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Immunology and Infection

कण-बाउंड बेट वी PM10 में 1 allergen के प्रवाह cytometric विश्लेषण

Published: November 19, 2016 doi: 10.3791/54721
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Environmental Medicine and Health Effects Assessment, Federal Environment Agency

Summary

यहाँ, हम प्रवाह cytometry द्वारा allergen से भरी हुई कणों यों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। परिवेश बात कण कणों adsorbed एलर्जी के वाहक के रूप में कार्य कर सकते हैं। हम यहां चलता है कि प्रवाह cytometry, एक पद्धति व्यापक रूप से निलंबित ठोस विशेषताएँ इस्तेमाल> व्यास में 0.5 माइक्रोन, इन एलर्जी से भरी हुई कणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

प्रवाह cytometry एक विधि व्यापक रूप से 0.5 माइक्रोमीटर व्यास में के कई दसियों के लिए एक आकार रेंज में कोशिकाओं या बैक्टीरिया के रूप में निलंबित ठोस यों इस्तेमाल किया है। आगे और बगल की ओर तितर बितर गुणों का एक लक्षण वर्णन करने के लिए इसके अलावा, यह एंटीबॉडी की तरह फ्लोरोसेंट लेबल मार्कर के उपयोग संबंधित संरचनाओं का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है। अप्रत्यक्ष एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग, प्रवाह cytometry यहां कार्यरत है सन्टी पराग एलर्जी यों तो (ठीक शर्त ध् 1) inhalable बात कण (PM10, कण आकार व्यास में ≤10 माइक्रोन) में व्यास में 0.5 10 माइक्रोन तक के कणों -loaded। PM10 कणों के रूप में adsorbed एलर्जी के वाहक संभवतः कम श्वसन तंत्र, जहां वे एलर्जी प्रतिक्रियाओं को चालू कर सकते करने के लिए उन्हें परिवहन के कार्य कर सकते हैं।

अब तक PM10 के allergen सामग्री एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (ELISAs) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अध्ययन किया गया है। एलिसा भंग उपायों और न कण-bound allergen। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जो एलर्जी से भरी हुई कणों कल्पना कर सकते हैं, प्रवाह cytometry इसके अतिरिक्त उन्हें यों मई की तुलना में। परिवेशी वायु की allergen सामग्री सन्टी पराग गिनती से विचलित कर सकते हैं, एलर्जी के लक्षण शायद पराग गिनती के साथ तुलना allergen प्रदर्शन के साथ बेहतर सहसंबंधी सकता है। नैदानिक ​​डेटा के साथ संयोजन के रूप में, प्रस्तुत विधि एलर्जी सन्टी कि क्या पराग कणों एंटीजन PM10> 0.5 माइक्रोन की शर्त ध् 1 allergen सामग्री के साथ जुड़े रहे हैं भविष्य के प्रयोगों में परीक्षण करने का अवसर प्रदान करता है।

Introduction

वायु प्रदूषण वृद्धि हुई घटना और हाल के दशकों में 1-3 मनाया सांस की एलर्जी की गंभीरता का एक महत्वपूर्ण पर्यावरण कारण के रूप में माना जा रहा है। इसके अलावा, वहाँ धूल 4,5 में आम एलर्जी के वितरण में रुचि बढ़ रही थी।

बिर्च पराग घास बुखार उत्तेजित कर सकते हैं, लेकिन यह भी एलर्जी अस्थमा 6-8 का एक महत्वपूर्ण ट्रिगर हो सकता है। पूरे सन्टी पराग निचले श्वसन तंत्र में प्रवेश करने के लिए या अपने आकार (व्यास में 22 माइक्रोन) का एक परिणाम के रूप में PM10 में पाया जाने की संभावना नहीं है। हालांकि, बेट ध् 1, प्रमुख सन्टी पराग एलर्जी घटक, जैसे सन्टी पराग एलर्जी पराग टूटना 9 के बाद जारी किया जा सकता है और कम श्वसन वायुमार्ग परिवेशी वायु कणों 10 करने के लिए बाध्य कर सकते हैं इस प्रकार संभवतः दर्ज करें। वास्तव में, यह दिखाया गया है कि PM10 के रूप में एक पराग एलर्जी proband 11 से basophiles की इन विट्रो सक्रियण द्वारा प्रदर्शन जैविक रूप से सक्रिय एलर्जी हो सकती है

PM10 नमूनों में बेट ध् 1 allergen सामग्री संबंधित एलर्जी और एलिसा 12-14 के साथ बाद में मात्रा का ठहराव निकालने के द्वारा अध्ययन किया गया है। एलिसा तकनीक के साथ, भंग allergen मापा गया था, लेकिन एलर्जी से भरी हुई कणों की मात्रा अभी भी अनजान बने रहे। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एलर्जी से भरी हुई कणों का पता चला है, लेकिन मात्रा का ठहराव 10,15 अनुमति नहीं दी।

इस अध्ययन के प्रवाह cytometry परिवेशी वायु के नमूने में दांव ध् 1 से भरी हुई PM10 कणों के अनुपात में यों तो कार्यरत हैं। प्रवाह की सीमा का पता लगाने के कारण कोशिकामापी केवल कणों से बड़ा 0.5 माइक्रोन की जांच की जा सकती है। PM10 के> 0.5 माइक्रोन अंश आगे PM10 के रूप में> 0.5 के लिए भेजा जाएगा।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल बेट ध् 1, प्रमुख सन्टी पराग प्रतिजन घटक, प्लस एक Allophycocyanin (एपीसी) के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ PM10 कणों की अप्रत्यक्ष धुंधला (मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस IgG1, क्लोन एमए-3B4) का वर्णन माध्यमिक एंटीबॉडी -labeled (एंटी -Mouse IgG1 एंटीबॉडी, क्लोन A85-1) और एक प्रवाह कोशिकामापी पर बाद के विश्लेषण। साथ उचित अन्य एंटीबॉडी उपलब्ध है, इस विधि परिवेशी वायु कणों के लिए बाध्य अन्य एंटीजन का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

1. PM10 सैम्पलिंग

  1. Polytetrafluoroethylene (PTFE) पर परिवेशी वायु से PM10 लीजिए 2.3 मीटर 3 / घंटा (चित्रा 1) के प्रवाह की दर के साथ एक कम मात्रा नमूना का उपयोग कर फिल्टर। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए इस्तेमाल पारखी का एक लक्षण वर्णन 16 में पाया जाता है। समय से चल रहा है (आमतौर के बीच 1 और 10 दिन) PM10 की जरूरत की राशि पर निर्भर करता है।
  2. ऊष्मायन समय के अंत में, पारखी से फिल्टर को हटाने और उस पर है फ्रीज-20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक।

आकृति 1
चित्रा 1. कम मात्रा PM10 पारखी। एक कम मात्रा PM10 पारखी का उदाहरण है। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

2. PM10 हटाने और कण गिनती

  1. के बारे में 5 मिनट के लिए PTFE फिल्टर पिघलना करते हैं। फिर, एक साफ polystyrol पेट्री डिश (2A चित्रा) में फिल्टर डाल दिया। प्रत्येक फिल्टर के लिए एक नया पेट्री डिश ले लो, अगर एक से अधिक फिल्टर कार्रवाई की है।
  2. बाद में, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ PTFE फिल्टर उपरिशायी। इस प्रोटोकॉल मिलीलीटर प्रति 8x10 6 कणों की एक अंतिम एकाग्रता PM10 के लिए स्थापित किया गया है (3.3 कदम देखें)। कम से कम उस एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, के साथ फिल्टर मढ़ी पीबीएस के निम्नलिखित अनुभवजन्य मात्रा का उपयोग करें: यदि PM10 संग्रह समय था < 2 दिन, 2 मिलीलीटर का उपयोग करें। ऊष्मायन बार ≥2 दिनों के लिए, 4 मिलीलीटर का उपयोग करें।
    नोट: आदेश PM10 निलंबन के कण एकाग्रता बढ़ाने के लिए, अलग अलग फिल्टर से निलंबन, जमा किया जा सकता है अगर यह उचित है।
  3. 1 मिनट के लिए एक संवेदनशील ब्रश सिर (आंकड़े 2 बी, 2 सी) के साथ एक बिजली के टूथब्रश के साथ चिमटी और ब्रश के साथ PTFE फिल्टर पकड़ो। , कण-पीबीएस निलंबन, इसके बाद करार दिया PM10 निलंबन स्थानांतरण एक साफ प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2. एक बिजली के टूथब्रश के साथ PM10 हटाने। जांचा PM10 के साथ एक polytetrafluoroethylene फिल्टर एक polystyrol पेट्री डिश (ए) में रखा गया है और 4 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मढ़ा है। फिर, PM10 एक बिजली के टूथब्रश के साथ हटा दिया जाता है (बी: 1 मिनट के लिए ब्रश करने के बाद: brushing और सी से पहले)।= "Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. PM10 कणों, जैसे की एकाग्रता को मापने, एक कण काउंटर के उपयोग के द्वारा। 10 मिलीलीटर isotonic माप बफर में इस तरह के रूप में 50 μl PM10 निलंबन की पर्याप्त मात्रा पतला, तीन बार मापने के लिए और मिलीलीटर प्रति कणों का मतलब कुल संख्या की गणना। एक कण काउंटर जो प्रासंगिक आकार के कणों का पता लगाने कर सकते हैं का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें।

3. बेट ध् 1 धुंधला

  1. प्रतिक्रिया के नमूने के विश्लेषण के लिए आवश्यक ट्यूबों की संख्या की गणना: कम से कम तीन प्रतिक्रिया ट्यूबों की जरूरत है: (i) नमूना केवल (देशी नियंत्रण) के साथ एक ट्यूब (ii) नमूना प्लस माध्यमिक एंटीबॉडी (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ एक ट्यूब, और ( iii) नमूना प्लस प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी (विशिष्ट नमूना) के साथ एक ट्यूब। तो पहली बार मापा जाता है, (मैं) के लिए कम से कम दो प्रतिक्रिया ट्यूबों तैयार (ii)और (iii) ठीक से सेटिंग्स कोशिकामापी समायोजित करने के लिए पर्याप्त सामग्री है (4.1 कदम देखें)।
  2. प्रतिक्रिया ट्यूबों की संख्या के लिए आवश्यक PM10 निलंबन की राशि की गणना। प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब निलंबन के 50 μl की आवश्यकता है।
  3. कण एकाग्रता निलंबन की मात्रा पीबीएस का एक उचित मात्रा जोड़कर मिलीलीटर प्रति 8x10 6 कणों की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 3.2 चरण में गणना के लिए 2.4 चरण में मापा जाता समायोजित करें।
    नोट: शेष PM10 निलंबन, भविष्य प्रयोगों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है, हालांकि इस प्रोटोकॉल के लिए हौसले से तैयार PM10 निलंबन की सिफारिश की है।
  4. ब्लॉक 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता में गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ PM10 निलंबन का सप्लीमेंट, एक शेयर समाधान पीबीएस के साथ तैयार इस तरह के रूप में 1% बीएसए का उपयोग करके unspecific बंधन। भंवर संक्षिप्त और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. प्रत्येक नमूना प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है, एसी के लिए 3.4 कदम से निलंबन के 50 μl हस्तांतरणदुबला प्रतिक्रिया ट्यूब। संक्षेप में विशिष्ट धुंधला, भंवर के लिए नामित प्रतिक्रिया ट्यूबों के लिए 0.02 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता पर बेट ध् 1 के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस जोड़ें और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. मूल निवासी नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण भी कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए रहने के लिए नामित PM10-बीएसए निलंबन के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों करते हैं।
  6. 500 μl पीबीएस 0.02% BSA के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4700 XG पर नमूने बाद में प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब, भंवर संक्षिप्त और सेंट्रीफ्यूज के लिए पूरक जोड़कर सभी नमूनों को धो लें। एक वैक्यूम पंप का उपयोग करके ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. दोहराएँ कदम 3.6।
  8. 1 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी 50 μl पीबीएस प्रतिक्रिया ट्यूब प्रति 0.02% BSA के साथ पूरक में भंग: एपीसी लेबल माध्यमिक विरोधी माउस IgG1 एंटीबॉडी की कुल राशि की जरूरत निर्धारित करते हैं। पीबीएस के संबंधित मात्रा 0.02% BSA के साथ पूरक के साथ एंटीबॉडी की उचित मात्रा पतला।
  9. मूल निवासी नियंत्रण के लिए नामित प्रतिक्रिया ट्यूब को छोड़कर सभी प्रतिक्रिया ट्यूबों को पतला एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें। 50 μl पीबीएस 0.02% BSA के साथ पूरक के साथ बाद अनुपूरक। भंवर कुछ सेकंड के लिए सभी नमूनों।
  10. अंधेरे में 30 मिनट के लिए सभी नमूनों को सेते हैं।
  11. दोहराएँ कदम 3.6 दो बार।
  12. प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब, भंवर करने के लिए 50 μl पीबीएस जोड़ें और एक प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण।

4. प्रवाह cytometric विश्लेषण

  1. मूल निवासी नियंत्रण निम्नलिखित समायोजित का उपयोग करना, मापदंडों कोशिकामापी डेटा विश्लेषण करने के लिए अनुकूलन।
    1. आगे तितर बितर (एफएससी) दहलीज नियंत्रक डिवाइस नियंत्रण बोर्ड पर प्रदर्शित का उपयोग करके, सबसे कम मूल्य (200) पर एफएससी सीमा निर्धारित करने और विश्लेषण शुरू करते हैं।
    2. बिखराव वोल्टेज नियंत्रक का उपयोग करके, कि रास्ते में एफएससी और बगल की ओर तितर बितर (एसएससी) को समायोजित कि सभी PM10 कणों का पता लगाया जा सकता है कि कणों की आबादी वीं में लगभग स्थित हैएफएससी अक्ष की और एसएससी अक्ष के निचले आधे में ई बीच।
    3. प्रतिदीप्ति वोल्टेज नियंत्रक का उपयोग करके, एपीसी वोल्टेज और fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) है, जो एपीसी की तरह एक ही तरंग लंबाई में उत्सर्जन नहीं करता, यदि आवश्यक हो की तरह एक और प्रतिदीप्ति वोल्टेज समायोजित। सुनिश्चित करें, कि सभी कणों दोनों प्रतिदीप्ति कुल्हाड़ियों के निचले आधे में दिखाई दे रहे हैं।
  2. लगातार, देशी नियंत्रण सहित प्रत्येक नमूना जांच करने और नमूना प्रति कम से कम 10,000 कणों की एफएससी, एसएससी, एपीसी, और FITC डेटा की दुकान।
  3. संबंधित सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का मूल्यांकन। विशिष्ट नमूने में Adsorbed allergen सामग्री दो मायनों में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है:
    1. सभी PM10 कणों पर बेट ध् 1 लोड का एक उपाय के रूप में सभी कणों (औसत मूल्य) के एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण।
      नोट: विशिष्ट नमूना allergen निहित हैं, एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में विशिष्ट नमूने में वृद्धि करनी चाहिए। इसके विपरीत, अन्य स्त्रावescence तीव्रता (उदा।, FITC प्रतिदीप्ति तीव्रता) में काफी परिवर्तन नहीं होना चाहिए।
    2. बाध्य विरोधी बेट ध् 1 एंटीबॉडी के साथ PM10 कणों के प्रतिशत की गणना। इस प्रकार, नकारात्मक नियंत्रण में, कणों एपीसी सकारात्मक माना चारों ओर एक फाटक सेट कॉपी और विशिष्ट नमूना में इस फाटक पेस्ट और विशिष्ट नमूने में एपीसी सकारात्मक कणों का प्रतिशत से नकारात्मक नियंत्रण में एपीसी सकारात्मक कणों का प्रतिशत घटाना।

Representative Results

PM10> 0.5 कणों को बेट ध् 1 allergen सोखना कोशिकामापी एक प्रवाह पर अप्रत्यक्ष एंटीबॉडी धुंधला और बाद के विश्लेषण के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था। उच्च पराग सत्र से एक PM10 नमूना टेम्पलेट के रूप में कार्य किया। के रूप में कदम 3.1 में कहा गया है, नकारात्मक नियंत्रण एपीसी के साथ incubated PM10 कणों के शामिल लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी केवल (चित्रा 3 ए)। PM10 कणों विरोधी बेट ध् 1 एंटीबॉडी के साथ साथ माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग allergen लोड कणों (चित्रा 3 बी) का प्रदर्शन किया। 4.3 चरण में वर्णित है, allergen लोड बढ़ाता करने के दो तरीके इस्तेमाल किया गया: एक तरफ, सभी कणों की एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता का औसत मूल्य और विशिष्ट नमूना के लिए नकारात्मक नियंत्रण के लिए 137 904 से किया जा रहा विश्लेषण किया गया था। दूसरी ओर, बाध्य विरोधी बेट ध् 1 एंटीबॉडी के साथ कणों का प्रतिशत निर्धारित किया गया था: एक फाटक नकारात्मक नियंत्रण में एपीसी सकारात्मक कणों के आसपास की स्थापना की और बाद में सहविचित्र और विशिष्ट नमूना में चिपकाया। नकारात्मक नियंत्रण में, PM10> 0.5 कणों की 3% एपीसी सकारात्मक विचार किया गया। झूठी सकारात्मक कणों का यह प्रतिशत विशिष्ट नमूने में सकारात्मक कणों का प्रतिशत इस प्रकार 77.5% एपीसी सकारात्मक PM10 में जिसके परिणामस्वरूप> विशिष्ट नमूने में 0.5 कणों से घटाया गया था। साबित करने के लिए कि मनाया विरोधी बेट के बंधन ध् 1 एंटीबॉडी विशिष्ट था, बाध्यकारी क्षमता इसी प्रतिजन धुंधला करने से पहले साथ अवरुद्ध किया गया था। यह 69% से विरोधी बेट ध् 1 एंटीबॉडी के बंधन कम हो, अगर, एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा मात्रा, और 84% से यदि बेट ध् 1 सकारात्मक PM10> 0.5 कणों (चित्रा 3 सी) के प्रतिशत के द्वारा मात्रा।

चित्र तीन
चित्रा 3. कण-बाउंड बेट ध् 1 allergen उच्च पुलिस से एक PM10 नमूना के प्रवाह cytometry। एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता से देखे जा सकते हैंllen मौसम केवल एपीसी के साथ दाग माध्यमिक एंटीबॉडी (ए), विरोधी बेट ध् 1 प्राथमिक एंटीबॉडी और बाद में एपीसी के साथ साथ दाग माध्यमिक एंटीबॉडी (बी) लेबल लेबल, और पुनः संयोजक बेट ध् 1 प्रतिजन के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध करने के बाद (सी )। गेट पी एपीसी + कणों एपीसी सकारात्मक माना आसपास स्थापित किया गया था (लाल रंग में दिखाया गया है) और संबंधित प्रतिशत दिया जाता है। यह आंकड़ा थोड़ा 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

परीक्षण है कि क्या इस विधि से उच्च और निम्न पराग मौसम से PM10> 0.5 नमूनों की adsorbed बेट ध् 1 सामग्री की मात्रा में मतभेद प्रकट करने के लिए अपनाया जा सकता है, उच्च से 13 PM10 नमूने और कम पराग मौसम से 6 PM10 नमूनों का विश्लेषण किया गया। चित्रा 4एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता में और बेट ध् 1 सकारात्मक PM10> उच्च पराग मौसम कम पराग मौसम से PM10 नमूनों की तुलना में से PM10 नमूने के 0.5 कणों के अनुपात में काफी अंतर दर्शाया गया है। दोनों मात्रा का ठहराव तरीकों इसके द्वारा इसी तरह के परिणाम से पता चला है।

चित्रा 4
निम्न और उच्च पराग मौसम से चित्रा 4. PM10 नमूने adsorbed बेट वी के अपने राशि में मतभेद है 1. कम पराग मौसम PM10 मई 2012 और 2013 में, उच्च पराग मौसम PM10 शरद ऋतु / सर्दियों 2013 में नमूना था (6 n =) (एन = 13)। (ए) PM10 के एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता> उच्च पराग के मौसम से 0.5 कणों कम पराग मौसम (मंझला / न्यूनतम / अधिकतम उच्च पराग के मौसम से की तुलना में काफी अधिक था: 796/313/1097, मंझला / न्यूनतम / अधिकतम कम पराग मौसम: 197 / 85/277)। उच्च पराग सत्र से (बी) PM10 significan निहितtly अधिक शर्त ध् 1 पॉजिटिव PM10> 0.5 कम पराग मौसम से PM10 से कणों (मंझला / न्यूनतम / अधिकतम उच्च पराग मौसम: 45.2 / 18.5 / 74.5, मंझला / न्यूनतम / अधिकतम कम पराग मौसम: 11.8 / 4.4 / 19.8)। बॉक्स भूखंडों मंझला मूल्यों (बॉक्स के भीतरी लाइन), 25 और 75 शतमक, क्रमशः (बॉक्स के निचले और ऊपरी सीमाओं) और न्यूनतम और अधिकतम मानों (मूंछ) दिखा। *** पी <0.001 बनाम कम पराग मौसम, मान व्हिटनी यू परीक्षण। यह आंकड़ा थोड़ा 11 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण कदम परिवेशी वायु से PM10 कणों के संग्रह के लिए एक उपयुक्त फिल्टर का इस्तेमाल होता है (1.1 कदम देखें)। फिल्टर काफी मजबूत एक बिजली के टूथब्रश के साथ ब्रश करने सहना हो गया है, और नहीं सभी फिल्टर सामग्री इस आवश्यकता को पूरा। धुंधला प्रोटोकॉल मिलीलीटर प्रति 8x10 6 कणों की एक PM10 कण एकाग्रता के साथ स्थापित किया गया था। लेकिन अगर सामग्री सीमित है और नमूनों की पूलिंग उचित नहीं है, विधि शायद के रूप में अच्छी तरह से कार्य करेगा, लेकिन एंटीबॉडी सांद्रता समायोजित किया जा सकता है (कदम 3.5 और 3.8 देखें)।

PM10 कणों की शर्त ध् 1 धुंधला सकारात्मक और नकारात्मक दाग कणों की अलग आबादी में परिणाम नहीं था। इस शर्त ध् 1 allergen के अलग मात्रा बहुत कम ऊपर से एक उच्च राशि को लेकर कणों से प्रत्येक के लिए adsorbed की वजह से हो सकता है। इस एपीसी संकेत के विस्तार में हो सकता है, इस प्रकार की ओर जनसंख्या स्थानांतरणएपीसी सकारात्मकता। सभी कणों की औसत एपीसी प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा (i) रिश्तेदार मात्रा का ठहराव: यह नकारात्मक कणों से सकारात्मक अलग करना मुश्किल है, दो मात्रा का ठहराव तरीकों PM10> 0.5 नमूनों की शर्त ध् 1 सामग्री में मतभेदों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया और (ii) एपीसी सकारात्मक कणों का प्रतिशत निर्धारित। निम्न और उच्च पराग मौसम PM10> 0.5 से कणों की शर्त ध् 1 लोड के बारे में, दोनों तरीकों इसी तरह के परिणाम का पता चला। फिर भी, सभी कणों की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता से रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के रूप में यह गेट रखने के स्वतंत्र है और इसलिए है की सिफारिश की है शायद कम त्रुटि प्रवण।

तिथि करने के लिए कई अध्ययनों से संबंधित एलर्जी और एलिसा 5,12-14,17 के साथ बाद में मात्रा का ठहराव निकालने के द्वारा परिवेशी वायु बात कण में allergen सामग्री की जांच। वहाँ प्रक्रिया यहाँ वर्णित है और quantificatio के बीच एक बुनियादी फर्क हैn एलिसा के साथ: एलिसा निकाले और भंग प्रतिजन quantifies, जबकि फ्लो का कण-बाउंड प्रतिजन विश्लेषण करती है। एलिसा के साधन परीक्षण किया PM10 नमूनों की शर्त ध् 1 लोड द्वारा (एन = 8) 1.2 एनजी / एमएल का पता लगाने सीमा से नीचे था (डेटा) नहीं दिखाया। इसी तरह, Buters और दूसरों PM <2.5 माइक्रोन अंश और 10 माइक्रोन के बारे में केवल 7%> PM> 2.5 माइक्रोन अंश, लेकिन प्रधानमंत्री> 10 माइक्रोन परिवेशी वायु 13 के अंश में 93% से अधिक में कोई शर्त ध् 1 की पहचान की। एक हाथ और दूसरे हाथ पर FACS विश्लेषण पर एलिसा की विषम परिणाम, अलग-अलग संवेदनशीलता के साथ संयोजन के रूप में पहचान पद्धति में मतभेद की वजह से हो सकता है। इसके अलावा अनुसंधान हालांकि पूरी तरह से इस अंतर को समझने की जरूरत है।

एक विधि कल्पना करने के कण-बाउंड प्रतिजन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 10,14 स्कैनिंग है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग करके, Ormstad एट अल। निलंबित कण मैट की सतह पर कल्पित बेट ध् 1आर कालिख कणों उच्च पराग के मौसम में और कम पराग के मौसम में 15 जांचा कणों पर एक हद तक कम करने के लिए जांचा। इसके अतिरिक्त, पराग, लेटेक्स और भी β-glucans से एलर्जी परिवेशी वायु 10 में दहन के कणों को adsorbed जा पाए गए। इस विधि, तथापि, कण-बाउंड allergen की मात्रा का ठहराव की अनुमति नहीं है।

से फ्लो का उपयोग करके, कण-बाउंड बेट ध् 1 allergen मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रवाह cytometry हाथ पर अन्य उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ के रूप में 10 के लिए 0.5 माइक्रोन PM10 के जैविक अंश को चिह्नित करने के लिए एक नया तरीका प्रदान कर सकता है, इस विधि परिवेशी वायु कणों, जैसे, मिट्टी, धूल घुन पर अन्य एंटीजन का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है एलर्जी या एलपी। जैसा कि PM10 कणों काफी आसानी से न केवल जैविक सामग्री रसायन और धातुओं सोखना, लेकिन यह भी unspecific एंटीबॉडी के बंधन, हालांकि, एक समस्या खड़ी कर सकता है। एक नई एंटीबॉडी परीक्षण किया जाता है, एक महत्वपूर्ण कदम विशिष्ट बाँध साबित करने के लिए हैआईएनजी। यह द्वारा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, इसी प्रतिजन 11 पूर्व धुंधला करने के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन क्षमता को अवरुद्ध।

बेट वी के रूप में परिवेशी वायु का 1 सामग्री सन्टी पराग गिनती 12,13,18 से अलग कर सकते हैं, एलर्जी के लक्षण शायद पराग के साथ तुलना allergen के स्तर के साथ बेहतर हो सकता है सहसंबंधी 14,18 गिनती। इसलिए, नैदानिक डेटा के साथ संयोजन के रूप में प्रस्तुत विधि भविष्य प्रयोगों में जांच करने के लिए एलर्जी बिर्च को PM10> 0.5 की शर्त ध् 1 allergen लोड के अनुरूप है कि क्या सक्षम बनाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon filter Pall Life Sciences, USA R2PL047 47 mm, 1.0 µm
low volume sampler Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany LVS3 air flow of 2.3 m3/hr
Phosphate-buffered saline Biochrom, Germany L1825 without Ca/Mg, low endotoxin
electrical toothbrush  Braun, Germany Oral-B Vitality Sensitive
Casy cell counter  Schärfe System GmbH, Germany Model TTC range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm
FACSCanto II  Becton Dickinson, USA 3-laser, 8-color (4-2-2)
FACS Diva Software v6.1.3  Becton Dickinson
bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich, USA A2153-10G
monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 Indoor Biotechnologies, UK  MA-3B4 clone MA-3B4
APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody  Becton Dickinson 560089 clone A85-1
SPSSTM software version 18  PASW Statistics 18, Hongkong, China
Petri Dish Gosselin, France BP50-02 D 55 mm, H 15 mm
FACS Tube  Becton Dickinson, USA REF 352054 5 ml Polystyrene
CASYton Roche
Germany		 REF 05651808001
Matrix Blank Tubes Thermo Scientific, USA 4140 1.4 ml, PP
Centrifuge Heraeus, Thermo Scientific Megafuge 40R
Vacuum Pump INTEGRA Biosciences AG, Switzerland Model 158 320 Inetrgra Vacusafe
recombinant Bet v 1a antigen  Indoor Biotechnologies, UK LTR-BV1A-1 Concentration: 2.0 mg/ml

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References

  1. Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma? J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).
  2. Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).
  3. Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).
  4. Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).
  5. Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).
  6. Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).
  7. World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256 (2003).
  8. Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).
  9. Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).
  10. Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).
  11. Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
  12. Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).
  13. Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).
  14. Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
  15. Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).
  16. Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18 (2016).
  17. Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).
  18. Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. , (2015).

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इम्यूनोलॉजी अंक 117 बेट ध् 1 सन्टी पराग प्रतिजन सन्टी पराग प्रवाह cytometry बात कण PM10 एलर्जी एलर्जी परिवेशी वायु कणों
कण-बाउंड बेट वी PM10 में 1 allergen के प्रवाह cytometric विश्लेषण
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Süring, K., Bach, S., Höflich, C., Straff, W. Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10. J. Vis. Exp. (117), e54721, doi:10.3791/54721 (2016).

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