Summary
ここでは、フローサイトメトリーによって、アレルゲン負荷された粒子を定量化するためのプロトコルを提示します。周囲の粒子状物質の粒子は、吸着されたアレルゲンの担体として作用することができます。我々は、直径0.5ミクロン>広く懸濁固体を特徴付けるために使用される方法、フローサイトメトリーことをここに示す、これらのアレルゲン負荷された粒子を測定するために使用することができます。
Abstract
フローサイトメトリーは、広くそのような0.5から直径数十μmのサイズ範囲の細胞や細菌などの懸濁固形物を定量化するために使用される方法です。前方および側方散乱特性の特徴に加えて、それぞれの構造物を検出するための抗体のような蛍光標識されたマーカーの使用を可能にします。間接抗体染色を用いて、フローサイトメトリーは、カバノキ花粉アレルゲン（正確にベットV 1）を定量化するために、ここで採用されている吸入可能な粒子状物質（PM10、直径の粒径≤10μm）の中で0.5直径10μmの粒子を-loaded。 PM10粒子は、吸着アレルゲンのキャリアは、おそらくそれらがアレルギー反応を引き起こす可能性下気道、それらを輸送するように作用することができます。
これまでPM10のアレルゲン含量を、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）および走査型電子顕微鏡を用いて研究されてきました。 ELISAは、粒子を溶解しない対策します結合型アレルゲン。さらに、それらを定量化することができるフローサイトメトリー、アレルゲン負荷された粒子を可視化することができる走査型電子顕微鏡に比べ。周囲の空気のアレルゲン含量は、カバノキ花粉数から逸脱することができますように、アレルギー症状は、おそらく花粉数よりもアレルゲン曝露とのより良い相関性があります。臨床データと併せて、提示された方法は、花粉抗原をカバノキするアレルギー反応が>0.5μmのPM10粒子のBET V 1アレルゲン含量と関連しているかどうか、将来の実験でテストする機会を提供しています。
Introduction
大気汚染は、最近の数十年間1-3で観察された呼吸器アレルギーの発生率の増加と重症度の重要な環境要因として考えられています。また、ダスト4,5における共通アレルゲンの分布への関心の高まりがありました。
白樺花粉は、花粉症を引き起こすことができるだけでなく、アレルギー性喘息6-8の重要なトリガーすることができます。全体シラカバ花粉は、下気道に入るか、そのサイズ（直径22ミクロン）の結果として、PM10に発見されない可能性があります。しかし、ベットV 1、主要なカバノキ花粉アレルゲンコンポーネントなどのシラカバ花粉アレルゲンは、花粉の破裂9の後に放出させることができ、周囲の空気粒子に10を結合することができ、したがって、おそらく下気道気道を入力します。実際、花粉アレルギーの発端者11からの好塩基球のインビトロ活性化によって示されるようにPM10は、生物学的に活性なアレルゲンを含有することができることが示されました
PM10試料中のベットV 1アレルゲン含量は、ELISA 12~14とそれぞれのアレルゲンおよびその後の定量を抽出することによって研究されています。 ELISA法を用いて、溶解したアレルゲンを測定したが、アレルゲン負荷された粒子の量は、依然として不明のままでした。走査電子顕微鏡は、アレルゲン負荷された粒子を明らかにしたが、定量10,15を許可していませんでした。
この研究は、大気サンプル中のBet V1を装填PM10粒子の割合を定量化するためにフローサイトメトリーを使用します。フローの検出限界に起因するだけでは0.5μm以下を検査することができる粒子サイトメーター。 PM10の> 0.5μmの画分は、さらにPM10> 0.5と呼ぶことにします。
Protocol
注：このプロトコルは、ベットV 1、主要なカバノキ花粉抗原成分に加え、アロフィコシアニン（APC）に対するモノクローナル抗体（モノクローナルマウスIgG1抗体、クローンMA-3B4）とのPM10粒子の間接的な染色を記述するには、二次抗体を標識（抗-mouse IgG1抗体、クローンA85-1）とフローサイトメーター上でその後の分析。使用可能な適切な他の抗体を用いて、この方法は、周囲の空気粒子に結合した他の抗原の検出に拡張されるかもしれません。
1. PM10サンプリング
- ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）に対する周囲の空気からPM10を集めては、2.3メートル3 /時（ 図1）の流量で低容量サンプラーを使用してフィルタリングします。ここに記載される実験のために使用さサンプラーの特徴16に見出されます。時間を実行すると、必要なPM10の量（通常は1〜10日）に依存します。
- インキュベーション時間の終わりに、サンプラーからフィルタを削除し、でそれを凍結-20°Cまで使用。
図1.低ボリュームPM10サンプラー。低容量PM10サンプラーの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2. PM10の取り外しおよび粒子数
- 約5分間のPTFEフィルター解凍しましょう。その後、きれいなポリスチロールペトリ皿（ 図2A）にフィルターを置きます。複数のフィルタが処理される場合、各フィルタのための新たなペトリ皿を取ります。
- その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でのPTFEフィルターを重ねます。このプロトコルは、1ml当たり8×10 6粒子の最終PM10濃度のために確立されている（ステップ3.3を参照）。少なくともその濃度を得るために、とフィルターをオーバーレイするPBSの次の実験ボリュームを使用：PM10収集時間があった場合< 2日、2ミリリットルを使用します。インキュベーション時間≥2日間、4ミリリットルを使用します。
注：これは、適切である場合、PM10懸濁液の粒子濃度を増加させるために、異なるフィルタの懸濁液を、プールすることができます。 - 1分間に敏感なブラシヘッド（ 図2B、2C）と電気歯ブラシでピンセットとブラシとのPTFEフィルターを保持します。粒子-PBS-サスペンションを移し、以後は、クリーンな反応管に、PM10サスペンションと呼ばれます。
電動歯ブラシと 図2 PM10除去。サンプリングPM10とポリテトラフルオロエチレンフィルターはポリスチロールペトリ皿（A）内に配置されているし、4 mlのPBSを重層します。そして、PM10は、電動歯ブラシで除去される（B：1分間のブラッシング後：ブラッシングとCの前に）。= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- パーティクルカウンタを用いて、例えば、PM10粒子の濃度を測定します。 、このような10ミリリットル中に50μlの等張性測定用緩衝液としてPM10懸濁液の十分な量を希釈3回測定し、1ml当たりの粒子の平均合計数を計算します。関連するサイズの粒子を検出することができるパーティクルカウンタを使用してください。
3.ベットV 1染色
- 試料の分析のために必要な反応管の数を計算します。少なくとも3つの反応管が必要とされている：（ⅰ）サンプルのみ（ネイティブコントロール）と一本のチューブのサンプルを加えた二次抗体（陰性対照）と（ii）1つの管、および（ ⅲ）サンプルを加えた一次および二次抗体と1のチューブ（特定のサンプル）。最初に測定された場合には、（II）（I）は、少なくとも二つの反応チューブを調製し、および（iii）適切に設定する（ステップ4.1参照）サイトメーターを調整するのに十分な材料を持っています。
- 反応管の数に必要なPM10懸濁液の量を計算します。各反応管は、懸濁液の50μlのを必要とします。
- PBSの適切な量を追加することで、1ml当たり8×10 6粒子の最終濃度になるようにステップ3.2で算出された懸濁液の容量のためのステップ2.4で測定された粒子濃度を調整します。
注：このプロトコルのために新たに調製したPM10サスペンションが推奨されているが、残りのPM10懸濁液は、将来の実験のために-20℃で凍結することができます。 - ブロックなどの1％BSAをPBSで調製したストック溶液を用いて、0.02％の最終濃度でウシ血清アルブミン（BSA）でPM10懸濁液を補充することによって非特異的結合。簡単にボルテックスし、室温で20分間インキュベートします。
- 各サンプルは、フローサイトメトリーによって分析するために、交流のステップ3.4からの懸濁液の50μLを移しますリーン反応管。簡潔に特異的染色、渦のために指定された反応管に0.02μgの/μlの最終濃度でのBet V 1に対するモノクローナルマウス抗体を加え、室温で60分間インキュベートします。
- ネイティブコントロールとネガティブコントロールはまた、室温で60分間滞在のために指定PM10-BSA懸濁液と反応チューブをしてみましょう。
- 500μlのPBSを添加することによって、すべてのサンプルを洗浄が簡単に、各反応管に0.02％BSAで渦を補充し、室温で5分間、4,700×gで、その後、サンプルを遠心分離します。真空ポンプを使用して、慎重に上清を捨てます。
- 繰り返し手順3.6。
- 必要に応じてAPC標識二次抗マウスIgG1抗体の総量を決定する：50μlのPBSに溶解した1μgの抗体が反応チューブあたり0.02％BSAを補充しました。 0.02％BSAを補充したPBSのそれぞれの体積を有する抗体の適切な量を希釈します。
- ネイティブコントロールに指定された反応管を除くすべての反応チューブに希釈した二次抗体を50μl加えます。 PBSは、0.02％BSAを補充した50μlの後者を補います。数秒間ボルテックスは、すべてのサンプル。
- 暗所で30分間、すべてのサンプルをインキュベートします。
- 二回ステップ3.6を繰り返します。
- 各反応チューブ、ボルテックスに50μlのPBSを加え、フローサイトメーター上で試料を分析します。
4.フローサイトメトリー分析
- ネイティブコントロールを使用して、データ分析を最適化するためのパラメータサイトメーター以下を調整します。
- デバイスコントロールボードに表示前方散乱（FSC）閾値制御回路を使用することにより、最低値（200）にFSCのしきい値を設定し、分析を開始します。
- 散乱電圧制御を使用して、すべてのPM10粒子を検出することができるそのようにFSCおよび側方散乱（SSC）を調整し、粒子の集団は、目にほぼ位置していること電子のFSC軸の中央およびSSCの軸の下半分インチ
- 蛍光の電圧制御を使用して、APC電圧と、必要に応じて、APCのような同一の波長で発光しないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）のような他の蛍光の電圧を調整します。全ての粒子が両方の蛍光軸の下半分に表示されていることを、確認してください。
- 連続して、ネイティブの制御を含む各サンプルを検査し、サンプルあたり10,000以上の粒子のFSC、SSC、APC、およびFITCデータを格納します。
- それぞれのソフトウェアを使用してデータを評価します。特定のサンプルに吸着アレルゲン含量は、2つの方法で定量化することができます。
- すべてのPM10粒子の上にあるBet V 1負荷の指標として全粒子（中央値）のAPCの蛍光強度を分析します。
注：特定のサンプルは、アレルゲンが含まれている場合は、APCの蛍光強度は、陰性対照と比較して、特定のサンプルに増やす必要があります。対照的に、他のフッ素escence強度（ 例えば 、FITCの蛍光強度）が大幅に変更すべきではありません。 - 結合した抗ベットV 1抗体でPM10粒子の割合を計算します。これにより、負の制御では、APCが陽性とみなさ粒子の周囲ゲートを設定し、特定のサンプルにこのゲートをコピーして貼り付け、特定のサンプル中のAPCの正の粒子の割合からの負の制御にAPC正の粒子の割合を差し引きます。
- すべてのPM10粒子の上にあるBet V 1負荷の指標として全粒子（中央値）のAPCの蛍光強度を分析します。
Representative Results
PM10のベットV 1アレルゲン吸着> 0.5の粒子は、フローサイトメーター上で間接的な抗体染色とその後の分析により定量しました。高花粉シーズンからPM10サンプルは、テンプレートを務めました。ステップ3.1で述べたように、ネガティブコントロールはAPCと共にインキュベートしたPM10の粒子からなる（ 図3A）は二次抗体標識。 PM10粒子は、抗ベットV 1抗体を加えた二次抗体は、アレルゲン負荷された粒子（ 図3B）の表示で染色しました。ステップ4.3で説明したように、アレルゲン負荷を定量化する二つの方法を使用した：一方では、全ての粒子のAPCの蛍光強度の中央値は、特定のサンプルのための陰性コントロールの137および904である分析しました。一方、結合した抗ベットV 1抗体を有する粒子の割合が決定した：ゲートはネガティブコントロールでAPC正の粒子の周囲に設定し、続いた共同まだらおよび特定のサンプルに貼り付けます。陰性対照では、PM10> 0.5の粒子の10％がAPCを陽性とみなしました。偽陽性粒子のこの割合は、特定のサンプルでは77.5パーセントAPC正PM10> 0.5の粒子が得られ、したがって、特定のサンプル中の正の粒子の割合から差し引きました。観察された抗ベットの結合V 1抗体が特異的であることを証明するために、結合能力は、染色の前に対応する抗原でブロックしました。ベットV 1陽性PM10> 0.5の粒子（ 図3C）の割合によって定量化すると、APCの蛍光強度によって定量化し、84％の場合、これは、69％によって、抗ベットV 1抗体の結合を減少しました。
図1アレルゲンは、フローサイトメトリーにより可視化することができる3粒子結合ベットV高い経口からPM10サンプルのAPCの蛍光強度唯一のAPCで染色したLLENシーズンは、および組換えベットV 1抗原と一次抗体をブロッキングした後、二次抗体（B）の標識抗ベットV 1次抗体、続いてAPCとで染色した二次抗体（A）を 、標識された（C ）。ゲートP APC +は （赤色で表示）のAPC陽性とみなさ粒子の周囲に設定し、それぞれのパーセンテージは与えられています。この図は、わずか11から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
この方法は高いからと低花粉シーズンからPM10> 0.5サンプルの吸着ベットV 1コンテンツの量の違いを明らかにするために採用することができるかどうかをテストするには、高いから13 PM10サンプルおよび低花粉シーズンから6 PM10サンプルを分析した。 図4高い花粉シーズンからPM10サンプル0.5の粒子が低花粉シーズンからPM10サンプルと比較> APCの蛍光強度のベットV 1陽性PM10の割合の有意な差を示しています。両方の定量法は、ここに同様の結果を示しました。
図低および高花粉シーズンから4 PM10サンプルが吸着ベットV 1.低花粉シーズンPM10は（2012年5月と2013年秋/冬2013（n = 6）が、高花粉の季節PM10にサンプリングし、それらの量が異なるのn = 13）。 （A）PM10のAPCの蛍光強度>高花粉の季節から0.5粒子（中央値/最小/最大高花粉の季節低い花粉シーズンからよりも有意に高かった：796/313/1097;中央値/最小/最大低花粉の季節：197 / 277分の85）。 （B）PM10は高い花粉シーズンからsignifican含まれます低花粉シーズンからPM10よりもTLY以上のBetν1陽性PM10>は0.5粒子（中央値/最小/最大高花粉の季節：45.2 / 18.5 / 74.5;中央値/最小/最大低花粉シーズン：11.8 / 4.4 / 19.8）。ボックスプロットは、それぞれ中央値（箱の内側の線）、25および75パーセンタイル、（ボックスの下と上の境界線）と最小値と最大値（ウィスカー）を示します。 *** P <0.001低花粉シーズン、マン・ホイットニーU検定対。この図は、わずか11から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
プロトコルの重要なステップは、周囲の空気からPM10粒子の収集のための適切なフィルタを使用することである（ステップ1.1参照）。フィルタは、電気歯ブラシでブラッシング耐えるのに十分強力ではなく、すべてのフィルタ材料は、この要件を満たす必要があります。染色プロトコルは、1ml当たり8×10 6粒子のPM10粒子濃度で設立されました。材料が限られており、サンプルのプールが適切でない場合は、この方法は、おそらく同様に機能するが、抗体濃度（ステップ3.5と3.8を参照）を調整することが必要になる場合があります。
PM10粒子のBET V 1染色は、正と負の染色された粒子の異なる集団をもたらしませんでした。これは非常に小さなアップから高い量までの範囲の粒子のそれぞれに吸着したBet V 1アレルゲンの様々な量によって引き起こされるかもしれません。これは、このように向かって人口をシフトAPC信号の拡大につながる可能性APC陽性。それが否定的な粒子からポジティブに分離することが困難であるように、2つの定量法は、PM10> 0.5検体のBET V 1コンテンツの差を決定するために使用した：全ての粒子のメジアンAPCの蛍光強度を測定することにより、（I）相対定量、および（ii）APC陽性の粒子の割合を決定します。低および高花粉シーズンPM10> 0.5からの粒子のBET V 1負荷に関しては、両方の方法は、同様の結果を明らかにしました。それはゲートので、おそらく以下エラーが発生しやすいを置くとは無関係であるように、まだ、すべての粒子のメジアン蛍光強度による相対定量化が推奨されます。
これまでに多くの研究は、ELISA 5,12-14,17とそれぞれのアレルゲンとその後の定量化を抽出することにより、周囲の空気の粒子状物質中のアレルゲン含量を調べます。ここで説明する手順とquantificatioの間には根本的な違いがありますnはELISAで：フローサイトメトリーは、粒子結合抗原を分析しながら、ELISAは、抽出され、溶解した抗原を定量化します。 ELISAを用いて試験したPM10試料のBET V 1荷重（N = 8）は、1.2 ng / mlで（データは示していない）の検出限界以下でした。同様に、ButersなどはPM <2.5μmの画分および10ミクロンで唯一の約7％> PM> 2.5μmの端数が、PM外気13の> 10μmの画分中の93％以上でないベットV 1を同定していません。一方ELISAの対照的な結果と他方のFACS分析は、発散感度と一緒に検出方法の違いによって引き起こされる可能性があります。さらなる研究がしかし、完全にこの違いを理解するために必要とされます。
粒子に結合した抗原を可視化する方法は、電子顕微鏡10,14を走査しています。電子顕微鏡を走査することにより、Ormstad ら浮遊粒子状マットの表面上に可視化したBet V 1r個のすす粒子は、高い花粉の季節に、低花粉シーズン15でサンプリングされた粒子上のより少ない程度にサンプリングしました。さらに、花粉、ラテックス、またβグルカンからのアレルゲンは、周囲空気10燃焼粒子に吸着されることが見出されました。しかし、この方法は、粒子に結合したアレルゲンの定量化を可能にしません。
フローサイトメトリーを用いて、粒子に結合したベットV 1アレルゲンを定量することができます。このように、手持ちの他の適切な抗体と同様PM10の10から0.5μmの生物学的部分を特徴づけるための新しい方法を提供することができるフローサイトメトリー、この方法は、周囲の空気の粒子、 例えば 、金型、チリダニ上の他の抗原の検出に拡張されるかもしれませんアレルゲンまたはLPS。 PM10粒子が非常に簡単にだけでなく、生物学的物質を吸着するだけでなく、化学物質や金属のように、抗体の非特異的結合は、しかし、問題を引き起こす可能性があります。新しい抗体をテストする場合は、重要なステップは、特定のバインドを証明することでする。これは、例えば、前の11染色に対応する抗原との特異的な抗体の結合能力を遮断することによって行うことができます。
周囲の空気のベットV 1コンテンツはシラカバ花粉数12,13,18異なることができるように、アレルギー症状は、おそらく花粉数14,18よりもアレルゲンレベルとのより良い相関性があります。したがって、臨床データと併せて提示された方法は、カバノキするアレルギー反応がPM10> 0.5のベットV 1アレルゲン負荷に対応しているかどうか、将来の実験で調べることができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon filter | Pall Life Sciences, USA | R2PL047 | 47 mm, 1.0 µm |
| low volume sampler | Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany | LVS3 | air flow of 2.3 m3/hr |
| Phosphate-buffered saline | Biochrom, Germany | L1825 | without Ca/Mg, low endotoxin |
| electrical toothbrush | Braun, Germany | Oral-B Vitality Sensitive | |
| Casy cell counter | Schärfe System GmbH, Germany | Model TTC | range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm |
| FACSCanto II | Becton Dickinson, USA | 3-laser, 8-color (4-2-2) | |
| FACS Diva Software v6.1.3 | Becton Dickinson | ||
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | |
| monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 | Indoor Biotechnologies, UK | MA-3B4 | clone MA-3B4 |
| APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody | Becton Dickinson | 560089 | clone A85-1 |
| SPSSTM software version 18 | PASW Statistics 18, Hongkong, China | ||
| Petri Dish | Gosselin, France | BP50-02 | D 55 mm, H 15 mm |
| FACS Tube | Becton Dickinson, USA | REF 352054 | 5 ml Polystyrene |
| CASYton | Roche Germany |
REF 05651808001 | |
| Matrix Blank Tubes | Thermo Scientific, USA | 4140 | 1.4 ml, PP |
| Centrifuge | Heraeus, Thermo Scientific | Megafuge 40R | |
| Vacuum Pump | INTEGRA Biosciences AG, Switzerland | Model 158 320 | Inetrgra Vacusafe |
| recombinant Bet v 1a antigen | Indoor Biotechnologies, UK | LTR-BV1A-1 | Concentration: 2.0 mg/ml |
References
- Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma? J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
- Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
- Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
- Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
- Brough, H. A., et al.
- Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M.
- World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256 (2003).
- Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
- Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
- Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
- Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
- Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
- Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
- Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
- Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
- Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18 (2016).
- Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
- Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).
