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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Die Prüfung der Host-Phänotypen in Published: February 22, 2017 doi: 10.3791/55170
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Biological Sciences, Sam Houston State University, 2Irma Lerma Rangel College of Pharmacy, Texas A&M University Health Science Center

Summary

Diese Studie umfasst Methoden, um Auswirkungen auf ein Modell Fisch-Host folgende Veränderung der Haut und Darm microbiome Gemeinden Zusammensetzung durch ein Antibiotikum zu offenbaren.

Introduction

Es wurde festgestellt, dass Antibiotika können die menschliche microbiome stören zu dysbiosis führt, eine mikrobielle Gemeinschaft Ungleichgewicht bedeutet. Die kompositorische Veränderung der Mikrobiota nach einer Antibiotika - Behandlungen wurde die Vielfalt der Gemeinschaft gezeigt zu senken, wichtige Mitglieder zu reduzieren und Gemeinschaft Stoffwechsel verändern, vor allem im Darm 1, 2. Antibiotic Störung des Darms microbiome kann Kolonisationsresistenz auf Clostridium difficile 3, 4 und 5 Salmonella verringern.

Zusätzlich hat die Unterbrechung der Mikrobioten zur Entwicklung vieler Syndromen und Krankheiten bei Menschen in Verbindung gebracht worden (zB Antibiotika-assoziierter Enterokolitis, entzündliche Darmerkrankungen, Stoffwechselstörungen, etc.). Antibiotika sind ebenfalls weit verbreitet in der Landwirtschaft als Wachstumsförderer umgesetzt inVieh und Geflügel Produktion 6. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Tools ist nicht ohne Nebeneffekte, die im raschen Anstieg der Antibiotikaresistenz offensichtlich ist, sowie die Auswirkungen eines gestörten microbiome hat mit seinem bewohnter Gastgeber. Viele Studien haben gezeigt, dass Breitspektrum-Antibiotikum Nutzung hat langfristige Folgen für die Struktur und Funktion der Mikrobiota, aber die Nebenwirkungen von einem antibiotika gestört microbiome Auswirkungen auf Host-Physiologie sind nur Spekulationen, die noch unterstützt werden.

Das Zusammenspiel zwischen Gastgeber, Mikrobiota und Antibiotika ist bei weitem nicht in prägnanter Weise verstanden zu werden. Daher ist ein einfaches und besser lenkbar Modell vorteilhaft Licht auf die hochkomplexen Säugersystem zu vergießen. Schleimhäuten beim Menschen, einschließlich Darm, Hafen die höchste Dichte und Vielfalt von Mikroben, und auch die intimsten Mikrobe-Wirt-Interaktionen. Die Schleimhaut Haut microbiome Fisch Angebote sehrere Vorteile als Modellsystem. Die Teleostei (Knochenfische) ist eine der frühesten Abstammungslinien innerhalb der Vertebrata Bedeutung zu divergieren , dass teleosts sowohl angeboren haben und erworbene Immunsystem , die eine Beziehung mit symbiotischer Bakterien-Gemeinschaften 7 zusammen entwickelt haben. Fischhaut teilt viele Eigenschaften mit Typ - 1 - Schleimhautoberflächen von Säugetieren, wie physiologische Funktionen, Immunität Komponenten und die Anordnung von Schleim-produzierenden Zellen 8. Die äußere Lage der Fischhaut Schleimhautoberfläche bietet eine microbiome leicht experimentell manipulieren und Probe.

Die westliche mosquito, Gambusia affinis (G. affinis), ist ein Modell , Fisch, 9 Paarung und Toxikologie in der Vergangenheit verwendet wurde , für das Studium, 10, 11. In Anbetracht der geringen Größe, Bevölkerung Hülle und Fülle in der Wildnis als eine invasive Spezies, m inimal Pflegekosten und hardy Natur, haben wir G. affinis als Schleimhaut microbiome Modell entwickelt. Ferner teilen Gambusia die Physiologie der Geburt mit viviparous Säugetiere junge leben, die in Fischarten ungewöhnlich ist. Wir haben die umfangreichste Studie zum Zeitpunkt der Fisch normalen Mikrobiota Haut mit 16S Profilierung mit Gambusia 12. Weitere Arbeiten zeigten , drei negative Auswirkungen auf die Host folgende Störung der Haut und der Darmflora mit einem Breitspektrum - Antibiotikum 13.

Fünf verschiedene Effekte wurden in der Fisch folgenden Antibiotika Exposition untersucht. Die meisten etablierten Host Nutzen der microbiome ist wettbewerbsfähig Ausschluss von Krankheitserregern. Der Fisch Erreger Edwardsiella ictaluri ist bekannt , 14 Ausbrüche von magensaftresistenten Septikämie in kommerziellen Wels Farmen zu verursachen. E. ictaluri hat auch Zebrabärbling zu letal infizieren gezeigtclass = "xref"> 15, 16 und 17 Gambusia. Eine Herausforderung mit diesem Erreger aus der Wassersäule kann als Maß der Ausgrenzung dienen. Als Vergleich zu Anfälligkeit für einen einzelnen Erreger, Überleben während der Exposition gegenüber einer hohen Dichte von gemischten Organismen wurde ebenfalls durchgeführt. Exkremente und organisch-reichen Boden wurden als häufig angetroffene Quellen mikrobieller Gemeinschaften eingesetzt.

Eine andere etablierte Rolle der bakteriellen Darm Gemeinschaft durchführt, ist Nährstoffverarbeitung und Energieertrag, wodurch die Gesamtnahrungsaufnahme für den Wirt zu beeinflussen. Als grobe Messung der Ernährung wurde Fischkörpergewicht im Vergleich vor und nach einem Monat eine Standard-Diät gefüttert. Antibiotika-behandelten Fische als ein durchschnittliches Gewicht verloren, während die Steuerung Fisch im Durchschnitt Gewicht im Laufe des Monats gewonnen. Der Mechanismus für diesen Mangel an Gewichtszunahme ist unklar. Ein möglicher Faktor ist Transitzeit der Nahrung im Darm. Ein GI Motility-Methode wurde von Zebrabärbling (Adam Rich, SUNY Brockpo, persönliche Mitteilung) angepasst Laufzeit zu bestimmen. Es wurde noch nicht bestimmt worden, wenn Antibiotika-behandelten Fische eine veränderte Laufzeit haben.

Eine gemeinsame Herausforderung von allen Organismen in der Natur erlebt, vor allem Fisch, ist osmotischer Stress. Gambusia wurden schnell anpassen angezeigt , wenn akut in hohen Konzentrationen von Salinität 18 betont. Überraschenderweise Fisch mit einem Antibiotikum veränderten microbiome zeigte gesenkt Überleben zu einem hohen Salzstress. Der Mechanismus für diesen neuartigen Phänotyp wird untersucht. Eine weitere häufige Belastung auf Wassertiere, insbesondere in Aquarien, ist toxisch Formen von Stickstoff (Ammoniak, Nitrat und Nitrit). Überleben gegen Nitrat war nicht signifikant verschieden zwischen Antibiotika-behandelten und Kontrollfische. Die Methoden in diesem Manuskript präsentiert mit Gambusia oder ähnlichen Fischmodellorganismen wie Zebra verwendet werdenFisch und Medaka, Phänotypen in der Fisch folgenden experimentellen Manipulation zu messen.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden unter Genehmigung von IACUC Protokolle durchgeführt, nummeriert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 und 14-04-17-1018-3-01.

1. Animal Collection, Handhabung und Ethical Pflege

  1. Sammeln Sie Gambusia affinis aus dem Feld Website (Bestimmungsführer bei http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) mit einem kleinen Kescher und Platz in 19 L Eimer mit. Verwenden Sie visuelle Inspektion Arten zu identifizieren.
  2. Rest Fisch für 1 bis 2 d in einem Eimer mit Teichwasser. Danach übertragen Fisch in 76 oder 189 Tanks L Aquarium gefüllt mit Halbteichwasser / Halbleitungswasser bei 25 ° C, belüftet mit einer sprudelnden airstone. Mit einem kleinen Kescher, wenn der Fisch Handhabung als minimal, um ihre Haut microbiome stören.
    HINWEIS: Fischdichte sollte nicht höher sein als 20 Fische / 38 l Aquarienwasser. Die Fische werden für mindestens 5 d vor dem Experiment in das Aquarium akklimatisiert.
  3. Feed-Fisch auf einer täglichen Gabe mit 5 mg Flockenfutter pro Fisch. Hold Fisch mit einem 12 h Licht / 12 h Dunkel-Zyklus.

2. Initial Antibiotika Exposition für alle Experimente

  1. Zeichnen Sie alle Fische aus jedem Experiment aus dem gleichen Aquarium, legen Sie in zwei getrennte Gruppen (behandelt: ausgesetzt Antibiotikum & Kontrolle: unbelichtet) in 19 L Eimer. Frühere Daten zeigt gesammelt, dass die Fische in der gleichen Aquarium haben Haut microbiomes homogenisiert, die wenig Variation in der Gemeinschaft Zusammensetzung haben. 12
  2. Bei Versuchen, halten Fisch in 2 l künstlichen Teichwasser (APW; 0,33 g / l CaCl 2, 0,33 g / l MgSO 4, 0,19 g / l NaHCO 3) , die im Autoklaven vor dem Gebrauch sterilisiert wird.
  3. Bereiten Sie die Rifampicin Antibiotika-Stammlösung durch Zugabe von 50 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO). Rifampicin ist ein repräsentatives Breitspektrum-Antibiotikum, das für die Fische nicht toxisch ist. Bei Menschen und Mäusen, es verteilt sich gut in den Geweben.
  4. Von der Rifampicin Lager verwalten eine endgültigeKonzentration von 25 ug / ml in 2 l APW für antibiotische Exposition der 3 Tage Fischgruppe behandelt. Beachten Sie, dass nach 3 d, kultivierbaren Haut Bakterienzahlen, die der vorbehandelten Fischhaut ähnlich zurückzukehren.
  5. Parallel dazu halten eine Gruppe von unbehandelten Fischen in APW und geben eine äquivalente Menge von DMSO (0,5 ml pro Liter APW) in die Wassersäule als Kontrollgruppe zu handeln.
  6. Wie Versuche sollen Wirkungen eines Antibiotikums veränderten microbiome auf Fisch Phänotypen zu messen, um Effekte direkt aus dem Antibiotikum selbst zu vermeiden, nach der dreitägigen Antibiotika-Exposition (oder Kontrolle) Zeit, Transfer Fisch in einen Eimer mit 2 l frisch APW.
    1. Verwenden Sie eine 10 h Ruhezeit so das Antibiotikum durch die Körper der Fische entfernt wird. Basis dieser Eliminationszeit auf Experimente, in denen Fische für drei Tage auf 25 ug / ml Antibiotikum ausgesetzt waren. Euthanize die Fische durch das Rückenmark von Schlacht gefolgt schnippeln, homogenisieren dann den ganzen Körper eine Gewebemühle verwendet wird.
    2. Bestimmen Sie Antibiotikum Anwesenheit von 50 & mgr; l dieser Suspension nach 0,2 & mgr; m-Filterung in der Mitte einer Agar-Petrischale platzieren. Machen Sie ein Loch für diese Suspension durch ein auf dem Kopf nach unten drücken sterilen 200 ul Pipettenspitze in den Agar, die einen kleinen Stecker entfernt.
    3. Verwenden Sie Agarplatten mit 20 ml gemessenes Volumen von Nähragar und gleichmäßig verteilt ein Wattestäbchen mit einem Indikatororganismus, Bacillus subtilis, die Rifampicin empfindlich ist. Beziehen Sie die B. subtilis aus einem Nähragar bei 25 ° CO / N inkubiert und das Wattestäbchen mit einer Kolonie zu erhalten. bei 25 ° C eine Hemmzone nach Inkubation über Nacht Beobachtung zeigt das Vorhandensein von Antibiotika in den Fischgeweben.

3. Microbiome Extraction

  1. Extrahieren einer Haut microbiome Probe aus der äußeren Schleimhaut Epidermis durch den Fisch in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml sterilem PBST (137 mM Na gefüllt PlazierenCl, 10 mM Phosphat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) Lösung und Vortexen bei einer Einstellung von 10 für 1 min mit 10 s Pausieren Inkrementen. Waschmittel und Salz im Puffer fördert eine gleichmäßige Dispersion von Bakterien in der Lösung. Vergleichbare Ergebnisse wurden mit 0,85% Kochsalzlösung gefunden, aber senkte Bakterienzahlen mit reinem Wasser.
  2. Bringen Sie den Fisch aus dem konischen Rohr zu einer Erholung Eimer. Die Letalität der Haut Extraktion ist in der Regel weniger als 10%. Entweder, analysieren die Bakteriensuspension in dem Rohr unmittelbar nach Extraktion oder die Bakterien durch einen 2 min Spin in einer Zentrifuge bei Raumtemperatur bei 15.000 × g und bei -80 ° C für eine spätere Analyse pelletieren.
    HINWEIS: Alle Kultur und biochemische Analysen sind unmittelbar; DNA oder Proteinextraktion aus gefrorenen Proben sein.
  3. Um eine gut microbiome Probe zu erhalten, legen Sie zuerst die Fische in eine sterile Petrischale. Euthanize die Fische durch den zervikalen Rückenmark direkt hinter dem Kopf mit chirurgische Scheren Trennen, gefolgt von SchlachtUnd dann sterilisieren extern den Körper mit 70% Ethanol wischt.
  4. den gesamten Darm nach der Sektion, zu entfernen, nachdem der Speiseröhre und vor dem After durch Schneiden.
  5. Schneiden Sie den Darm in kleine Abschnitte 1 bis 2 mm in der Länge und legen Sie alle Abschnitte in zwei ml PBST-Lösung in einem konischen Rohr. Nach Vortexen für 1 min, entfernen Überstand in ein anderes sauberes Röhrchen (Vorsicht, um nicht die Darmabschnitte aufstellen).
    HINWEIS: Der Überstand enthält extrahiert Darmbakterien, die entweder für Hautproben erwähnt durch die bisherigen Verfahren für die direkte Analysen oder pelletiert werden.

4. Infektion Modellvorbereitung und Bad eines spezifischen Pathogen

  1. Erhalten infektiösen Stamm von Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) und halten Sie die Kultur bei -80 ° C gelagert. Der Stamm 93-146 in dieser Studie verwendet wurden, isoliert von einem infizierten Wels, wurde von Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University erhalten.
  2. streak E. ictaluri Lager auf ein selektives & Differential Medien genannt E. ictaluri Medien (EIM) Agar 19 zur Kultur der Bakterien und bei 27 ° C für 2 d inkubiert.
  3. Übertragen einer rein isolierten Kolonie aus der Kultur und impfen einen 150-ml-Kolben, die 40 ml Nährbrühe (NB; 5 g / l Pepton, 4 g / l Fleischextrakt). Danach wird der Kolben in einem Schüttler bei 150 Umdrehungen pro Minute eingestellt für 2 d bei 27 ° C.
  4. Nach der Inkubation wird eine Probe der Kultur in PBST zu einem Spektrometer Lesen von OD 0,2 bei 650 nm verdünnt für gewünschte Infektionsdosisvolumina E. ictaluri Kultur zu kalibrieren.
  5. Als nächstes Transfer beide behandelt (nach 3 d der Antibiotika-Exposition) und unbehandelten Fischgruppen in einzelne Plastikbecher, die 130 ml frischem künstlichen Teichwasser oder APW für ca. 10 h für Arzneimittel-Clearance von Fischgewebe.
  6. Dann aus beiden Gruppen, Transfer wieder jeden Fisch in 8-Unzen-Plastikbecher, die 130 ml sauber APW. Geben Sie jedem Fisch eine tödliche Dosis enthält 2,8 x 10 6 KBE / ml E. ictaluri Kultur in die APW (Bad Infektionsmodell) und halten in einem 27 ° C Inkubator für 24 Stunden.
  7. Nach dem E. ictaluri Bad, übertragen die Fische einzeln in neue Becher mit 130 ml APW.
  8. Nach Wasseraustausch, Rekordfischsterblichkeit über die Dauer von einer Woche. Die Fische werden nicht über diesen Zeitraum zugeführt. Im Gegensatz zu Wels, zeigen Gambusia keine äußeren Anzeichen einer Infektion, daher ist es wichtig , die Letalität als experimentelle Endpunkt zu verwenden.

5. polymikrobiellen Herausforderung mit Exkremente & Boden

  1. Exkremente Behandlung
    1. Erhalten Sie frische menschliche Fäkalien von einem gesunden Freiwilligen unterworfen, die Antibiotika in den letzten zwei Wochen mit sterilen Handschuhen und einer sterilen 50 ml konischen Röhrchen nicht erhalten hat.
    2. Nach dem Sammeln, sammeln Fäkalien in einem sterilen Beutel aus Kunststoff und übertragen dann in ein steriles 15 ml conical Rohr. Erstellen Sie eine Stammkonzentration von Kot in PBST zu geben, um eine Stammlösung von 500 suspendiert - 800 mg / mL. Diese dicke Mischung ist am besten eine 1 ml oder mehr Kunststoff-Pipettenspitze zu übertragen verwenden, die an der Unterseite mit einer sterilen Schere geschnitten wurde, so dass die Öffnung größer ist.
    3. Nach anfänglichen Antibiotika-Exposition von behandelten und unbehandelten Fischgruppen steuern, getrennt in einzelne Plastikbecher Fäkalsuspension bei Endkonzentrationen von entweder 15 mg / ml oder 10 mg / ml in APW mit einem Gesamtvolumen von 130 ml enthält. Halten cups in einem Inkubator bei 25 ° C.
    4. Nehmen Sie die Fischsterblichkeit während fäkale Belastung durch genaue Beobachtung über 2 d.
  2. Bodenbehandlung
    1. Sammeln Sie 1 bis 2 kg reichen organischen Krume (sollte die höchste Dichte und Vielfalt der Mikroben enthalten) ca. 7-15 cm nach unten in der Tiefe und in einen sauberen Plastikbehälter. Beachten Sie, dass der Boden sollte innerhalb von zwei Tagen nach der Gewinnung verwendet werden.
    2. schrecklichctly nach der anfänglichen Belichtungsperiode, trennen die beiden Gruppen von Antibiotikum behandelten und unbehandelten Fisch in einzelne Plastikbecher 18,2 g Boden in 130 ml APW enthält. Mischen Sie den Boden im Wasser gut mit der Hand vor dem Hinzufügen des Fisches. Die meisten der Teilchen nicht suspendieren und am Boden des Bechers zu bleiben.
    3. Expose Fisch für eine Dauer von 3 d bei 25 ° C und jede Sterblichkeit aufzuzeichnen.

6. osmotischer Stress Herausforderung

  1. Nach der Behandlung durch eine 10 h Ruhezeit gefolgt, wie oben beschrieben, individualisieren Fisch in einzelne Tassen, enthaltend NaCl bei 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 ml APW. Das ist die Hälfte des typischen Salinität des Meerwassers, die nicht vollständig tödlich (<50%) zu steuern Fisch ist, sondern stark belastend und erfordert wirksame osmoregulation.
  2. Beachten Sie für die Fischsterblichkeit über eine Dauer von 36 Stunden.

7. Nitrat Toxizität Herausforderung

  1. Rest Fisch für eine 10-h-Zeitraum nach einer Antibiotika-Exposure, und dann trennen Fisch in einzelne Schalen einer Natriumnitratkonzentration von entweder 10 mg / ml (118 mM) oder 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 ml APW enthält.
  2. Die Bilanz für die Mortalität über 4 d für niedrige Dosis und 1 d für hohe Dosis.

8. Wachstumsanalyse von Fisch Individualisierte oder gruppierte

  1. Complete 3 d Antibiotika Exposition oder Kontrollperiode als Gruppen in Eimern.
  2. Für einzelne, füllen 8-Unzen Styroporbecher mit 150 ml APW jeder Transfer eines einzelnen Fisches in die Tasse und Rekord für die Erstprüfung Gesamtkörpergewicht.
    1. Wiederholen Sie dies für alle Arten von Fisch in den beiden behandelten und unbehandelten Gruppen. Verwenden Sie weiße Styroporbecher, anstatt klare Plastikbecher, weil Fische nicht essen, wenn sie in den klaren Tassen.
  3. Fische füttern täglich mit der Standard-Diät von zwei Pellets pro Fisch. Die Pellets wurden eher als Flocken verwendet, weil Pellets geringe Varianz in einzelnen Masse haben (3,53 ± 0,42 mg jeder oder 8% Abweichung), Resul-g in Fisch ähnliche Mengen an Nahrung zu erhalten. Überwachen Sie Verbrauch durch visuelle Aufzeichnung uneaten Pellets. Verbrauchsraten lagen typischerweise über 80%.
  4. Am Ende jeder Woche über 4 Wochen, bestimmen Fisch Gewicht. Bereiten Sie eine neue Tasse mit frischem APW, auf ein Gleichgewicht, und dann das Gewicht aufgezeichnet. Dann gießen Sie einen Fisch in einem Kescher aus dem ursprünglichen Tasse und Transfer in den neuen Becher, der dann wieder gewogen wird. Die Fische werden nicht Stress zu vermeiden behandelt.
  5. Für Gruppen, Platz 2 L von APW in einen 19 L Eimer und tarieren. Halten Sie Fisch zusammen in beiden Gruppen, wenn sie in neue APW Eimer übertragen dann Gesamtgruppe Gewicht aufgezeichnet. Nehmen Sie Fischgruppe Gewicht jede Woche über einen Monat Zeitraum von auf einen neuen Eimer zu übertragen.

9. Gut Transitzeit

  1. Verwenden Fluorescein-markierten 70 kDa anionischen Dextran. Dextran nicht wesentlich abgebaut und ist zu groß für die Darmschicht absorbiert werden, so werden Durchgang messen Gangszeit durch den Darm.Beschriftete Dextran wurde in Fischfutter eingearbeitet.
  2. In einem sterilen 1,7 ml-Röhrchen, fügen Sie 360 ​​ul sterilem VE-Wasser und 52 mg Gelatine (13% ige Lösung), und legen Sie den Schlauch auf 60 ° C Wärmeblock, bis die Gelatine schmilzt und vollständig gelöst ist.
    1. Grind Goldfischfutter Flocken zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel, und fügen Sie 40 mg dieses Pulvers auf das Rohr, zusammen mit 20 & mgr; l von Fischöl. Nach dem Mischen hinzufügen 1,6 mg FITC-Dextran.
  3. Dispense die heiße flüssige Mischung in 20 & mgr; l auf dem Labortisch auf Parafilm fällt, und lassen Sie sie schnell abgekühlt und verfestigt. Tropfen können für bis zu 4 d gespeichert werden, bevor sie zu hart für Fisch zu essen. Shop fällt im Kühlschrank durch die Parafilm auf die Hälfte einer Petrischale platziert, die dann auf sterilem Wasser in einem verschlossenen Plastikbehälter schwimmt, der die Tropfen befeuchtete hält.
  4. Kurz vor Fütterung, fällt Quartal in Abschnitte mit einer Rasierklinge. Akklimatisieren die Fische an die StyroSchaumbecher einzeln für 2 Tage ohne Fütterung (Hinweis: Es werden nur unbelichteten Kontrolle Fisch verwendet wurden). Legen Sie vier Viertel des Lebensmittels in die Tasse mit dem Fisch, und beobachten Sie die Fische für 30 Minuten, wie viele Stücke der Nahrung, die sie je essen.
  5. Um die Überwachungsperiode beginnen, übertragen die Fische einzeln in Becher mit 80 ml APW einen Kescher mit. Jede 2 h vorsichtig schwenken die APW mit der Hand, und dann nehmen Sie eine 1 ml Probe und Speicher in einem markierten 1,7 ml-Röhrchen bei 4 ° C. Proben für 36 Stunden.
  6. Record Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzspektrophotometer, aller Proben zur gleichen Zeit nach Abschluß des Assays. Legen Sie die gesamte 1 ml Probe in eine Küvette, und notieren Sie die Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregung bei 495 nm und Emission bei 520 nm gemessen.

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Representative Results

Ein Gesamtschemadiagramm des experimentellen Systems verwendet , um Fischaufnahmeeffekte aus antibiotischen Belichtungs 13 ist in 1A dargestellt und beinhaltet die Technik zum Extrahieren der Haut (1B) und gut (1C) microbiomes vom Fisch studieren. Drei Tage wurde als Antibiotikum Einwirkungszeit ausgewählt, weil früheren Daten, die zeigt, während die gesamte Haut kultivierbaren Zahl zu Beginn der Behandlung fällt, hat es wieder auf Werten vor der Behandlung nach 3 d. Inzwischen hat die Gemeinde Zusammensetzung, wie durch 16S Profilierung bestimmt wurde stark verändert. Daher sollte die 3-Tage-Zeitraum für die Auswertung der Auswirkungen von einer veränderten Gemeinschaft von etwa der gleichen Dichte optimal. Beachten Sie, dass Kulturanalyse unter Verwendung von Koloniezahlen auf Agar-Platten, eine Reihe von Arten auslassen kann. Effizienz des Verfahrens Haut microbiome Dispersion (1B 5 KBE / g Fischgewicht) Koloniezahl (alle verbleibenden zu quantifizieren - rong>) wurde durch einen Vergleich Koloniezahl auf Platten aus Suspensionspuffer (typischerweise im Bereich von 10 4 analysiert Bakterien). Grafen von dieser zweiten Suspension waren weniger als 100 KBE / g, was darauf hindeutet, das Suspensionsverfahren ist wirksam (nicht veröffentlicht).

Fisch mit einem Antibiotikum-altered microbiome erschien anfälliger für eine E. ictaluri Infektion als Kontrolle Fisch (Abbildung 2) zu sein. Der Unterschied in der mittleren Zeit bis zum Tod von 56,1 ± 15 h für die behandelten Fische und 98,5 ± 48 h für die Kontrolle Fisch war statistisch nicht signifikant (two-tailed Student-t-Test, p = 0,12). Dies ist wahrscheinlich aufgrund der geringen Gruppengröße (behandelt n = 6, Kontrolle n = 5). Gruppengrößen von mindestens einem Dutzend werden daher empfohlen. Ein Vorteil dieser Infektionsmodell ist die bath-Protokoll, das keine Nadeln für eine Infektion oder Verfolgung der Nahrungsaufnahme benötigen. E. ictaluri dringt natürlich Wels aus der Wassersäule. Sicherheit ist hoch , weil E. ictaluri temperaturempfindlich ist und daher schlecht infektiös für den Menschen. Andere Studien haben ergeben , dass die Zeit bis zum Tod in G. affinis mit der Anfangsdosis von Bakterien korreliert. Die Inkubationstemperatur von 27 ° C wurde sowohl als optimal ausgewählt für Bakterien und Fisch.

Die behandelten oder Kontrollfische hatte keine signifikanten Unterschiede im Überleben in Wasser mit hohen Werten von gemischten Mikroben kontaminiert. Keine Mortalität wurde über 4 Tage Kontrolle beobachtet (n = 8) oder behandelt (n = 9), Fisch, wenn der Boden als die mikrobiellen Quelle verwendet wurde. Während einige Mortalität im Zusammenhang mit menschlichen Fäkalien als Quelle von Mikroorganismen (Tabelle 1) stattfand, gemacht antibiotische Behandlung keinen Unterschied. Wenn die Konzentration von Kot in APW wurde bei 20 mg / ml, 40 - 50%der Fische starben. Allerdings war die Konzentration an gelöstem Sauerstoff nur 10% (im Vergleich zu> 80% in Eimern oder Aquarien), so dass die hypoxischen Bedingungen die Interpretation verwechselt. Wenn geringere Mengen von 16 oder 10 mg / ml verwendet wurden, wurden die Überlebensraten abgestimmt (zweiseitig der exakte Test nach Fisher, p = 0,95 oder größer für einen Unterschied zwischen Gruppen). Gehalt an gelöstem Sauerstoff in diesen beiden Studien waren 65% oder darüber. Gambusia sind eine sehr robuste invasive Arten , die in niedriger Qualität Wasser leben können. Es wäre interessant, diese Assays natürlicher mikrobieller Exposition zu verwenden, das Überleben von anderen Spezies gegen eine Herausforderung von kontaminiertem Wasser zu messen. Proben von Wasser aus spezifischen Umwelt Seiten, insbesondere diejenigen Eutrophierung unterworfen, in einem ähnlichen Test verwendet werden könnte, obwohl die Wasserqualität (gelöstes O 2, Nitrat, Salinität, etc.) Müssten bestimmt werden, als potentiell Störfaktor.

Fisch-eXposed gegen Rifampicin waren empfindlicher gegen osmotischen Stress als Kontrollfische (Abbildung 3). Die Log-Rank-Test beobachtet einen signifikanten Unterschied (p = 0,049) in der Überlebensrate (43% Tod in der Kontrollgruppe und 88% Tod in behandelten Gruppe, n = 9 für beide Gruppen), wenn mit erhöhtem Salzgehalt in Frage gestellt. Die Ergebnisse aus diesem Test vereinbart mit einer Bestimmung von 18,1 mg / ml als 50 LC für NaCl mit G. affinis bei 24 h im Süßwasser 20. Anzeichen von Salzstress, dass Fische Ausstellung gehören Rötung um die Nase und verminderte Bewegung schwimmen. Mit diesem Test Salzgehalt über 18 mg / ml führte zu einer schnellen Fischsterben.

Wenn an das Toxin Nitrat in der Wassersäule ausgesetzt, Vorbelichtung antibiotische hatte keinen Einfluss auf das Überleben (Tabelle 2). Für jeden Versuch, den Tod wurde sowohl auf Kurz- und Langzeitpunkt, was akute und chronische Wirkungen aufgezeichnet. Die Konzentrationvon 10 mg / ml wurde bei 48 h 21 basierend auf wobei die LD 50 für G. affinis in Süßwasser ausgewählt. Die Ergebnisse dieses Tests waren mit diesem LD 50 -Wert, mit einer 50% igen Letalität in beiden Behandlungs- und Kontrollgruppen nach 90 h konsistent. Eine höhere Herausforderung Nitrat (17,5 mg / ml) wurde auch zu einer rascheren Tod untersucht, führt. Wieder gab es in den Behandlungsgruppen nicht Unterschied. Nitrit ist dramatisch toxischer als Nitrat zu G. affinis, mit einem LD 50 von 0,0015 mg / ml bei 48 h 22. Gemeinschaft biochemische Analyse unter Verwendung zeigt das analytische Profil Index-System (nicht veröffentlicht), dass die Fischhaut Mikrobiota das Potenzial Nitrat zu reduzieren hat. Jedoch Nitritspiegel im APW während der beiden Versuche blieb unter der Nachweisgrenze (0,001 mg / ml). Diese Herausforderung Methode könnte mit irgendwelchen kleinen löslichen Chemikalien verwendet werden.

Wenn in Tassen und gefüttert t individualisierter gleiche Menge an jeden Fisch für einen Monat, ein Trend für die Antibiotika-behandelten Fische beobachtet wurde, nicht so gut an Gewicht zunehmen als Kontrollfische, ohne statistisch signifikanten Unterschied (Daten nicht gezeigt). Um die Belastung der Individualisierung zu vermeiden, wurden Fische untergebracht als Gruppe zusammen für behandelte und unbehandelte Fisch in Eimern für einen Monat und abgestimmte Mengen von Lebensmitteln gegeben. Die Einschränkung dieser Einrichtung ist, dass Fische nicht das gleiche Essen auf individueller Basis werden empfangen. Doch in der Gruppenmodell, Fisch im Durchschnitt verlorene Gewicht und Kontrolle Fisch im Durchschnitt an Gewicht zugenommen (Tabelle 3) behandelt. Die Menge der Nahrung der Fisch konsumierten schien nicht durch vorherige Antibiotika-Exposition betroffen sein, so Appetitunterdrückung ist ein unwahrscheinlicher Kandidat Erklärung für fehlende Gewichtszunahme. Zahlreiche andere Faktoren könnten, einschließlich Änderungen der Entzündung im Darm, Ebenen der Schleimproduktion, Darmpermeabilität und / oder Darmbeweglichkeit beitragen. Ein großer Vorteil dieses Assays zu messen ernährunonal Effekte ist die Einfachheit. Es ist kostengünstig und erfordert nur eine Laborwaage als Instrumentierung. Es ist geeignet für einen Effekt zu durchmustern, um andere involvierte Experimentierens führenden Mechanismus zu bestimmen.

Ein Beispiel Faktor zu untersuchen, im Zusammenhang mit Fisch Gewichtszunahme Lebensmittel Laufzeit, die verwandt ist Motilität Darm. FITC-markiertes Dextran kann in gelatinierter Lebensmittel eingearbeitet werden und ist nicht tödlich für die Fische. Messen der Fluoreszenz in dem umgebenden Wasser im Laufe der Zeit ergibt eine Messung, wie schnell die FITC-Dextran durch den Darm passiert. Fluoreszenz über dem Hintergrund kann, sobald 2 Stunden erfasst werden, mit einem Maximum nach 16 Stunden nach der Fütterung (Figur 4) erreicht. Dieses Ergebnis ist mit der Kontrollfische aus einem Aquarium. Zuverlässige Ergebnisse von Antibiotika-behandeltem Fisch noch nicht erhalten worden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass eine 2-D-Hungerperiode erforderlich ist für Fische, die Nahrung zu essen. Ein adv antage des Protokolls ist eine hohe Empfindlichkeit (niedrige Hintergrundfluoreszenz), wie Fisch zu essen nur ein Lebensmittelabteilung Ergebnisse geben kann, auch wenn die Daten konsistenter ist, wenn zwei Abschnitte gegessen werden. Dieses Protokoll ist weniger kompliziert als ein ähnliches Verfahren und lethal für Mäuse 23.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Übersicht des Gemeinsamen experimentelles Protokoll. A ist ein Flussdiagramm, links nach rechts, Fisch aus Aquariumtank überführt, getrennt in Antibiotika-behandelt (durch Wasser rot dargestellt) oder Kontrolle (blau) Gruppen und dann in einzelne Schalen platziert Phänotypen zu verfolgen. B und C zeigen den Prozess der Fischhaut und Darm microbiomes zu extrahieren. Nach dem Vortexen werden die Bakterien in die Lösung für die Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft suspendiert.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Pathogen Suszeptibilität. Eine Überlebenskurve während der Exposition gegenüber E. ictaluri für Fisch mit Rifampicin (rote Linie) oder einer unbehandelten Kontrollgruppe (schwarze Linie) Fisch vorbehandelt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Die Empfindlichkeit gegenüber osmotischer Stress. Eine Überlebenskurve während der Belichtung mit hoher Salinität für Fische in beiden Antibiotika-behandelten und unbehandelten Gruppen. please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Lebensmittel Transitzeit. Fluoreszenz über die Zeit in dem Wasser aus zwei Fische gefüttert FITC-Dextran. Fische Ein aß zwei Gelatine Nahrungsmittelabschnitte und Fisch B ein aß. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1
Tabelle 1: Empfänglichkeit für Hoch Microbial - Umgebungen. Die Exposition gegenüber menschlichen Fäkalien wurde bei drei verschiedenen Konzentrationen bewertet. Tod Verhältnis von x: y zeigt die Gesamtzahl der Fische tot bei der angegebenen Zeitpunkt x im Vergleich zur Gesamtzahl der Fische in der Versuchsgruppe y.


Tabelle 2: Nitrat Toxizität Herausforderung. Aufnahmedauer von Fischsterben in Behandlungs- und Kontrollgruppen im gesamten Exposition gegenüber einer toxischen Nitratkonzentration. Tod Verhältnis von x: y zeigt die Gesamtzahl der Fische tot bei der angegebenen Zeitpunkt x im Vergleich zur Gesamtzahl der Fische in der Versuchsgruppe y.

Tisch 3
Tabelle 3: Wachstumsanalyse. Entwicklung des gesamten Körpergewichts nach einem Monat nach Antibiotikum oder Kontrollbehandlung. Der prozentuale Unterschied in der anfänglichen mittleren Körpergewicht (für die Fische in dieser Versuchsgruppe) bis zur endgültigen mittleren Körpergewicht im Vergleich ist die Säule Δweight. N ist die Anzahl der Fische in dieser Gruppe. Das mittlere Gewicht pro Fisch am Ende der Studie ist untergewichtig / Fisch.

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Discussion

Einige Herausforderungen erfordern eine Ruhezeit in einem sauberen APW nach einer Antibiotika-Behandlung für das Medikament in Fischgewebe aufgebraucht werden. Wenn die Ruhezeit übersprungen wird, dann können die Ergebnisse antibiotische Anwesenheit vermengen, insbesondere wenn der Assay Exposition gegenüber Bakterien beinhaltet. Um Effekte aus einer veränderten microbiome Zusammensetzung ohne große Änderungen in der Gesamtzahl von Mikroben auf dem Host, Vorversuche Überwachung microbiome Zusammensetzung (16S Profilieren oder ganze Genom-Sequenzierung) und Bevölkerungsdichte (16S Quantifizierung über qPCR) während einer antibiotischen Exposition zu untersuchen wäre erforderlich. Während 3 d in diesem System optimal ist, die Änderung der Host und / oder Antibiotika würde Neukalibrierung erforderlich.

Typisch für die biomedizinische Forschung ist die Maus-Modell für microbiome Studien häufig verwendet. Der häufigste Fisch Modell ist Zebrabärbling. Um ein besseres Verständnis der universellen Eigenschaften der Struktur und Funktion von mukosalen microb zu erhalteniomes und Wirt-Interaktionen, neue und atypische Modelle sind eine Notwendigkeit. Unser WT Fisch Modell dient als authentische Quelle für das Studium Host-microbiome Wechselwirkungen von natürlichen Wirt genetische Variabilität einschließlich die anderen Modelle aufgrund Generationen von Labor-raiste Tier Inzucht 24 verloren haben. Ein wesentlicher Vorteil der experimentellen Gambusia ist ihre robusten Natur, ein breites Spektrum von Bedingungen zu tolerieren. Hohe Überlebensraten wurden in Wasser beobachtet, die in der Temperatur variiert (4-38 ° C), Salinität (0-17 mg / ml), gelöstem Sauerstoff (110-25%) und pH (4 - 8). Dies ermöglicht nicht nur viele Umweltbedingungen untersucht, sondern auch für mehrstufige experimentellen Verfahren, die für andere Fischarten oft zu anstrengend sind.

Die Verfahren hier vorgestellt werden für das schnelle Screening geeignet, um Host-Effekte aus einer bestimmten Behandlung zu entdecken. Follow-up-Studien sind erforderlich, direkte Kausalität und den Mechanismus zu bestimmen. Beispiel Erweiterung studies für die microbiome Host Effekte Fischen gehören: Darmentzündung, die Untersuchung von Fischgesundheit Messung von Fettreserven Quantifizierung und Messung von Schleim Ebenen auf der Haut und im Darm. Ein gnotobiotischer System wird entwickelt, im Detail Links spezifischen Mikroben zu bestimmten Host Phänotypen zu untersuchen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rifampicin Calbiochem 557303-1GM
Sodium Nitrate Sigma Aldrich S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran ThermoFisher Scientific D1823
Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets Calbiochem 6500-OP tablets dissolve in water to make PBS

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References

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Immunologie Heft 120 Mucosal Microbiome Fisch Modellorganismus Antibiotikum Exposition Host-Effekte, Infektion
Die Prüfung der Host-Phänotypen in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Nach der Behandlung mit Antibiotika
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Carlson, J. M., Chavez, O.,… More

Carlson, J. M., Chavez, O., Aggarwal, S., Primm, T. P. Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment. J. Vis. Exp. (120), e55170, doi:10.3791/55170 (2017).

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