Introduction
Herzinsuffizienz ist ein komplexes klinisches Syndrom, die Symptome von denen Müdigkeit, Dyspnoe, Belastungsintoleranz und Flüssigkeitsretention in den peripheren Geweben. Es ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern 1. Abgesehen von ererbten Kardiomyopathie verursacht durch Mutationen in Sarkomers Proteine oder Ionenkanäle 2 können myokardialen Dysfunktion durch eine Vielzahl von medizinischen Bedingungen verursacht werden, einschließlich Bluthochdruck, Herzklappenerkrankungen, Fettleibigkeit, Diabetes und 3. Veränderungen der myokardialen Struktur, die elektrische Leitfähigkeit und den Energiestoffwechsel führen zu einer unzureichenden Herzpumpleistung Kreislauf- Anforderungen gerecht zu werden, was letztlich bei Herzinsuffizienz ergibt 3,4. Untersuchung der Mechanismen Herzinsuffizienz zugrunde liegt, ist daher kritisch im Bereich der Herz-Kreislauf-Forschung. molekularen Mechanismen identifizieren zu Herzinsuffizienz Progression führt, kann in der Entdeckung neuer therapeutischer Targets oder nützliche Biomarker schließlich helfen
Herzhypertrophie und Remodellierung spielt eine kritische Rolle in der Entwicklung von Herzinsuffizienz. Hypertensive Herzkrankheit ist der Schlüssel Faktor der Herzhypertrophie und der unpassenden Remodeling bei menschlichen Patienten gesehen 1. Um diese menschlichen Bedingungen, Tiermodelle imitieren häufig durch chirurgische Verfahren etabliert. Insbesondere kann die Quer oder abdominalen Aorta eingeschnürt werden, um den Widerstand gegen den linken Ventrikel zu erhöhen, die letztlich in dem Herzen zu einer Drucküberlastung führt. Dieses Phänomen führt in der Regel Herzhypertrophie, eine physiologische Kompensation der Kardiomyozyten die funktionelle Nachfrage des kardiovaskulären Systems zu erfüllen. Allerdings überschreibt die funktionelle Forderung, die normalen physiologischen Kompensationsmechanismen, was zu Herzfibrose und contracFliesen Beeinträchtigung. Quer Aortakonstriktion (TAC) Chirurgie umfasst oft komplizierte Verfahren, einschließlich Thorakotomie, mechanische Belüftung und die Trennung des Thymus und Fettgewebe aus dem Aortenbogen. Im Gegensatz dazu benötigt Bauch - Aorten - Verengung einfacher experimentelle Techniken 6-8. Die abdominale Aorta, zwischen der linken und der rechten Nierenarterien, ist während der Operation eingeschnürten. Herzhypertrophie und Umbau kann mehrere Wochen nach der Bauch Aortakonstriktion Chirurgie 6-8 beobachtet werden; sie produzieren robuste hypertensive Herzerkrankung ähnlich der 9,10 durch die Quer Aortakonstriktion Operation erzeugt. Hier beschreiben wir ein Protokoll abdominal aortic Einschnürung in Ratten durchzuführen unter Verwendung eines effizienten, hoch reproduzierbar und minimal-invasive Verfahren. Die Bauchaorta neben den Nierenarterien wird durch eine 0,72 mm Schleife durch einen 4-0 Seidenfaden gebildet schnürt. Zehn Wochen nach der Operation, Herzhypertrophie und remodeling beobachtet werden. Das Rattenmodell der abdominal aortic Einschnürung induzierter bietet Herzhypertrophie eine Plattform zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und Pathophysiologie sowie die Entwicklung von potentiellen Therapeutika.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Dieses Protokoll wurde von und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee an der National Taiwan University dargelegt genehmigt.
1. Tierchirurgie
- Bereiten Sie eine 22 G Spritzennadel durch auf einem Honstein die Spitze der Nadel Abstumpfung. Mit einer Zange, Plicate die Nadel zu einem rechten Winkel.
- Vor der Operation vorbereiten die erforderlichen chirurgischen Instrumenten und Materialien, sowie einen Erholungskäfig. Autoclave alle Instrumente und chirurgische Versorgung vor dem Gebrauch.
- Pflegen Sie die Ratten rund 200 g und halten sie unter 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklen bei kontrollierter Temperatur (21 ± 2 ° C) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Fügen Sie mindestens 6 Ratten in jeder Gruppe. Anästhesieren die Ratten mit Pentobarbital(75 mg / kg in 0,5 ml, ip) oder einem anderen geeigneten Anästhetikum. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Testen der Schwanz Reflex.
HINWEIS: Die Abwesenheit von tail reflex ist ein Indikator für eine ausreichende Anästhesie. - Legen Sie eine Ratte in Rückenlage auf einer Operation Plattform mit einem Heizkissen, die Körpertemperatur zu halten. Rasieren Sie die Bauchregion der Ratte mit einem Tierhaarschneider und Haarentferner Lotion auf chirurgische Kontaminationen zu vermeiden. Scrub die sauber rasierten Bauch mit Betadin oder einem anderen Reinigungs Reagenz vor der Operation.
Hinweis: Es ist wichtig, einen sterilen Bereich während des gesamten Verfahrens aufrecht zu erhalten. - Machen Sie eine 2 cm lange Inzision entlang der Mittellinie des Bauches mit einem Skalpell. Mit normaler Kochsalzlösung, halten Sie die Bauchorgan feucht während der Operation. Verdrängen die Verdauungsorgane sorgfältig auf die Seite mit Wattebällchen die untere Hohlvene zu machen, die in der hinteren Peritonealdialyse Region liegt. Identifizieren Sie die Bauchaorta, die und in der Regel nebeneinander liegt auf derder inferior vena cava gelassen.
HINWEIS: Die Bauchaorta ist das Gefäß, das mit der Herzfrequenz in der Zeit pulsiert. - Pierce das Peritoneum mit einer Pinzette die Gefäße unter aufzudecken. Isolieren Sie vorsichtig die Bauchaorta neben den Nierenarterien und eine 8 cm lange 4-0 Seidennaht unterhalb der Bauchaorta zwischen den Ursprüngen des rechten und linken Nierenarterien passieren.
- Machen Sie einen losen doppelten Knoten mit der Naht; lassen einen Durchmesser von 3 mm Schleife und legen Sie die stumpfe und gebogen 22 G-Nadel in der Schleife. Ziehen Sie den Knoten um die Aorta und der Nadel, und dann entfernen Sie die Nadel sofort einen Durchmesser von 0,7 mm Verengung zu erreichen.
- Schließen Sie die Bauchhöhle mit 6-0 resorbierbares Nahtmaterial. Nähen Sie die Muskel- oder Hautschnitte mit einfachen Nähten. Um eine Infektion zu verhindern, reiben Sie die Operationsstelle mit einer Jodtinktur.
- Beobachten Sie das Tier vorsichtig, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, wie durch freie Bewegung angezeigtund die Nahrungsaufnahme. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Um zu verhindern, Schmerzen nach der Operation, behandeln die Ratte mit Paracetamol (300 mg / kg in 0,5 ml, ip).
HINWEIS: Die Benutzer sollten Analgetika verabreichen, wie durch institutionelle Politik genehmigt.
2. Gewebe und Blut-Beispielsammlung
- Bei 10 Wochen nach der Operation, wiegen die Ratte und anästhesieren es mit Pentobarbital (75 mg / kg in 0,5 ml, ip). Vor der Operation bestätigen die Tiefe der Anästhesie am Schwanz Reflex zu testen. Legen Sie die Ratte auf einer Metallplatte.
- Machen Sie eine 2 cm lange Inzision entlang der Mittellinie des Halses mit einem Skalpell. Verdrängen die Muskeln vorsichtig mit einer Pinzette in die Trachea zu belichten. Beachten Sie den Karotisarterien zu identifizieren, die an der Trachea parallel sind und pulsieren im Takt der Herzfrequenz.
- Sammeln Sie das Blut aus der Arteria carotis in ein Röhrchen zur Blutsammlung mit EDTA beschichtet. unmittelbar Zentrifugedas Blut für 15 min bei 2000 xg und sammeln des Plasmas. Lagern Sie das Blutplasma bei -80 ° C bis benötigt.
- Machen Sie eine 5 cm lange Inzision im Bereich der Brustwirbelsäule, um die Mittellinie des Xyphoid Prozess. Pierce die Membran mit scharfen Pinzette. Mit einer Schere, schneiden und den Brustkorb entlang der Mitte der clavicular Linien auf beiden Seiten entfernen, um das Herz aussetzen. Excise das Herz sorgfältig entlang der Herz- und Gefäß Grenzen. Entfernen Sie das Herz sanft ohne das Gewebe zu greifen.
- Montieren Sie das Herz auf einem Langendorff Perfusionsgerät modifiziert, indem der Aorten-Stamm zur Perfusion Nadel zu binden. Perfundieren das Herz mit Krebs - Puffer (enthaltend 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose [pH 7,4]) , um das Blut auszuwaschen. Wiegen Sie das Herz und berechnen das Herz-Gewicht-zu-Körper-Gewichts-Verhältnis. Befestigen Sie das Herz mit 4% Paraformaldehyd auf dem Eis. Denken Sie daran, eine Maske zu tragen, da Paraformaldehyddampf tox istic.
3. Gewebsfibrose Quantifizierung
- Legen Sie das Paraformaldehyd-fixierten Herzgewebe auf einer Gewebetrennvorrichtung und schneiden 2 mm dicke Abschnitte. Legen Sie die Gewebeschnitte in einer Einbettungskassette. Dehydratisieren, um das Gewebe durch eine Reihe von abgestuften Alkoholbädern (50%, 75%, 95% und 100% für 1 h jeweils).
- Infiltrieren des Gewebes mit Xylol für 1 Stunde und schließlich in Wachs für 1 Stunde. Legen Sie das infiltrierte Gewebe in eine Einbettungskassette und betten mit Paraffinwachs. Lagern Sie die eingebetteten Gewebe in Paraffinblöcken bei Raumtemperatur bis Mikrotom.
- Schneiden Sie das eingebettete Gewebe in 4 um dicke Abschnitte. Legen Sie die Abschnitte in einem 45 ° C Wasserbad. Tauchen Sie ein Glasobjektträger in das Wasserbad in einem Winkel und nähern sich allmählich der Paraffinschnitt Kanten teilweise die Befestigung an der Folie zu ermöglichen.
- Bewegen des Schlittens in und aus dem Bad potentiellen Lufttaschen unter dem Gewebeschnitt zu entfernen und eine bessere Befestigung zu erleichtern. Dry ter gleitet bei 37 ºC für 1 Stunde und lagern Sie sie bei Raumtemperatur für eine histologische Färbung.
- Legen Sie die Folie in einen Tank. Entparaffinieren Objektträger mit Xylol für 30 min und rehydratisieren in sequenziell verdünnten Alkohol (95%, 75% und 50% für 3 min jeweils) und schließlich in destilliertem Wasser. Eine ausreichende Picrosirius rote Lösung, um vollständig die Gewebeschnitte für 1 h abdecken. Spülen Sie die Folien in einer 0,5% igen Essigsäurelösung für zwei Änderungen vor, und führen Sie dann zwei Spülungen in absolutem Alkohol.
- die Folie der Luft trocknen und die Folie in Kunstharz mit einem Deckglas montieren. Fotografieren Sie die Folie in einem sichtbaren Lichtbereich.
HINWEIS: Der rote Bereich in der Fotografie zeigt eine Picrosirius rot positive Zone unter einem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Berechnen Sie den Prozentsatz der Picrosirius rot positive Zone über die gesamte Fläche, die das Ausmaß der Fibrose zeigt 11.
4. Blut Troponin Quantifizierung
- Quantifizieren Plasma Troponin Ebenenunter Verwendung eines Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Assay jede Probe in zweifacher Ausfertigung. Last 50 ul Blutplasma und 50 ul einer Antikörper-Cocktail in die Vertiefungen. Verschließen Sie die Platte und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler bei 400 Umdrehungen pro Minute.
HINWEIS: Cardiac Troponin in Plasma ist ein Marker für Herzschädigung. - Saugen Sie die Flüssigkeit und Waschen jeder Vertiefung mit 250 ul Waschpuffer dreimal. Nach der letzten Waschung, kehren die Platte und tupfen sie gegen die saubere Papiertücher überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- 100 l Tetramethylbenzidinsubstrat in jede Vertiefung und Inkubation für 10 min im Dunkeln auf einem Plattenschüttler bei 400 Umdrehungen pro Minute. 100 l Stopplösung in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 1 min zu mischen. Aufzeichnen der optischen Dichte (OD) bei 450 nm.
HINWEIS: Die Troponin-Konzentration auf dem OD-Wert verhältnismäßig ist.
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Representative Results
10 Wochen nach der Bauch Aortakonstriktion Chirurgie, die resultierende Herzpathologie untersucht. Die Herz Histologie wurde durch Berechnung des Verhältnisses des Herzgewichtes zum Körpergewicht und durch Detektieren der Menge von Kollagen in das Herz gemessen. Herzschädigung wurde durch Messung der Plasma-Troponin-Konzentration bestätigt.
Wie in 1A gezeigt, wurde die Herzgröße nach abdominal aortic Einschnürung Operation vergrößert, wie durch eine höhere Herzgewicht-zu-Körpergewicht - Verhältnis (1B), ein Indikator für kardiale Hypertrophie zeigte. Durch die Verwendung Picrosirius Rotfärbung, fibrotische Myokard gefärbt mit einem erhöhten Kollagengehalt (rot) von normalen Bereichen (gelb, Abbildung 2) zu unterscheiden. Herzfibrose wurde nach abdominal aortic Einschnürung Chirurgie (2B) erhöht im Vergleich zu c edienelemente (2A). Die Ergebnisse korrelieren mit Plasma Troponin Konzentrationen (Abbildung 3). Eine erhöhte Troponin-Konzentration zeigt an, dass kardialen Remodeling und Verletzungen beim Drucküberlastung aufgetreten. Zusammengenommen Bauch-Aorten-Verengung führt offensichtlich Herzschädigung, markiert Herzhypertrophie und Gewebeumbau.
Abb . 1: Herzhypertrophie bei Druckbelastung (A) Repräsentative Herz und (B) Herz-Gewicht-zu-Körper-Gewichtsverhältnisse sind 10 Wochen nach der Bauch Aortakonstriktion Operation gezeigt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Student-t-Test bewertet. * P <0,05 versus Kontrolle. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Herzfibrose bei Drucküberlastung.
Picrosirius-Rot-Färbung erhöhte Kollagen-Expression ergab. (A) Repräsentative Picrosirius rote Färbung (Maßstabsbalken = 200 & mgr; m) und (B) Prozentsatz der fibrotischen Bereich 10 Wochen nach der Bauch Aortakonstriktion Chirurgie. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Student-t-Test bewertet. * p <0,05 versus Kontrolle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Herzschädigung während Drucküberlastung.
Blutplasma-Troponin-Konzentrationen wurden 10 Wochen nach der Bauch Aortakonstriktion Operation gemessen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von sechs unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Student-t-Test bewertet. * p <0,05 versus Kontrolle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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