Abstract
Frisläppandet av extracellulära vesiklar (EVS) inklusive små endosomala härrörande exosomes (Exos, diameter <100 nm) och stora plasmamembran härledda mikrovesiklar (MV, diameter> 100 nm) är en grundläggande cellulär process som sker i alla levande celler. Dessa vesiklar transportproteiner, lipider och nukleinsyror som är specifika för deras cell ursprungsland och in vitro studier har visat sin betydelse som förmedlare av intercellulär kommunikation. Elbilar har framgångsrikt isolerats från olika kroppsvätskor och särskilt elfordon i blod har identifierats som lovande biomarkörer för cancer eller infektionssjukdomar. I syfte att möjliggöra studier av MV subpopulationer i blod, presenterar vi ett protokoll för den standardiserade isolering och karakterisering av MV från perifera blodprover. MV pelleteras från EDTA-antikoagulerat plasmaprover från differentiell centrifugering och vanligtvis har en diameter på 100 - 600 nm. På grund av deras större storlek, kan delätt att studeras med flödescytometri, en teknik som rutinmässigt används i klinisk diagnostik och tillgängliga i de flesta laboratorier. Flera exempel för kvalitetskontroll analyser av de isolerade MV ges och markörer som kan användas för diskriminering av olika MV subpopulationer i blod kommer att presenteras.
Introduction
Under de senaste åren har många in vitro studier har visat att extracellulära vesiklar (EVS) spelar en viktig roll i kommunikationen mellan. Levande celler skjul ständigt vesiklar som skiljer sig i storlek, innehåll och biogenes. De mest studerade elbilar är exosomes som härrör från det endosomala system där de lagras som intraluminala blåsor i multivesikulära kroppar. När den senare säkring med plasmamembranet, är de inneslutna blåsor utsläppt som exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). En andra population av EV som har fått allt större uppmärksamhet under de senaste åren är stora mikrovesiklar (MV, diameter 100 - 1000 nm), vilka knoppas av direkt från plasmamembranet 2.
Båda typerna av vesiklar är omgivna av ett lipiddubbelskikt och innehåller nukleinsyror, t.ex. DNA, mRNA eller miRNA 3-5, och en uppsjö av proteiner som de kan överföra till angränsande calnar. Även i allmänhet proteinsammansättningen av vesiklar speglar tillståndet i cellen ursprungs vissa proteiner verkar vara selektivt riktad och berikas på elfordon 1. Ett stort forskningsintresse är att karakterisera elfordon från onormala och sjuka celler för att definiera specifika EV signaturer som kan tillåta användning av elbilar som nya biomarkörer. Särskilt i cancer, där ofta själva tumören är inte lättillgänglig, kan flytande biopsier riktar tumörspecifika elbilar i blod möjliggöra övervakning av terapisvar eller hjälp att karakterisera den primära tumören utan att invasiva procedurer 6.
Faktum är att elbilar har redan framgångsrikt isolerats från olika kroppsvätskor, inklusive urin 7 CSF 8, bröstmjölk 9 eller blod 10. Flera studier identifierade förändringar i EV räknas och sammansättning i olika mänskliga sjukdomar. Till exempel, i sepsispatienter antalet pro-koagulerande MV ärsignifikant ökad jämfört med friska individer 11. Även hos patienter med svår cerebral malaria en ökning av den totala MV i blod kan observeras och räkningar av blodplätthärledda MV korrelerar med koma djup och trombocytopeni 12. Andra studier rapporterar ökat antal endotelhärledd vesiklar hos patienter med systemisk lupus erythematosus eller hjärtsvikt och när det gäller det senare, detta korrelerar med en högre sannolikhet för kardiovaskulära händelser 13,14.
Särskilt i cancer, är elbilar i blod för närvarande diskuteras som biomarkörer med diagnostiska och prognostiska värde. Nivåer MV som uttrycker tumörassocierade proteiner såsom MUC1, EGFR eller FAK verkar vara förhöjda i blodet hos bröstcancerpatienter 15,16. Även för Exos har nya studier visat att blodbaserade Exos bär tumörspecifika antigener såsom Glypican-1 för pankreascancer eller Del-1 för bröstcancer möjliggöra tidig sjukdom deskydd med hög specificitet och sensitivitet 17,18. Dessutom kan serum härlett tumör Exos innehålla DNA, som kan användas för detektion av mutationer, såsom KRAS och p53 vilket antyder deras användning för terapi prediktion 19. Nya framsteg har visat att analys av Exos i blodet hos glioblastom patienter som använder en specifik mikroflödes chip tillåter övervakning av terapi 20. Sammantaget dessa fynd tyder på att analys av sjukdomsspecifika subpopulationer av vesiklar ger värdefull information om diagnos, prognos samt behandlingsalternativ och framgång.
Emellertid är isolering och analys av Exos från blod tidsödande, kräver speciell laboratorieutrustning och därför inte ännu är lämpad för rutinmässig klinisk diagnostik. I motsats härtill kan MV isoleras mycket snabbare och på grund av sin större storlek, kan lätt analyseras genom flödescytometri utan att man behöver koppla dem till latexpärlor som det är nödvändigt för Exos 18, 21. Således, här presenterar vi ett protokoll som kan användas för den standardiserade isolering av MV från blodprov och den efterföljande karakteriseringen av MV subpopulationer genom flödescytometri. Detta protokoll gör det möjligt för vidare studier och djupgående karaktärisering av MV profiler i stora patientgrupper som kommer att krävas för att kunna använda MV för vardagliga klinisk diagnostik.
Protocol
Alla experiment inklusive försökspersoner har godkänts av den lokala etiska kommittén (godkännandenummer. 3/2/14). För valet av patienter bör det noteras att flera faktorer såsom ålder, kön, nuvarande terapikurer och många fler kan påverka MV komposition i blodet och därför bör beaktas före provsamling 22,23.
1. Framställning av plasmaprover
- Rita 1 - 2 rör med blod donator genom en 21-gauge fjärilsnål i en Vacutainer bloduppsamlingsrör innehållande EDTA (1,6 mg / ml blod). Se till att invertera röret (s) flera gånger för att garantera en effektiv blod antikoagulantia.
OBS: Den rekommenderade volymen av blod för efterföljande flödescytometri och Western Blot-analys är 5 - 15 ml. För att förhindra MV nedbrytning och förlust, bör blodproverna tas hanteras <30 min efter avlägsnande av blod. - Förbereda plasmaprover genom centrifugering av prover för 15 min vid 1200 xg vidrumstemperatur (RT).
- Applicera ett ventilfilter i syfte att hjälpa separationen av plasma (= övre skikt) från resterande blodkroppar (= undre skikt).
- Överföra plasmat in i en 15 ml rör.
- Centrifugera i 15 minuter vid 1500 xg, RT för att pelle större celldebris och avlägsna återstående trombocyter.
- Överför supernatanten till ett 15 ml rör och direkt fortsätta med MV isolerings- eller lagra prover i upp till 6 månader vid -20 ° C.
OBS: Den presenterade protokollet kan också användas för att isolera MV (och Exos) från cellkultursupernatanter. I syfte att göra det, odla celler vid 60-80% konfluens i 24 - 48 h i odlingsmedium kompletterat med vesikel-utarmat FCS, och sedan samla in supernatanten. Centrifugera i 5 minuter vid 750 xg, 4 ° C för att utarma rest flytande celler, fyll supernatanten till ett nytt 15 ml rör och centrifugera igen under 5 minuter vid 1500 xg, 4 ° C för att pelletera större celldebris. Denna supernatant kan sedan användas för isolering av MVsåsom beskrivits i steg från 2,1 till 2,16.
2. Isolering av MV
- Överföra plasmaprovet i en lämplig centrifugrör. Om nödvändigt, fyller upp röret med PBS i syfte att späda ut provet och förhindra kollaps av tunnväggiga rör under centrifugeringsförfarande.
- Centrifugera i 35 min vid 14000 xg, 4 ° C.
- Dekantera supernatanten hålla rör vänt upp och ner och sätta på en pappershandduk. Vänta 3-5 minuter tills alla kvarvarande supernatanten har dränkts in handduken och därigenom avlägsnas från provet.
- Suspendera MV pelleten i 1000 mikroliter PBS, överföring till ett 1,5 ml rör och centrifugera i 35 minuter vid 14.000 xg, 4 ° C i en bordscentrifug.
- Aspirera supernatanten.
- Resuspendera MV pelleten i 50-500 | il PBS, beroende på storleken av pelleten. Alternativt lyse MV direkt, t.ex., i RIPA-buffert (150 mM NaCl / 0,1% SDS / 0,5% Na-deoxicholat / 1% Triton X-100/50 mM Tris, pH 7,2)för efterföljande Western Blot-analys. Lagra MV vid -20 ° C. De kommer att förbli stabil i flera månader, men undvika upprepade frys-tö-cykler.
- Valfritt: Bestäm MV proteinkoncentrationen med en proteinanalys (t.ex. Bradford eller Lowry-metoden) för att bedöma MV utbyten eller dos MV för efterföljande experiment.
- Om ytterligare Exos är att vara isolerad från de plasmaprover, dekantera supernatanten från steg 2,3 till en ultracentrifugering rör och centrifugera i 2 h vid 110.000 xg, 4 ° C. Dekantera supernatanten såsom beskrivs i steg 2,3, resuspendera Exo pelleten i 1000 mikroliter PBS och överför till små (1,5 ml) ultracentrifugeringsrören.
- Ultracentrifug under 2 h vid 110.000 xg, 4 ° C, aspirera supernatanten och återsuspendera Exo pelleten i 50-75 | il PBS eller RIPA-buffert.
3. Karakterisering av MV genom flödescytometri
- Överföring 15 mikroliter PBS + 1% vesikel-utarmade fetalt kalvserum (FCS) i en flödescytometri rör.
OBS: Vesikel-utarmade FCS framställs genom centrifugering av värmeinaktiverat (30 min vid 56 ° C) FCS i 18 timmar vid 110.000 xg och filtrering av supernatanten genom ett 0,2 pm filter såsom beskrivits tidigare 24. - Tillsätt 5 mikrogram (i fallet med låg avkastning 3 mikrogram är också tillämpligt) av MV i PBS.
- Inkubera prover för 30 min vid RT för att blockera ospecifika bindningsställen på MV ytan och därigenom minska bakgrundsfärgning.
- Lägg till en fluorescensmärkt antikropp mot proteinet av intresse. Titrera mängden antikropp som användes för färgning före användning i syfte att bestämma den optimala koncentrationen och garanterar en låg signal-till-brusförhållandet. Se till att även omfatta en tub med ofärgade MV som negativ kontroll och ett rör av MV färgade med matchande isotypkontrollantikropp vid samma koncentration (t.ex. om ett mikrogram av antikropp används, också använda en ig av isotypkontroll entibody) att kvantifiera bakgrundsfärgning.
OBS: Det är också möjligt att utföra multi flödescytometri genom att lägga till flera antikroppar kopplade till olika fluorokromer. - Inkubera under 20 min vid RT i mörker.
- Lägga 250 mikroliter PBS och fortsätta med mätning av provet med användning av en flödescytometer.
- I det fall att proverna inte kan mätas omedelbart, tillsätt 150 | il PBS och 50 pl 4% paraformaldehyd (PFA) för att fixera prover och förvara vid 4 ° C. VARNING: PFA är giftig. Använd handskar och lämplig personlig skyddsutrustning.
- Minska tröskeln för flödescytometern till lägsta möjliga värde och söka efter MV befolkningen som använder en framåtspridning (FSC) mot sidospridning (SSC) tomt i logaritmisk skala. Grind på MV befolkning och utvärdera fluorescerande signal i en motsvarande histogram.
4. Karakterisering av MV genom Western blotting
- Suspendera MV pelleten direkt ien lämplig lyseringsbuffert (t.ex., RIPA-buffert).
- I händelse av att MV pelleten redan har återsuspenderades i PBS, späda ut det minst 1: 1 i en lämplig lyseringsbuffert (t.ex., RIPA-buffert).
- Bestämma proteinkoncentrationen av MV provet, t.ex. genom Lowry-analys.
- Förbered 10-20 mikrogram av MV i 22,5 mikroliter RIPA buffert. Tillsätt sedan 7,5 mikroliter 4x Laemmli laddningsbuffert och värme under 5 min vid 95 ° C.
- Belastnings proverna på en polyakrylamidgel och utföra elektrofores och immunoblotting enligt standardprotokoll.
- Efter överföring av proteinerna på membranet, utför en Ponceau-färgning som en laddningskontroll enligt standardprotokoll.
- Avfärgning membran i TBST under 5 min vid RT.
- Block membran under 30 minuter upp till en timme vid RT i 5% BSA i TBST.
- Inkubera membranet med den primära antikroppen vid 4 ° C över natten eller under 2 h vid RT.
- Tvätta membranet med TBST 3 x 5 min.
- Inkubera membranet med HRP-kopplad sekundär antikropp vid en utspädning av 1: 10000 i 5% BSA. Obs: Vid höga bakgrundssignaler, använder mjölkpulver i stället för BSA.
- Tvätta membranet med TBST 3x 5 min.
- Utveckla membran med en ECL detektionsreagens och upptäcka signaler på kemiluminescens filmer eller ett kemiluminiscens avbildningssystem.
OBS: För att diskriminera MV från Exos, proteiner som tubulin, actinin-4 eller mitofilin kan användas som bör huvudsakligen vara närvarande på MV 16,25. Uppmärksamma att de flesta tetraspanin antikroppar (t.ex. CD9, CD81), som används som markörer för Exos, inte arbeta under reducerande betingelser och bör därför framställas i icke-reducerande laddningsbuffert följt av upphettning under 10 minuter vid 70 ° C.
Representative Results
För att kvantifiera utbytet av MV som kan isoleras efter den beskrivna protokollet, vi beräkning av värdet på MV som isolerats från blodprover från 10 donatorer. MV utbyte, som bedömdes i en Lowry-proteinanalys, sträckte sig från 10 upp till 30 mikrogram med ett medelvärde på 19,2 mikrogram MV per ml blod (tabell 1). Partikelkoncentrationen bestämdes genom nanopartikelspårningsanalys (NTA) varierade från 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 med ett medelvärde av 5,9 x 10 9 partiklar per ml plasmaprov (tabell 2). Ytterligare karakterisering av de MV genom transmissionselektronmikroskopi avslöjade en population av vesiklar med en diameter> 100 nm som var omgivna av ett lipiddubbelskikt och som inte innehöll några cellorganeller (Figur 1A). NTA bekräftade att storleken av de isolerade MV varierade från 100 upp till 600 nm (Figur 1B) och den genomsnittliga MV storleken var 201nm (Figur 1C). Färgning för typiska MV och Exo markörer genom Western blotting visade att de isolerade MV var positiva för tubulin och bara visade en svag uttryck för CD9 och CD81, medan Exos var negativa för tubulin och anrikas i CD9 och CD81 (Figur 2).
Analys av de isolerade MV från flödescytometri (figur 3A) avslöjade en definierad vesikel population som skulle kunna gated med användning av samma parametrar som normalt används för MV isolerade från cellodlingssupernatanter och det var helt klart skiljer sig från den bakgrundssignal som erhålls genom mätning av PBS + 1% vesiklar-utarmade FCS utan tillsats av MV (figur 3B). För att analysera de olika MV populationer som finns i blod, var MV färgades med etablerade markörer för de olika blodcellspopulationer, t.ex. CD62P för blodplätthärledda MV, CD45 för leukocyt-härledda MV, CD235a förröda blodkroppar härledda MV och CD62E för endotelceller härrörande MV (Figur 4). Denna karakterisering visade att den procentuella andelen av MV subpopulationer skilde bland de undersökta donatorblodprover, medan majoriteten av MV tycktes spridas av blodplättar i alla prover.
Figur 1: storleksfördelning av MV isolerade från perifert blod. A, Isolerade MV visualiserades genom transmissionselektronmikroskopi. B, Representative nanopartikelspårningsanalys (NTA) från MV som illustrerar storleksfördelningen av vesiklarna. C, Den genomsnittliga MV storlek från 10 oberoende preparat mättes med NTA (medel). Klicka här för att se alArger version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av isolerade MV med Western blotting. Differential proteinuttryck på de isolerade MV och Exos från två donatorer visualiserades genom Western blotting. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Analys av MV med flödescytometri. A, MV först visualiseras på framåt (FSC) mot sidescatter (SSC) tomter till gate på respektive MV befolkningen. Därefter är dessa MV kännetecknas för antigenet av intresse genom att med användning av fluorescensmärkta antikroppar riktade mot antigenet. B, Typiska FSC kontra SSC tomter för MV isolerade från plasma från två donatorer. Som jämförelse, är en typisk kurva för tumörcell härledda MV från A549 lungcancerceller isolerade från cellodlingssupernatant samt en negativ kontroll med enbart PBS + 1% blås utarmat FCS utan MV visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av isolerade MV med flödescytometri. MV från tre donatorer karakteriserades för expression av etablerade blodmarkörer (red) av flödescytometri. Respektive isotypkontroller visas i grått.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | MV / mL blod [ig] |
| # 1 | 29,4 |
| # 2 | 10,3 |
| # 3 | 15,2 |
| # 4 | 31,1 |
| # 5 | 18,8 |
| # 6 | 22,7 |
| # 7 | 19,1 |
| # 8 | 18,7 |
| # 9 | 15,0 |
| # 10 | 11,9 |
Tabell 1: MV proteinutbytet från perifera blodprover.
| Prov | MV / ml plasma [partikelantalet] |
| # 1 | 6.42E + 09 |
| # 2 | 2.36E + 10 |
| # 3 | 1.88E + 09 |
| # 4 | 6.51E + 09 |
| # 5 | 3.48E + 09 |
| # 6 | 4.57E + 09 |
| # 7 | 2.09E + 09 |
| # 8 | 1.66E + 09 |
| # 9 | 2.54E + 09 |
| # 10 | 6.20E + 09 |
Tabell 2: MV Partikel Avkastning från perifera blodprover.
Discussion
Nyligen genomförda studier på elbilar i blodet har visat att EV sammansättning och räknar ändras under orsaken till flera sjukdomar. Därför analys och ytterligare karakterisering av dessa elbilar är av stort intresse för att ytterligare utvärdera deras potentiella användning som sjukdoms biomarkörer för diagnos och prognos eller att utvärdera behandlingssvar. Protokollet som vi presenterar här möjliggör isolering av vesiklar med en diameter på upp till 600 nm, vilket inte innehåller några cellorganeller. Dessa observationer är i linje med den nuvarande definitionen av MV och utesluta förekomsten av apoptotiska kroppar 2. Med hjälp av Western blotting, kunde vi visa att de isolerade MV visar en hög expression av tubulin, medan tetraspanins CD9 och CD81 som ofta används som Exo markörer endast något uttrycks. Detta bekräftar att MV skiljer sig från Exos och passar till de senaste djupgående karakterisering och jämförelse av båda EV populationerna av proteomik 25.
innehåll "> Under förvärv av blodprov, är det viktigt att hålla tiden mellan venpunktion och förberedelse plasma så kort som möjligt för att förhindra MV nedbrytning. Dessutom skulle långvarig lagring av blodprover leda till aktivering av blodkroppar som orsakar förbättrad MV shedding och slutligen apoptos, vilket resulterar i frisättning av apoptotiska kroppar. ett annat viktigt övervägande för MV isolering är att förhindra kontaminering av MV preparat med plasmaproteiner eller mindre Exos. Därför är det viktigt att avlägsna så mycket av supernatanten som möjligt efter spinning ner MVS vid 14.000 x g. Sedan pelleten normalt är synlig och tätt fäst på väggen av röret, supematanten kan lätt avlägsnas med en pipettspets. i motsats till Exos vilka tenderar att bilda aggregat under framställningen genom höghastighetsultracentrifugering och är ofta svåra att resuspendera, inte detta problem uppstå med MV.Vår studie visar att det är möjble att karakterisera MV subpopulationer som är närvarande i blod genom flödescytometri. Även om detektionsgränsen för de flesta flödescytometrar är ca 200-300 nm, var MV reproducerbart mätt i givare samt cellodlingsprover med samma parametrar för analys och grindar som klart tillåts deras skillnad från bakgrundssignaler. Det är viktigt att kontrollera före mätningarna att den PBS som användes för analyserna inte innehåller några förorenande partiklar som kan orsaka en hög bakgrund under flödescytometri (Figur 3). Även om vissa mindre MV inte kan fångas i en flödescytometrisk metod upptäckte vi MV från alla stora blodcellpopulationer (t.ex. blodplättar, röda blodkroppar, leukocyter, endotelceller). I våra analyser har vi använt standard markörer för de olika blodkroppar som tidigare har hittats på MV 26 - 29. Det bör noteras att för att uppnå bästa möjliga resultat genom flödescytometri, than mängden och koncentrationen av alla antikroppar skall titreras på en MV prov som uttrycker antigenet av intresse. Om specifika MV subpopulationer i blod skall identifieras med högre specificitet, är det möjligt att utföra dubbel färgning mot två olika antigener närvarande på respektive MV och bara överväga alla dubbla positiva MV för efterföljande analyser 23. För närvarande finns det insatser för att definiera ett standardsortiment av MV subpopulationer i blodet hos friska individer 23,30. Dessa studier har redan visat att blodplätthärledda MV utgör den största befolkningen av MV i blod som är i överensstämmelse med våra observationer.
En fördel med flödescytometri att karakterisera MV prover är att denna metod är redan väl etablerad för diagnostiska ändamål i de flesta kliniska centra som skulle tillåta en eventuell användning av MV som biomarkörer i vardags klinisk diagnostik. Tidigare studier på elbilar i blod som har mest fokused på mindre Exos förlita sig på antingen specifika sorterings förfaranden för att selektivt analysera önskade Exo målgruppen 31,32 eller kräva ett tidskrävande (2 dagar) isolering process med koppling av Exos till latexkulor före analys 18. Våra egna opublicerade observationer tyder på att flödescytometrisk analys av MV från hela blodberedningar tillåter även detektion av MV såsom tumörhärrörande MV utan sådana urvalsprocesser.
Sammantaget protokollet presenteras här möjliggör snabb isolering av MV från perifera blodprover med standardlaboratorieutrustning och deras efterföljande karaktärisering med hjälp av flödescytometri och Western blotting. Hela processen kan utföras i ca 2 timmar som kommer att underlätta framtida studier på MV profiler i patienternas blod som krävs för att bedöma potentialen för MV som sjukdoms biomarkörer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5 µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5 µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8 µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1 µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56 °C) |
| filter 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5,000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 | |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
