer intento en una columna separada en su hoja.
- Durante el aprendizaje de habilidades motoras, comida privar ratas con una dieta estándar de laboratorio. Danos agua ad libitum. Vigilar el peso corporal al día durante todo el estudio.
- Durante el primer período de sesiones de aprendizaje de habilidades motoras, reemplace la diapositiva en frente de la ventana con un mensaje. Coloque la pastilla de azúcar alrededor de 1,5 cm de distancia de la ventana en el post para que el animal no puede llegar a la pastilla con la lengua, pero sólo recuperarlo por un miembro anterior preciso alcanzar y agarrar el movimiento.
- Para los experimentos de comportamiento, acostumbrar a los animales para el experimentador. Han manejo diario de sesiones que duran 10-15 minutos por animal. Limpie la caja después de la sesión de cada animal.
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Representative Results
Adquisición de habilidades motoras éxito se logra sólo a través de la práctica constante. A pesar de una cuidadosa consideración de todos los aspectos, algunas ratas no aprenden la tarea (Figura 2). Estos "no educandos ya sea carecen de motivación que resulta en pocas o ausentes los intentos de recuperación de pellets desde el inicio del experimento o generalmente pierden interés en llegar a las pastillas que llevan a fallado continuamente intentos. Por el contrario, algunos animales muestran un comportamiento agresivo y más motivado que resulta en precipitada y se lanzaron agarrar intentos que llevan a fracasos. Un tercer grupo de alumnos sin éxito son aquellos animales que comienzan con altas tasas de éxito y no tienen una mejora significativa que conduce al estancamiento o incluso la disminución de las curvas de aprendizaje.
El éxito del aprendizaje de habilidades motoras se compone de dos fases: Un componente rápido aprendizaje que representa la adquisición primaria generalmente observada en el primer día de entrenamiento del motor (dentro del período de sesiones;
Para analizar el rendimiento durante cada uno (análisis dentro del período de sesiones) diario de sesiones, dividir el número total de ensayos en 25 contenedores de prueba (por ejemplo, 6 contenedores de 150 ensayos). Después del experimento, calcular el porcentaje de gránulos comprendido con éxito para cada bin dividiendo el número de éxitos en el bin respectiva por el número total de ensayos en el día respectivo.
Debe tenerse en cuenta que la adquisición de habilidades motoras puede variar entre los animales individuales. Diferentes ratas necesitan diferentes cantidades de días para alcanzar el nivel meseta. Por lo tanto, las curvas individuales de aprendizaje son habitualesly no tan suave como la curva de aprendizaje medio.
Otra expresión de aprendizaje motor éxito es el análisis del aprendizaje motor afinado. Para evaluar este aspecto, que mide el número de pastillas comprendido en el primer intento durante un movimiento monolítico sin vacilación ni interrupción en comparación con todas las bolitas medidos con éxito (Figura 5).
Los ejemplos en la Figura 2 - 5 muestran las curvas de aprendizaje de 150 gránulos comprendido / día en el transcurso de 6 días. Día 1 se refiere a la primera día de aprendizaje motor.
Figura 1: Diseño de la caja entrenamiento rata (A) El cuadro de la formación, con sus respectivas dimensiones.. Para evitar la recuperación de pastillas que se perdieron en el interior de la caja, el suelo de la cámara de la formación es de barras de metal , A través del cual perdieron gránulos caen. (B) Vista cercana de la abertura de hendidura y el puesto. Observe la posición del puesto alineado central para la apertura de hendidura. (C) Ejemplo de una rata agarrando con éxito un pellet a través de la abertura de ranura. Tenga en cuenta la posición de poste cambiado y el ángulo resultante hacia la extremidad anterior preferida del animal (en este caso la derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Ejemplo de un animal que no exhibió exitosa adquisición de la habilidad de motor en el transcurso de 6 días La tasa de éxito se estanca alrededor de 20% con ninguna mejora en la formación.
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Figura 3: análisis Dentro-día del mismo ejemplo como se muestra en la Figura 4. La tasa de éxito se divide en 6 contenedores de 25 gránulos que ilustran la mejora en el aprendizaje motor a lo largo de una única sesión diaria. Tenga en cuenta la tasa de éxito inicial durante los primeros 25 ensayos de los primeros 2 días en comparación con la tasa de éxito promedio de los respectivos días de la Figura 4, así como la mejora general dentro de 1 día y 2 en comparación a la Figura 4.
Figura 4:. Ejemplo de un animal con una curva de aprendizaje típica, con éxito a lo largo de 6 días El porcentaje de bolitas captado con éxito (tasa de éxito) aumenta durante los primeros 3 días y alcanza una meseta durante los días restantes.
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Discussion
El paradigma se muestra en este estudio es una adaptación de Buitrago et al 18 y difiere de la pastilla única clásica alcanzar paradigma 17 principalmente en dos aspectos.:
En primer lugar, el estudio de mejora dentro de la sesión permite el análisis de la tarea aprendida dentro de un solo día, que puede proporcionar un nivel diferente de la información, tales como la investigación del componente de aprendizaje rápido en comparación con el componente de aprendizaje lento representada por los valores promedio diario (ver Figuras 3 y 4). En segundo lugar, el paradigma de comportamiento presentado aquí aumenta el grado de dificultad y complejidad de la tarea de habilidades motoras. El animal se ve obligado a realinear su orientación cuerpo y alcanzar antes de cada recuperación de pellet. Esto evita sencilla ejecución movimiento repetitivo desde el mismo ángulo y requiere profunda orientación espacial. Por otra parte, los gránulos se recuperan de un poste vertical delgada que se coloca delante de le jaula y coincide con el diámetro de la pastilla por lo que requiere una comprensión precisa para la recuperación exitosa y prevenir sencilla tirando de la pastilla hacia el animal.
Un paso importante es enseñar al animal a correr hacia la parte trasera de la caja y volver a la abertura de ranura durante el pre-entrenamiento. Haciendo alusión a la rata a la ubicación deseada mediante el uso de un fórceps y golpeando suavemente en el panel posterior de la jaula de ayuda al animal a entender la tarea. El experimentador debe utilizar esta herramienta con cuidado ya overtapping produce demasiado ruido e irrita el animal. Una vez que la rata ha vuelto a la parte delantera de la jaula, colocar varios gránulos de azúcar en la abertura de ranura para que el animal se acostumbre con el sabor, olor y la ubicación de la pastilla. Otro paso importante es la recuperación de pellets con la extremidad anterior en el primer día de aprendizaje motor. El animal suele continuar los intentos de recuperar el pellet con la lengua como aprendido durante el pre-entrenamiento. Usando un fórceps para llevar suavemente THe pellet cerca de la boca del animal y la retracción de la pastilla, mientras que el consumo de los intentos de los animales con la lengua cumplir la rata para estirar la extremidad anterior para la recuperación de pellet éxito. El objetivo es que el animal pueda captar el sedimento de la pinza usando la extremidad anterior y recuperar la pastilla de azúcar hasta su desembocadura. Una vez que esto se ha logrado, los pellets se pueden colocar en la determinación de la preferencia de correos y la pata se puede evaluar. Estos dos pasos son las partes más importantes de todo el experimento y requieren un enfoque cuidadoso al animal, así como la paciencia del experimentador.
Es importante señalar que existen diferencias en el aprendizaje entre los animales individuales y entre el género (varones aprenden más lento que las hembras 18) y cepas (de acuerdo con nuestra observación, las ratas Sprague-Dawley utilizados en este estudio y Long-Evans ratas muestran aprendizaje superior en comparación con por ejemplo, ratas Lewis). Por lo tanto, a fin de satisfacer el reto requierenmentos de la tarea, las tasas de éxito pueden requerir modificaciones del paradigma en función del sexo y la tensión. Para mantener la baja varianza, no mezcle las cepas y de género en una serie experimental.
Bien estructurados y los paradigmas de comportamiento controlables son de crucial importancia para los estudios que investigan los correlatos celulares mecanismos de conducta patológica y fisiológica subyacentes. Los más complejas tareas de comportamiento que las ratas son capaces de aprender representan una ventaja importante de las ratas sobre ratones. Los continuos avances en tecnologías para la manipulación genética de la rata permitirán en un futuro muy próximo para llevar a cabo experimentos en ratas que fueron hasta el momento sólo es posible en ratones 19-21. En combinación con nuevas tecnologías de la imagen y las técnicas que permiten la manipulación selectiva de los circuitos neuronales, los paradigmas de comportamiento en ratas pueden abrir nuevos caminos hacia la comprensión de los principios fisiológicos y patológicos de las funciones del sistema nervioso.
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Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (Grant 31003A-149315-1 de MES y de Grant IZK0Z3-150809 a AZ), a la Fundación AZ Heidi Demetriades, al MES Consejo Europeo de Investigación ('Nogorise') y el Christopher y Dana Reeve Fundación (CDRF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Training box | Self Made | ||
| Pedestal | Self Made | ||
| Sugar pellets | TSE Systems Intl. Group | 45 mg dustless precision pellets | |
| Sprague Dawley rats | 5-6 week old males | ||
| Laptop computer | Hewlett Packard | ||
| Stop Watch | |||
| Forceps | Fine Science Tools (FST) | ||
| Excel | Microsoft | ||
| Prism | GraphPad | ||
| Weighing scale | |||
| Counter |
References
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