Protocol
Протокол должен осуществляться в строгом соответствии с национальным и международным законодательством и местными правилами. Кровь от здоровых доноров, которые дали свое согласие сдавать кровь для исследовательских целей, была получена из переливанию центров крови, с которыми институты подписали соглашение. Специальные средства защиты должны быть приняты при использовании человеческой крови. Эксперименты с ВИЧ-1, должны быть выполнены в уровне биологической безопасности 3 или 2 (BSL-3 или 2) Laboratory в соответствии с местным законодательством.
1. Подготовка человеческих моноцитов макрофаги (hMDMs) по плотности градиентное центрифугирование и селекции адгезией
- Начнем с свежей крови здоровых доноров (9 мл). Развести весь объем свежей крови стерильной 1х фосфатно - солевым буфером (PBS) без Са 2+ и Mg 2+ , для получения конечного объема 70 мл и осторожно добавить разбавленную кровь в две 50 мл конические пробирки (35 мл на пробирку) , на вершине 15 мл смесиeutral, сильно разветвленные, с высокой массой, гидрофильный полисахарид в растворе уже в каждой пробирке.
- Центрифуга обе трубки крови при 537 мкг в течение 20 мин при 20 ° C без тормоза. Затем собирают мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) , содержащихся в пасмурную кольце клеток на границе раздела фаз и перенести их в новый 50 мл пробирку , содержащую 15 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+.
- Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при 20 ° С и ресуспендируют осадок в 45 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+.
- Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С, вновь суспендируют таблетку в 10 мл 1x PBS без Са 2+ и Mg 2+, и подсчитывать клетки путем разбавления до окончательного разведения 1/200 в трипановым синим.
- Центрифуга клетки при 218 х г в течение 5 мин при 20 ° С и ресуспендируют осадок в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, дополненной 2 мМ L-глутамина и 100 мкг / мл PenicIllin-стрептомицин иметь 7 х 10 6 РВМС на лунку в объеме 2 мл среды в каждую лунку 6 луночного планшета.
- Инкубируйте пластин при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 2 часов. Через 2 ч моноциты будет приклеен к пластмассе.
- Для того, чтобы позволить свеже-изолированные моноциты дифференцируются в hMDMs, аспирата среду и заменить его на 2 мл hMDM среды (RPMI 1640, 10% decomplemented фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллин-стрептомицин), дополненной рекомбинантный человеческий колониестимулирующий фактор макрофагов (RHM-CSF), в конечной концентрации 10 нг / мл.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 11 дней (Рисунок 1).
- На 11-й день удалить среду и промывки 2 раза 2 мл холодной hMDM среды на лунку. Затем промыть каждую лунку 2 раза 1 мл холодной 1x PBS.
- Чтобы отделить полностью дифференцированные hMDMs, промойте каждую лунку 1 раз с 1 мл холодной 1x PBS с 2 мМ ethylenediaminetetraacetatic кислоты (ЭДТА) и инкубировать клетки в 2 мл холодной 1x PBS с 2 мМ ЭДТА на лунку в течение 15-60 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: Альтернативные методы для отсоединения существуют клетки (например, трипсин или трипсиноподобной деятельность) , которые могли бы дать хорошие результаты 11. - После того, как отряд (завершенного пипеткой осторожно вверх и вниз в скважине), собирают клетки и поместить их в 50 мл пробирку на льду, содержащую 10 мл холодной hMDM среды.
- Центрифуга клетки при 218 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С, вновь суспендируют таблетку в 10 мл холодной hMDM среды, и подсчет клеток путем разбавления 1/20 в трипановым синим.
- Семенной клеток в количестве 1 х 10 6 hMDMs на 35 мм микроскопию класса со стеклянным дном тарелки и инкубировать пластин при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 1 дня.
2. Производство и Количественное ВИЧ-1 Вирусные запасов
Примечание: NLR4.3 ВИЧ-1 Gag-iGFP (зеленый флуоресцентный белок), несущий R5-тропные конверт, подарок от М. ШиндльER 10 используют для инфицирования макрофагов и видеть инфицированных клеток в режиме реального времени.
- Продуцировать вирусные запасы путем трансфекции клеток эмбриональной почки человека 293T (2 х 10 6 в 100 мм чашку) с 6 мкг соответствующего провирусной ДНК с использованием коммерческого реагента для трансфекции.
- Количественно инфекционность вируса натуральной оспы с использованием индикаторных клеток HeLa ПЗМ-бл (несущий ген бета-галактозидазы под контролем LTR HIV-1) с использованием серийных разведений вирусных акций, за которыми следует бета-галактозидазы окрашиванию клеток и подсчета голубые клетки 12.
3. Заражение hMDMs с ВИЧ-1
- Добавьте вирус при множественности инфекции (MOI) 0,02-0,03 в 1 мл среды hMDM к hMDMs (посеянных клеток в 1.13). Для того, чтобы контролировать лунки добавляют только 1 мл hMDM среды и инкубировать блюда при температуре 37 ° С с 5% СО 2 в течение 2 -х дней (рисунок 1).
- В день 2 мыть клетки с hMDM медНМУ 3 раза и добавляют 1 мл свежей среды hMDM на чашку. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 6 дней (рисунок 1).
4. Опсонизация овец Эритроциты
- Для приготовления 7 х 10 6 SRBCs на чашку, промойте SRBCs два раза в 100 мкл раствора , содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS с 1х центрифугированием при 600 х г в течение 4 мин.
- Ресуспендируют отмытых SRBCs в 500 мкл 1X PBS / БСА 0,1% кроличьим IgG анти-SRBCs на суб-агглютинации концентрации на 5 мкл SRBCs и инкубировать с вращением при комнатной температуре в течение 30 мин.
Примечание: Чтобы определить суб-агглютинации концентрации анти-IgG SRBCs, готовят серийные разведения IgG (концентрации акций по 13,1 мг / мл) от 1/50 до 1/25600 в 20 мкл в 96-луночный планшет. Добавить 2 × 10 6 SRBCs в 20 мкл в каждую лунку и положить пластину в темной комнате в течение нескольких часов. Концентрация суб-агглютинированная являетсяразведение скважины непосредственно перед хорошо агглютинации (IgG + SRBCs формирования сети). - После того, как вращение, центрифугировать IgG-опсонированных-SRBCs при 600 х г в течение 4 мин и промывают 100 мкл 1X PBS / БСА 0,1% с центрифугированием при 600 х г в течение 4 мин.
- Ресуспендируют IgG-опсонированных-SRBCs в предварительно нагретый среде без фенолового красного RPMI, дополненной 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (1 мл / чашку).
5. Живая Cell видеомикроскопия Фагоцитоз Assay
- С помощью конфокальной системы формирования изображения , таких как система , вращающийся диск , снабженный нагревательной камере при температуре 37 ° С с помощью СО 2 проходит через бутылку с водой для увлажнения воздуха.
- Включите камеру нагрева до эксперимента, чтобы иметь предметный столик микроскопа при 37 ° C перед началом анализа фагоцитоза. Включите микроскоп и компьютер, и загрузить программное обеспечение визуализации.
- Оптимизация параметров обработки изображений, такие как скорость сканирования, Магнификатаион, разрешение и т.д. , чтобы иметь по меньшей мере одну ячейку на поле и изображения по одному кадру каждую минуту от 60 до 120 мин.
Примечание: В данном случае образец проецируется на один кадр каждую минуту в течение 60 мин с 63x объективом. - Поместите блюдо на изображения столик микроскопа. Отрегулируйте фокусировку и место, чтобы найти только одно целое инфицированных ВИЧ-1 макрофагов в поле. Используйте соответствующие параметры возбуждения / выбросов на основе используемой системы формирования изображения и зонда. Включите канал светлого поля (BF) для наблюдения фагосомах (рис 1II). Оптимизация внешнего вида различных изображений каналов, регулируя процент пропускаемого света и времени экспозиции.
Примечание: Здесь NLR4.3 ВИЧ-1 Gag-iGFP был возбужден с использованием 491 нм лазер с 50 мс выдержки времени с 20% лазера (рис 1i). - Удалить блюдо изображений и добавить 1 мл ЭБ суспензии при 7 × 10 6 SRBCs / мл на блюдо (рисунок 1).
- Центрифуга при 500 мкг в течение2 мин при комнатной температуре, чтобы синхронизировать фагоцитоз, записывать время в конце этого центрифугирования и вернуть блюдо на сцену.
- Оптимизация фокусировки и съемки GFP и BF изображения в Z-стеки (по всей толщине ячейки с шагом расстояния 0,3 мкм - как правило, 20 самолетов) каждую минуту в течение не менее 1 ч. Сохраните замедленную видео в родном файле формата используемой системы формирования изображения.
Примечание: Здесь, покадровой фильмы были сохранены в собственном формате, * .stk файлы.
6. Анализ ЗАМЕДЛЕННАЯ Фильмы
- Для редактирования видео, нажмите на выпадающее меню "Приложения" и на вкладке "Обзор многомерные данные" в программное обеспечение для редактирования видео.
- Чтобы открыть файл, нажмите на кнопку "Select Base File", а затем на "Select Directory". В "наборы данных" окне выберите приобретение для анализа (на .nd формате) и нажмите на кнопку "View". Данные представлены в виде таблицы с течением времени в колонкуd Z-план в линии.
- Для того, чтобы представить инфекцию в Z-проекции (рис 2, левые панели), выберите 491 нм в поле "Wavelengths" и нажмите на вкладку "проекции Z" с "всех плоскостей».
- Для анализа временной последовательности, выберите BF длину волны в поле "Длины" и выбрать оптимальную плоскость на Z-оси , чтобы различать внешние SRBCs (рисунок 2, красный Arrowhead), внутренние SRBCs (рисунок 2, красный круг) и ядро ( Рисунок 2, синий круг).
- Для сохранения видео монтажи, нажмите на вкладку "Выбор [Х]", а затем на "Load Image (ы)". И, наконец, сохранить загруженные изображения в формате .tif и открывать их рядом на программное обеспечение ImageJ.
- Используйте плагин "Manual Tracking" на программное обеспечение ImageJ для измерения положения ядра и различные фагосомах наблюдаемые в BF канала (рисунок 3).
- Доуnload "Ручной отслеживания" плагин на веб-сайте ImageJ. На ImageJ, откройте плагин и последовательность изображений для анализа (рисунок 3, шаг 1 и 2).
- Введите параметры , такие как "интервал времени" , который представляет количество времени между соседними кадрами, а "х / у калибровки" , которая представляет собой расстояние на пиксель (рисунок 3, стадия 3).
Примечание: Здесь, сохранить последовательность изображений с временным интервалом 1 мин между каждым кадром и х / у калибровки 0,205 мкм , так как масштабирование 63X и камеру с размером пикселя 6,45 х 6,45 мкм 2 используются. - Чтобы начать отслеживание, нажмите на кнопку "Добавить трек" (рисунок 3, стадия 4) и нажмите на ЭБ центре в первый раз , когда она была усвоена. Следующий кадр появляется автоматически.
- Продолжайте нажимать на ЭБ центра во всех кадрах , чтобы иметь различные позиции в течение времени (рисунок 3, пункт 6 в красной коробке).
- Начните отслеживать ядро, чтобы иметь свою позицию во всех кадрах, щелкнув по его центру. Далее отслеживать фагосомах (щелкнув по его центру) один за другим, в то время (кадр) их интернализации, различны в зависимости от SRBCs. Для удобства , чтобы увидеть SRBC на BF канале, используйте окно "Яркость и контрастность" во время отслеживания (рисунок 3, шаг 5).
- Между каждым ЭБ слежения, нажмите на кнопку "Добавить трек" (рисунок 3, стадия 4) , чтобы иметь новый трек. Номер отслеживания будет изменен во второй колонке, "Трек N °" из таблицы результатов (рис 3, стадия 6).
- Сохранение данных в электронной таблице, чтобы перейти к следующему этапу анализа.
- Используйте программное обеспечение работы с электронными таблицами для расчета пройденного расстояния фагосомах , содержащих SRBCs к ядру и скорости фагосомах в течение первых 5 мин после интернализации SRBCs (Fi4 цифра).
- Откройте электронную таблицу и новый файл электронной таблицы. Переход в этот новый файл только следующие параметры, время, х- и у- координаты ядра и всех SRBCs (рис 4а).
- Для того, чтобы вычислить расстояние между SRBCs и ядром только с их координатами, рассмотрим ядро и SRBC в XY-координатной плоскости (рис 4В).
Примечание: Расстояние между двумя точками является длина пути, соединяющего их. В плоскости, расстояние между ЭБ и ядром дается теоремой Пифагора.- Если с (расстояние между ядром и ЭБ) обозначает длину гипотенузы и а и Ь обозначают длины двух других сторон, выражают теорему Пифагора в качестве Пифагора уравнения:
Примечание: В то же время, на ортонррмированными, расстояние по горизонталиа есть (х ядро -х ЭБ) и вертикальное расстояние Ь (у ядра -y ЭБ). - Таким образом, вычислить расстояние между ядром и ЭБ (рис 4A, фиолетовый коробка) путем:
Примечание: Умножьте полученное значение расстояния (в пикселях) при калибровке х / у, чтобы расстояние в мкм. Здесь, калибровка х / у составляет 0,205 мкм. - В каждый момент времени, вычесть расстояние между ядром и ЭБ до начального расстояния (рис 4в).
- Участок измерения от времени, в течение первых 5 мин. Применить линейный тренд-линии (рис 5А) на участке и определить наклон линейного тренда линией , которая представляет скорость фагосоме к ядру в течение первых 5 мин после ЭБ интернализации.
- Разобрать данные для расчета средней и статистическую погрешностьзначения скорости и построить их в соответствующей форме с использованием соответствующего программного обеспечения (Рисунок 5Б).
- Если с (расстояние между ядром и ЭБ) обозначает длину гипотенузы и а и Ь обозначают длины двух других сторон, выражают теорему Пифагора в качестве Пифагора уравнения:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FCR-опосредованный фагоцитоз ВИЧ-1-инфицированных и неинфицированных hMDMs описано здесь с использованием IgG-опсонированных SRBCs в качестве модельных целей (Рисунок 1). Критические шаги этого протокола являются подготовка hMDMs и инфекция ВИЧ-1. Действительно, урожайность и качество дифференцированных макрофагов варьирует среди доноров, а также уровень инфекции с КПД в диапазоне 10-40%. Кроме того, препарат IgG-опсонизированного-SRBCs Важно также, чтобы избежать повреждения эритроцитов, так как это может вызвать их признание и поглощение как мусор вместо того, чтобы с помощью FcR-опосредованного фагоцитоза. Оптимальное опсонизация обеспечит эффективное фагоцитоз.
Движение фагосому в живых ВИЧ-инфицированных макрофагах анализируется в режиме реального времени с BF канала на вращающемся диске конфокальный микроскоп в лаборатории BSL-3. Настройки канала BF имеют решающее значение тO увидеть ядро (рисунок 2, синий круг) и для распознавания внешнего (рисунок 2, красные стрелки) от интернализированного SRBCs (рисунок 2, красные кружки). BF микроскопия считается простейшей оптической микроскопии методом освещения, достаточного, чтобы увидеть фагосомах, которые являются менее преломление, чем внешние SRBCs.
Первым шагом после приобретения последовательностей изображений является ручное отслеживания на программное обеспечение ImageJ (Рисунок 3). Эта точка может быть особенно долгим и утомительным, поскольку предпочтительнее отслеживать каждую фагосоме, по одному для всех последовательностей изображений, и считается, что эксперименты должны быть повторены по крайней мере 3 доноров в состоянии достичь достаточно большого размера выборки для статистический анализ (по крайней мере, 30 фагосомы с 3-х различных доноров).
Вторым шагом является анализв электронную таблицу программного обеспечения для расчета скорости фагосоме в течение первых 5 мин после интернализации для каждого интернализированных SRBCs (рисунок 4). Для этого мы наносим для каждого фагосоме расстояние, пройденное в течение первых 5 мин против времени. Типичный пример показан в неинфицированных hMDMs на рисунке 5А. Далее мы получаем скорость фагосомы, что наклон линейной кривой регрессии. Скоростью 0.5384 мкм / мин было найдено для этого фагосоме.
Следует отметить, что можно анализировать скорость фагосому в течение первых нескольких минут после интернализации, как описано здесь или в Dumas и др. 8, или позже, анализируя скорость в течение более длительных сроков. В нашем исследовании мы обнаружили , что скорость фагосоме в течение первых 5 мин после интернализации у ВИЧ-инфицированных hMDMs ниже по сравнению с неинфицированных hMDMs (Рисунок 5б).
Рисунок 1. Подготовка контроля и ВИЧ-инфицированных hMDMs для визуализации фагоцитоза. Моноциты очищали с помощью адгезии (1) и дифференцируются в макрофаги , в течение 11 дней с M-CSF (2). Затем hMDMs инфицируют NLR4.3 ВИЧ-1Gag-iGFP I) при MOI от 0,02 до 0,03 в течение 8 дней с промывкой на 2-й день (3). (4) IgG-опсонированных SRBCs добавляются на hMDMs фагоцитоза в течение 1 часа. В фагосомы содержащие SRBCs могут быть обнаружены на BF изображений (красный круг, б). Изображения из базы данных Servier изображений. Bar = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Приобретение в режиме реального времени во времяфагоцитоз репрезентативного контроля и ВИЧ-инфицированных hMDMs. hMDMs получают и инфицировали , как описано на рисунке 1. В NLR4.3 ВИЧ-1Gag-iGFP инфицированные клетки обнаруживаются с 491 нм лазером. Z-стеки вращающийся диск конфокальной изображений получены и проанализированы с использованием как программное обеспечение, приобретение микроскопа и ImageJ (слева панели). Галереи изображений BF представляют собой неинфицированных (верхние панели, соответствующие Movie 1) и NLR4.3 ВИЧ-1Gag-iGFP Зараженный (нижние панели, соответствующие Movie 2) клеток при приобретении 45 мин (46 изображений с течением времени, указанных в качестве чч : мм). Клеточная мембрана (пунктирная черная линия), ядро (синий круг), внешние SRBCs (некоторые из них указаны с красными наконечниками) и внутренние SRBCs (некоторые из них обозначены красными кругами) могут быть обнаружены на BF изображениях. Bar = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Инструкция шаги для анализа изображений с ручной плагин отслеживания на ImageJ. После открытия "Руководство отслеживания" плагин (1) и загрузки замедленную видео в BF канала (2), ввести параметры (3) приобретения. Нажмите на кнопку "Добавить трек" (4) и начать измерение отслеживания, нажав на одну фагосоме (5), чтобы получить новое окно с X и Y позиции выбранного фагосоме (6, красная коробка). Чтобы следовать фагосомы на временной последовательности для удобства, изменять яркость и контрастность (5 '). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
фигура 4. Шаги инструкции для анализа данных фагосом скорости миграции в электронных таблиц. (A) Установите X и Y положение ядра и каждый фагосоме (красный прямоугольник) в виде таблицы с электронными таблицами. В другой колонке (фиолетовый ящик), вычислить расстояние между фагосомы и ядром с теоремой Пифагора , где с представляет собой длину между ядром и ЭБ и а и б длин двух других сторон прямоугольного треугольника ( Б). (C) Наконец, вычислить расстояние , пройденное фагосомах в каждый момент времени (зеленый ящик) путем вычитания расстояния между ЭБ и ядром в данный момент времени от начального расстояния во время 0. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Количественное фагосом скорости миграции в контроле и ВИЧ-инфицированных hMDMs. (А) для каждого ЭБ и только после того, как ЭБ интернализации, пройденное расстояние по направлению к ядру измеряется и в виде зависимости от времени. Его скорость в течение первых 5 мин рассчитывается с использованием линейной регрессии в электронных таблиц. Представитель эксперимента показан (внутренний ЭБ на Рисунке 3-4). (B) Все скорости в течение первых 5 мин измеряют в течение 66 фагосомах в неинфицированных (5 доноров) и 60 фагосомах у ВИЧ-инфицированных клеток (4 доноров). Данные представляют собой среднее значение ± SEM (тест т Непарное Стьюдента с коррекцией Уэлша; **, P <0,01). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: фагосоме движение в представительном неинфицированным макрофагами. . (Нажмите правой кнопкой мыши , чтобы скачать) Движение опсонированных красных кровяных клеток был обнаружен в BF канале в течение 45 мин фагоцитоза с одного изображения в минуту (46 изображений с течением времени , как указано чч: мм). Бар = 10 мкм.
Фильм 2: фагосоме движение в представителя ВИЧ-инфицированных макрофагах. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). ВИЧ-1 (NLR4.3 ВИЧ-1 Gag iGFP) -infected макрофаги были идентифицированы после освещения с 491 лазера. Движение опсонированных красных кровяных клеток был обнаружен в BF канала в течение 45мин фагоцитоза с одного изображения в минуту (46 изображений с течением времени, как указано чч: мм). Бар = 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод имеет несколько важных шагов. Во-первых, подготовка hMDMs и их заражение ВИЧ-1 является критическим, поскольку процент заражения зависит от донора. Следует отметить, что мы решили использовать макрофаги, которые не поляризован в пробирке до инфицирования, поскольку статус макрофагов потенциально , с которыми сталкиваются вируса в естественных условиях не был хорошо охарактеризован до сих пор. Мы проверили экспрессию нескольких поверхностных маркеров, что указывает, что макрофаги не являются ни М1, ни М2, и проверены на экспрессию CD4 и CCR5. Скорости инфекции являются переменными и варьируются от 10 до 40%, а иногда и ниже. Эта переменная частота инфицирования почему это может быть трудно найти инфицированных ВИЧ-1 флуоресцентного hMDM под микроскопом. Кроме того, время, необходимое, чтобы сразу найти инфицированных ВИЧ-1 клетки после стадии центрифугирования может также привести к задержке начала приобретения. Фагоцитоз может быть начато без synchronizatioп связывания и поглощения генерируется путем центрифугирования. Однако этот вариант не был выбран для SRBCs, которые плавают до достижения клеток. Это может быть хорошим вариантом с бисером. Для того, чтобы свести к минимуму время, необходимое, чтобы найти инфицированные клетки, с сеткой со стеклянным дном тарелки могут быть использованы для выявления инфицированных ВИЧ-1 hMDMs, прежде чем продолжить, чтобы начать анализ фагоцитоза. Отобранные клетки ВИЧ-инфицированных, у которых есть "разумное" количество SRBCs вокруг них будут затем быстро выбраны, чтобы начать приобретения. "Разумные ЭБ количество" означает достаточно, чтобы иметь по крайней мере 10 SRBCs на клетку и не слишком много, чтобы предотвратить внешние SRBCs от маскировки фагосомах.
Кроме того, важно, чтобы оптимизировать условия Опсонизация для обеспечения будет эффективным распознавание и поглощение клетками. FCR-опосредованный фагоцитоз конститутивный и hMDMs обычно очень эффективны в FcR-опосредованного поглощения. Кроме того, для правильной фагоцитоза, условия должны бе оптимален с нагревательной камере при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Необходимо проверить газ и температуры перед началом анализа фагоцитоза.
Наконец дискриминация внешних SRBCs от внутренних фагосомах и определение ядра в канале BF имеют большое значение для анализа на программное обеспечение ImageJ. Поэтому настройки данного канала имеют важное значение. Учитывая, что основное внимание может быть потеряно во время приобретения, мы рекомендуем приобрести стопок изображений по оси Z, чтобы быть уверенным, чтобы иметь оптимальную плоскость для анализа скорости фагосоме. Предпочтительно, чтобы иметь одну ячейку в одном поле, чтобы проанализировать все усвоенные SRBCs для каждой ячейки. Поэтому выбор объектива важен и здесь мы использовали 2 объектива в зависимости от размера ячейки. Это было легче для нас, чтобы отслеживать фагосомах с объективом 100X, но иногда клетки были слишком большими, поэтому мы должны были перейти на объектив 63x. Выбор объектива также имеет важное значение, когда речь идет о имАнализ возраста с использованием ImageJ и электронную таблицу, потому что обе линзы вовлекают различных х / у калибровок.
Первое ограничение этого метода является то количество выборок, которые должны быть приобретены, чтобы иметь статистически значимых результатов. Мы можем зарегистрировать несколько фильмов на один донор, но, как правило, не более 2-х клеток в состояние, на чашку. Решения этого ограничения, чтобы увеличить количество образцов повторить эксперименты с большим количеством доноров или сделать многоточечной XY изображений в зависимости от микроскопа. Неудобство последнего способа является потенциальная потеря фокуса во время моторизованной сканирования XYZ. Другим ограничением является то, что руководство количественная оценка скорости является долгим и утомительным по сравнению с автоматизированного анализа. Для полного автоматизированного анализа, необходимо использовать флуоресцентно меченных частиц, как сообщается в пионерских исследованиях 4 с латексными шариками , в сочетании с желатином рыбьей кожи, которые следуют с алгоритмом отслеживания на программное обеспечение MatLab, Флуоресцентно меченого антитела opsonizing или шарики могут быть альтернативой, но они подвержены обесцвечиванию, что является проблемой при записи фагоцитоза в течение 1 часа. Другие исследования сообщают об использовании латексных шариков 13,14. Однако мы заметили, что интернализация латексных шариков менее легко обнаружить, чем поглощение SRBCs. Действительно отправной точкой кинетики внутриклеточного миграции важно знать, чтобы обнаружить ранние дефекты в движении phagosomal.
Основное преимущество метода, описанного здесь, является его простота и использование свободного программного обеспечения. Для выполнения ручной трекинг с помощью программного обеспечения ImageJ, мы должны использовать позицию фагосомы и ядра, таким образом, мы должны использовать теорему Пифагора для вычисления расстояния между фагосомы и ядром, и иметь скорость после того, линейной регрессии в электронных таблиц. Этот анализ 3 шага может быть сведена к одному шагу, отслеживая, на обледеневших программного обеспечения с & #34;. Руководство слежения "плагин Выходные данные затем непосредственно скорость частицы следовать, и более конкретно, относительная скорость между 2 группами (например, фагосомах и ядра) Наконец, расчет позволяет измерить относительную скорость. одна частица по сравнению с другой частицей, которая также может перемещаться.
Потенциальное применение в будущем этого анализа покадровой жизни может быть для частиц, видимых в светлом поле, как бактерии, грибы, или остатков клеток. Различные методы лечения или условия инфекции, достаточные для изменения phagosomal созревания и свойства активации макрофагов выиграют от такого утонченного анализа движения phagosomal по направлению к центру клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
