Summary
وتتضمن هذه الدراسة أساليب للكشف عن الآثار المترتبة على مجموعة الأسماك نموذج التالية تغيير الجلد والأمعاء المجتمعات microbiome التكوين عن طريق المضادات الحيوية.
Introduction
وقد ثبت أن المضادات الحيوية يمكن أن يحدث خللا في microbiome الإنسان مما يؤدي إلى dysbiosis، وهذا يعني اختلال المجتمع الميكروبي. وقد تبين تغيير التركيبية والجراثيم بعد العلاج بالمضادات الحيوية لخفض التنوع في المجتمع، والحد من الأعضاء الرئيسيين، وتغيير التمثيل الغذائي للمجتمع، وخاصة في القناة الهضمية 1 و 2. اضطراب المضادات الحيوية من microbiome الأمعاء يمكن أن تقلل من مقاومة الاستعمار إلى المطثية العسيرة 3 و 4 و 5 السالمونيلا.
بالإضافة إلى ذلك، وقد تم ربط اختلال الجراثيم إلى تطوير العديد من المتلازمات والأمراض في البشر (على سبيل المثال، المرتبط المضادات الحيوية التهاب الأمعاء، وأمراض التهاب الأمعاء، واضطرابات التمثيل الغذائي، الخ.). كما نفذت على نطاق واسع المضادات الحيوية في الزراعة لتسريع عملية النمو فيالماشية والدواجن إنتاج 6. استخدام هذه الأدوات القوية لا يخلو من الآثار الجانبية، وهو ما يتضح في الارتفاع السريع للمقاومة المضادات الحيوية، فضلا عن الآثار المترتبة على microbiome تعطلت لديها مع مضيفه آهل بالسكان. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن واسعة الطيف استخدام المضادات الحيوية له عواقب طويلة الأمد على بنية ووظيفة الجراثيم، إلا أن الآثار الجانبية من microbiome تؤثر فسيولوجيا المضيف تعطل المضادات الحيوية هي الوحيدة التكهنات التي لم تكون معتمدة.
التفاعل بين المضيف، الجراثيم، والمضادات الحيوية لا يزال بعيدا عن أن يكون مفهوما بطريقة موجزة. لذلك، وهذا نموذج بسيط وأكثر لين العريكة هو مفيد لتسليط الضوء على نظام الثدييات معقدة للغاية. الأسطح المخاطية في البشر، بما في ذلك الأمعاء، تؤوي أعلى كثافة وتنوع الميكروبات، وأيضا الأكثر حميمية التفاعلات الميكروب المضيف. وmicrobiome المخاطية الجلد من العروض الأسماك الصورةمزايا everal كنظام نموذج. وعظميات (الأسماك العظمية) هي واحدة من أقدم سلالات تتباعد بالمعنى المقصود الفقاريات التي teleosts على حد سواء الفطرية والمكتسبة جهاز المناعة التي شاركت في تطور العلاقة مع المجتمعات البكتيرية المتعايشة 7. سهم جلد السمك العديد من الخصائص مع الأسطح نوع 1 المخاطية من الثدييات، مثل وظائف فسيولوجية، مكونات الحصانة، وترتيب الخلايا المنتجة للمخاط 8. الموقع الخارجي للسطح الأسماك الجلد المخاطي يقدم microbiome السهل التلاعب تجريبيا وعينة.
وسمكة البعوض الغربي، affinis الجمبوزيا (G. affinis)، سمكة نموذج التي استخدمت في الماضي لدراسة التزاوج وعلم السموم 9 و 10 و 11. ونظرا لصغر حجمها، وفرة السكان في البرية باعتبارها الأنواع الغازية، م تكلفة الرعاية inimal، وطبيعة هاردي، قمنا بتطوير G. affinis كنموذج microbiome المخاطية. وعلاوة على ذلك، الجمبوزيا مشاركة فسيولوجيا الولادة للعيش الشباب مع الثدييات ولود، والذي هو شائع في أنواع الأسماك. أكملنا الدراسة الأكثر شمولا في وقت جلد السمك الجراثيم العادية باستخدام 16S التنميط مع الجمبوزيا 12. أظهر المزيد من العمل ثلاثة آثار سلبية على المضيف بعد تعطل الجلد والأمعاء الجراثيم باستخدام واسع الطيف المضادات الحيوية 13.
تم فحص خمسة تأثيرات مختلفة في الأسماك بعد التعرض للمضادات الحيوية. صالح المضيف الأكثر راسخة من microbiome هو استبعاد منافسه من مسببات الأمراض. ومن المعروف أن العوامل المسببة للأمراض الأسماك الإدواردسيلة ictaluri أن يسبب تفشي التسمم الدموي المعوي في مزارع سمك السلور التجارية 14. وقد تبين أيضا E. ictaluri لإصابة قاتلة الزردالطبقة = "XREF"> 15 و 16 و 17 الجمبوزيا. والتحدي مع هذا الممرض من عمود الماء يمكن أن تكون بمثابة مقياس لالإقصاء. وعلى سبيل المقارنة إلى التعرض لمسببات الأمراض الفردية، أجريت البقاء على قيد الحياة خلال التعرض لكثافة عالية من الكائنات مختلطة أيضا. واستخدمت البراز والتربة العضوية الغنية كمصادر شيوعا التي تواجهها من المجتمعات الميكروبية.
دور أنشأ آخر يقوم المجتمع الأمعاء الجرثومي هو معالجة المواد الغذائية والطاقة الحصاد، مما يؤثر على امتصاص التغذية العام للمضيف. كمقياس الإجمالي للتغذية، وتمت مقارنة وزن الجسم السمك قبل وبعد شهر واحد من تغذيتها على نظام غذائي موحد. الأسماك المضادات الحيوية تعامل على أنها فقدت في المتوسط الوزن بينما الأسماك السيطرة في المتوسط اكتسبت الوزن خلال الشهر. آلية لهذا النقص في زيادة الوزن غير واضحة. أحد العوامل المساهمة المحتملة هو وقت العبور من المواد الغذائية في الأمعاء. وموتى GIوقد تم تكييف طريقة عنه lity من الزرد (آدم ريتش، جامعة ولاية نيويورك بروكبورت، اتصال شخصي) لتحديد وقت العبور. لم يتم حتى الآن تحديد ما إذا كانت الأسماك المعالجة مضاد حيوي وقت عبور تغير.
وهناك تحد مشترك من ذوي الخبرة في البيئة الطبيعية من قبل جميع الكائنات الحية، وخاصة الأسماك، هو الضغط الاسموزي. وقد ثبت الجمبوزيا على التكيف بسرعة عندما أكد حاد في تركيزات عالية من الملوحة 18. والمثير للدهشة، السمك مع microbiome المعدلة والمضادات الحيوية عرضت خفضت البقاء على قيد الحياة لضغوط كبيرة من الملح. آلية لهذا النمط الظاهري رواية قيد التحقيق. الإجهاد مشترك آخر على الحيوانات المائية، وخاصة في الأحواض المائية، وأشكال السامة من النيتروجين (الأمونيا والنترات والنتريت و). كان البقاء على قيد الحياة ضد نترات لا تختلف كثيرا بين الأسماك المعالجة المضادات الحيوية والسيطرة. الأساليب المقدمة في هذه المخطوطة يمكن استخدامها مع الجمبوزيا أو نموذج مماثل الأسماك الحية، مثل حمار وحشيالأسماك والميداكا، لقياس الظواهر في الأسماك بعد التلاعب التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات فقط تحت الموافقة على بروتوكولات IACUC، مرقمة 14-05-05-1018-3-01، 13-04-29-1018-3-01، و14-04-17-1018-3-01.
1. مجموعة الحيوان، يعالج، والعناية الأخلاقية
- جمع الجمبوزيا affinis من موقع الميدان (دليل تحديد الهوية في http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) باستخدام تراجع صافي صغير ومكان إلى 19 دلاء L. استخدام الفحص البصري لتحديد الأنواع.
- الأسماك راحة ل1-2 د في دلو مع مياه البركة. بعد ذلك، نقل الأسماك إلى 76 أو 189 دبابة L الحوض مليئة نصف بركة المياه / مياه الصنبور نصف عند 25 درجة مئوية، الخلوية مع airstone محتدما. استخدام تراجع صافي صغير عند التعامل مع الأسماك كما أن تخل الحد الأدنى microbiome بشرتهم.
يجب أن تكون كثافة الأسماك لا تزيد عن 20 سمكة / 38 لتر ماء الحوض: ملاحظة. وتأقلم الأسماك إلى حوض السمك لا يقل عن 5 د قبل التجريب. - تغذية الأسماك على نظام يومي مع 5 ملغ من تقشر الغذائية في الأسماك. هوالأسماك دينار مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام.
2. التعرض للمضادات الحيوية الأولي للجميع التجارب
- رسم جميع الأسماك من كل تجربة من نفس الحوض، وضع في مجموعتين منفصلتين (المعالجة: تتعرض لالمضادات الحيوية والتحكم: غير معلن) في 19 دلاء L. البيانات السابقة التي تم جمعها تبين أن الأسماك في الحوض نفسه والمتجانس microbiomes الجلد التي لديها اختلاف بسيط في تركيبة المجتمع. 12
- وخلال التجارب، والحفاظ على الأسماك في 2 لتر من مياه البركة الاصطناعية (APW، 0.33 جم / لتر CaCl 2، 0.33 جم / لتر MgSO 4، 0.19 جم / لتر NaHCO 3) أن يتم تعقيمها التعقيم قبل الاستخدام.
- إعداد محلول المخزون ريفامبيسين المضادات الحيوية عن طريق إضافة 50 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). ريفامبيسين هو مضاد حيوي وتمثيلية واسعة الطيف التي هي غير سامة للأسماك. في البشر والفئران، وتوزع بشكل جيد في الأنسجة.
- من المخزون ريفامبيسين إدارة نهائيتركيز 25 ميكروغرام / مل في 2 لتر من APW التعرض للمضادات الحيوية من مجموعة الأسماك المعالجة لمدة 3 أيام. لاحظ أنه بعد 3 د، أرقام زروع الجلد البكتيرية تعود مماثلة لتلك التي من جلد السمك سابقة التجهيز.
- في موازاة ذلك، والحفاظ على مجموعة من الأسماك غير المعالجة في APW وإعطاء مبلغ مساو من DMSO (0.5 مل لكل لتر من APW) في عمود الماء ليكون بمثابة المجموعة الضابطة.
- كما تهدف التجارب لقياس الآثار المترتبة على microbiome المعدلة والمضادات الحيوية على الظواهر الأسماك، وذلك لتجنب الآثار مباشرة من المضادات الحيوية نفسها، بعد التعرض لمدة ثلاثة أيام للمضادات الحيوية (أو السيطرة) فترة والأسماك نقل في دلو مع 2 لتر من APW جديدة.
- استخدام فترة راحة 10 ساعة حتى يتم إزالة المضادات الحيوية من قبل الهيئات من الأسماك. قاعدة هذه المرة القضاء على التجارب التي تتعرض فيها الأسماك إلى 25 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية لمدة ثلاثة أيام. الموت ببطء الأسماك عن طريق القص الحبل الشوكي تليها تعطيل الدماغ، ثم تجانس كامل الجسم باستخدام طاحونة الأنسجة.
- تحديد وجود المضادات الحيوية عن طريق وضع 50 ميكرولتر من هذا التعليق بعد 0.2 ميكرون تصفية في وسط طبق بتري أجار. جعل ثقب لهذا التعليق من الضغط رأسا على عقب معقم 200 ميكرولتر ماصة في آغار، الذي يزيل المكونات الصغيرة.
- استخدام لوحات أجار مع 20 مل حجم يقاس من الآجار المغذي، وموزعة بالتساوي باستخدام قطعة من القطن مع كائن حي المؤشر، العصوية الرقيقة، وهي حساسة للريفامبيسين. الحصول على B. الرقيقة من الآجار المغذي المحتضنة في 25 ° CO / N واستخدام ممسحة قطنية للحصول على مستعمرة. مراقبة منطقة تثبيط بعد الحضانة بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية يدل على وجود المضادات الحيوية في أنسجة الأسماك.
3. Microbiome استخراج
- استخراج عينة microbiome البشرة من البشرة المخاطية الخارجية عن طريق وضع الأسماك في أنبوب مخروطي 15 مل العقيمة مليئة 2 مل PBST معقم (137 ملي ناالكلورين، 10 ملي فوسفات و 0.1٪ توين-20، ودرجة الحموضة 7.4) حل وvortexing لفي وضع 10 لمدة 1 دقيقة مع 10 ثانية بزيادات التوقف. المنظفات والملح في المخزن المؤقت يشجع حتى تشتت البكتيريا في الحل. تم العثور على نتائج مماثلة مع 0.85٪ المالحة ولكن خفض أعداد البكتيريا مع الماء النقي.
- نقل الأسماك من أنبوب مخروطي إلى دلو الانتعاش. فتك استخراج الجلد هي عادة ما تكون أقل من 10٪. إما، وتحليل تعليق البكتيرية في أنبوب فور استخراج أو بيليه البكتيريا عن طريق زيادة ونقصان 2 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 15000 x ج ومخزن في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
ملاحظة: كل ثقافة والتحليلات الكيميائية الحيوية هي على الفور. الحمض النووي أو استخراج البروتين يمكن أن يكون من العينات المجمدة. - للحصول على عينة الأمعاء microbiome، أولا ضع السمك في طبق بتري معقمة. الموت ببطء الأسماك عن طريق قطع الحبل الشوكي العنقي مباشرة خلف الرأس مع مقص جراحي، تليها بخعثم تطهير خارجيا الجسم مع 70٪ مناديل الايثانول.
- بعد التشريح، وإزالة الأمعاء بأكملها عن طريق خفض بعد المريء وقبل فتحة الشرج.
- قطع القناة الهضمية إلى أقسام صغيرة 1-2 ملم في الطول وإخضاع جميع أقسام إلى قسمين مل حل PBST في أنبوب مخروطي الشكل. بعد vortexing لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف في أنبوب نظيف آخر (أخذ الحيطة والحذر لعدم وضع المقاطع الأمعاء).
ملاحظة: طاف يحتوي على بكتيريا الأمعاء المستخرج التي يمكن أن تستخدم إما لتحليل المباشرة أو مكعبات من الطريقة السابقة الذكر للعينات الجلد.
إعداد نموذج 4. العدوى وحمام من اى مرض
- الحصول على سلالة المعدية الإدواردسيلة ictaluri (E. ictaluri) والحفاظ على الثقافة المخزنة في -80 درجة مئوية. سلالة 93-146 المستخدمة في هذه الدراسة، معزولة من سمك السلور مصاب، تم الحصول عليها من الأقسام لورانس، كلية الطب البيطري، جامعة ولاية ميسيسيبي.
- تعزيز بنية الشعالأسهم حزب العدالة والتنمية E. ictaluri على تسمى هاء ictaluri وسائل الإعلام (EIM) وسائل الاعلام انتقائية والتفاضلية أجار 19 إلى ثقافة البكتيريا واحتضان لمدة 2 د حتى 27 درجة مئوية.
- نقل مستعمرة معزولة نقية من الثقافة وتطعيم قارورة 150 مل تحتوي على 40 مل من المرق المغذي (ملحوظة؛ 5 جم / لتر ببتون، 4 جم / لتر لحوم البقر استخراج). مكان قارورة في شاكر وضعت في 150 دورة في الدقيقة لمدة 2 د حتى 27 درجة مئوية.
- بعد مرور فترة الحضانة، وتمييع عينة من ثقافة في PBST لقراءة مطياف 0.2 OD في 650 نانومتر لمعايرة E. ثقافة ictaluri لكميات الجرعة المعدية المطلوب.
- نقل المقبل على حد سواء المعالجة (بعد 3 د من التعرض للمضادات الحيوية) ومجموعات الأسماك غير المعالجة في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على 130 مل من الماء بركة اصطناعية جديدة، أو APW لنحو 10 ساعة لإزالة عقار من أنسجة الأسماك.
- ثم من كلا الفريقين، ونقل مرة أخرى في كل السمك في 8 اوقية (الاونصة) أكواب بلاستيكية تحتوي على 130 مل من APW نظيفة. إعطاء كل الأسماك جرعة قاتلة تحتوي على 2.8 × 10 6 خلية / مل من E. ثقافة ictaluri في APW (حمام نموذج العدوى) وتحتفظ بها في 27 درجة مئوية الحاضنة لمدة 24 ساعة.
- بعد الحمام ictaluri E.، نقل الأسماك بشكل فردي في الكؤوس الجديدة مع 130 مل من APW.
- بعد استبدال المياه، وفيات الأسماك قياسية خلال مدة أسبوع. لا يتم تغذية الأسماك خلال هذه الفترة. وعلى النقيض من سمك السلور، الجمبوزيا لا تظهر أي علامات خارجية للعدوى، وبالتالي فإنه من الضروري استخدام الفتك بمثابة نقطة النهاية التجريبية.
5. التحدي متعدد المكروبات مع البراز والتربة
- البراز العلاج
- الحصول على براز الإنسان جديدة من المتطوعين الأصحاء الذين الموضوع لم تتلق المضادات الحيوية في الأسبوعين الماضيين، وذلك باستخدام قفازات معقمة وعقيمة أنبوب 50 مل المخروطية.
- على جمع، وجمع البراز في كيس بلاستيكية معقمة، ثم نقل إلى العقيمة 15 مل جأنبوب onical. إنشاء تركيز الأسهم من خلال تعليق البراز في PBST لإعطاء محلول المخزون من 500-800 ملغ / مل. هذا الخليط سميك هو أفضل لنقل باستخدام 1 مل أو أكبر البلاستيك ماصة التي تم قطع في أسفل مع مقص العقيمة بحيث افتتاح أكبر.
- بعد التعرض للمضادات الحيوية الأولي من مجموعة الأسماك غير المعالجة المعالجة والسيطرة، وفصل في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على تعليق البراز في تركيزات النهائي إما 15 ملغ / مل أو 10 ملغ / مل في APW مع إجمالي حجم 130 مل. عقد أكواب في حاضنة عند 25 درجة مئوية.
- وفيات الأسماك قياسية خلال التعرض البراز عن طريق الملاحظة وثيقة أكثر من 2 د.
- معالجة التربة
- جمع 1-2 كغ من التربة السطحية العضوية الغنية (يجب أن يحتوي على أعلى كثافة وتنوع الميكروبات) حوالي 7-15 سم أسفل في عمق ووضع في وعاء من البلاستيك نظيفة. لاحظ أن التربة يجب أن تستخدم خلال يومين بعد جمع.
- رهيبctly بعد فترة التعرض الأولية، فصل المجموعتين من المضادات الحيوية المعالجة وغير المعالجة الأسماك في أكواب بلاستيكية الفردية التي تحتوي على 18.2 غرام من التربة في 130 مل من APW. خلط التربة في بئر الماء باليد قبل إضافة الأسماك. معظم الجسيمات لا تعليق والبقاء في قاع الكأس.
- كشف السمك لمدة 3 د عند 25 درجة مئوية وتسجل أي وفيات.
6. التناضحي التحدي الإجهاد
- بعد العلاج تليها 10 ساعة فترة راحة كما هو موضح أعلاه، تفريد السمك في أكواب منفصلة تحتوي على كلوريد الصوديوم في 17.5 ملغ / مل (300 ملم) في 150 مل من APW. هذا هو نصف الملوحة نموذجية من مياه البحر، وهي ليست قاتلة بالكامل (<50٪) للسيطرة على الأسماك ولكن غير مرهقة بشدة، الأمر الذي يتطلب التنظيم الاسموزي فعال.
- مراقبة وفيات الأسماك خلال مدة 36 ساعة.
7. نترات سمية التحدي
- الأسماك راحة لمدة 10 ساعة بعد المعارض للمضادات الحيويةلدى عودتهم، والأسماك ثم منفصلة في أكواب فردية تحتوي على تركيز نترات الصوديوم إما 10 ملغ / مل (118 ملم) أو 17.5 ملغ / مل (206 ملم) في 130 مل من APW.
- سجل لوفيات أكثر من 4 د لجرعة منخفضة و1 د لجرعة عالية.
8. تحليل نمو السمك الفردي أو المجمعة
- كاملة 3 د التعرض المضادات الحيوية أو السيطرة الفترة كمجموعات في الدلاء.
- للفرد، وملء 8 أوقية كوب الستايروفوم مع 150 مل APW لكل منهما، نقل سمكة الفردية في الكأس وتسجيل وزن الجسم الكلي للتقييم الأولي.
- أكرر للجميع الأسماك في كل من المجموعات المعالجة وغير المعالجة. استخدام أكواب الفلين الأبيض بدلا من الأكواب البلاستيكية واضحة لأن الأسماك لا تأكل عندما تكون في أكواب واضحة.
- تغذية الأسماك يوميا مع اتباع نظام غذائي القياسية اثنين من الكريات في الأسماك. واستخدمت الكريات بدلا من رقائق لأن الكريات لها التباين المنخفض في كتلة الفردية (3.53 ± 0.42 ملغ لكل منهما، أو٪ الاختلاف 8)، resultinز في الأسماك تلقي كميات مماثلة من المواد الغذائية. مراقبة استهلاك عن طريق تسجيل مرئي الكريات غير مأكول. وكانت معدلات الاستهلاك عادة فوق 80٪.
- في نهاية كل أسبوع على مدى 4 أسابيع، وتحديد الوزن الأسماك. إعداد كوب جديد مع APW جديدة، وضع على التوازن، ومن ثم تسجيل الوزن. ثم، صب الأسماك إلى تراجع صافي من الكأس الأصلي ونقل في الكأس الجديد، الذي ثم وزنه مرة أخرى. لا يتم التعامل مع الأسماك لتجنب الإجهاد.
- لالمجموعات، ضع 2 لتر من APW في دلو 19 L والفارغة نطاق واسع. حفاظ على الأسماك معا في كلا المجموعتين عند نقل في دلاء جديدة APW ثم تسجيل الوزن الإجمالي المجموعة. رقم قياسي الوزن مجموعة الأسماك كل أسبوع على مدى فترة زمنية الشهر نقل إلى دلو جديد.
9. الوتر عبور الزمن
- استخدام المسمى فلوريسئين 70 كيلو دالتون ديكستران انيوني. لا يتم هضم ديكستران بشكل كبير، وكبير جدا بحيث لا يمكن امتصاصها عبر طبقة الأمعاء، وبالتالي مرور وقياس وقت العبور من خلال القناة الهضمية.تأسست ديكستران المسمى في الأسماك.
- في العقيمة 1.7 مل أنبوب، إضافة 360 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات معقمة و 52 ملغ من الجيلاتين (13٪ محلول)، ووضع أنبوب على كتلة الحرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين ويذوب تماما.
- طحن رقائق ذهبية الغذاء إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون ومدقة، وإضافة 40 ملغ من هذا المسحوق إلى أنبوب، جنبا إلى جنب مع 20 ميكرولتر من زيت السمك. بعد الاختلاط، إضافة 1.6 ملغ من FITC-ديكستران.
- الاستغناء عن الخليط السائل الساخن إلى 20 قطرات ميكرولتر على بارافيلم على مقاعد البدلاء المختبر، والسماح لهم بسرعة باردة وتصلبها. قطرات يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 4 د قبل أن يصبح من الصعب جدا بالنسبة للأسماك لتناول الطعام. متجر قطرات في الثلاجة عن طريق وضع بارافيلم على نصف طبق بتري، التي يتم بعد ذلك طرح على الماء المعقم داخل وعاء من البلاستيك مختوم، والتي تحافظ على قطرات ترطيب.
- قبل الرضاعة، قطرات الربع إلى أقسام باستخدام شفرة حلاقة. تأقلم الأسماك إلى Styroأكواب رغوة بشكل فردي لمدة 2 أيام بدون تغذية (ملاحظة: استخدمت فقط الأسماك السيطرة غير معلن). وضع أربعة أرباع من المواد الغذائية في الكأس مع السمك، ومراقبة الأسماك لمدة 30 دقيقة لكيفية العديد من القطع من الغذاء الذي كل أكل.
- لبدء فترة الرصد، ونقل الأسماك بشكل فردي في الكؤوس مع 80 مل من APW باستخدام تراجع صافي. كل ح 2، عباب بلطف APW من جهة، ومن ثم اتخاذ مل عينة 1 وتخزينها في المسمى 1.7 مل أنبوب في 4 درجات مئوية. أخذ عينات لمدة 36 ساعة.
- مضان قياسية، مع معمل مضان، من جميع العينات في نفس الوقت بعد الانتهاء من الفحص. وضع كامل 1 مل العينة إلى كوفيت، وتسجيل مضان تقاس باستخدام الإثارة في 495 نانومتر، والانبعاثات في 520 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمثل الرسم التخطيطي الشامل للنظام التجريبي تستخدم لدراسة آثار المضيف الأسماك من التعرض للمضادات الحيوية 13 في الشكل 1A ويتضمن تقنية لاستخراج الجلد (الشكل 1B) والقناة الهضمية (الشكل 1C) microbiomes من الأسماك. وقد تم اختيار ثلاثة أيام كفترة للمضادات الحيوية من التعرض لبيانات السابق يكشف أنه على الرغم من انخفاض إجمالي عدد الجلد زروع في العلاج في وقت مبكر، وإعادتها إلى ما قبل المعالجة مستويات بعد 3 د. وفي الوقت نفسه، وتكوين المجتمع، على النحو الذي يحدده 16S التنميط، تم تغييرها بقوة. لذلك، يجب أن تكون مدة 3 أيام الأمثل لتحليل آثار من مجتمع متغير ما يقرب من نفس كثافة. لاحظ أن تحليل الثقافة، وذلك باستخدام أرقام مستعمرة على لوحات أجار، قد ترك عددا من الأنواع. كفاءة طريقة microbiome الجلد تشتت (الشكل 1B 10 أبريل - 10 مايو كفو / ز وزن الأسماك) لعدد مستعمرة من عدة الأسماك تخضع لإجراءات تعليق نفسه للمرة الثانية (لتحديد أي المتبقية بكتيريا). وكانت التهم من هذا الوقف الثاني أقل من 100 خلية / ز، مما يشير إلى طريقة تعليق غير فعالة (غير منشورة).
ظهرت الأسماك مع microbiome تغيير المضادات الحيوية لتكون أكثر عرضة للعدوى E. ictaluri من الأسماك التحكم (الشكل 2). كان الفارق في الوقت نفسه إلى وفاة 56.1 ± 15 ساعة للأسماك المعالجة و98،5 ± 48 ساعة للأسماك تحكم لا يعتد به إحصائيا (ثنائي الطرف الطالب اختبار t، وع = 0.12). هذا هو الأرجح بسبب حجم مجموعة صغيرة (تعامل ن = 6، السيطرة ن = 5). لذا ينصح أحجام مجموعة من اثني عشر على الأقل. ميزة هذا النموذج العدوى هي ببروتوكول ATH، والتي لا تتطلب الإبر للعدوى أو تعقب تناول الطعام. E. ictaluri يغزو بشكل طبيعي سمك السلور من عمود الماء. سلامة عالية بسبب E. ictaluri غير درجة الحرارة الحساسة، وبالتالي المعدية سيئة للبشر. وقد كشفت دراسات أخرى أن الوقت حتى الموت في G. affinis يرتبط مع الجرعة الأولي من البكتيريا. وقد تم اختيار درجة حرارة الحضانة من 27 درجة مئوية بالشكل الأمثل لكل من البكتيريا والأسماك.
المعالجة أو لم الأسماك السيطرة ليس لديها اختلافات كبيرة في البقاء على قيد الحياة في المياه الملوثة مع التهم عالية من الميكروبات المختلطة. ولم يلاحظ أي وفيات أكثر من 4 أيام للسيطرة على (ن = 8) أو المعالجة (ن = 9) الأسماك عندما استخدمت التربة كمصدر للميكروبات. ورغم أن بعض الوفيات تحدث مع البراز البشري كمصدر من الميكروبات (الجدول 1)، قدمت العلاج بالمضادات الحيوية لا فرق. عندما كان تركيز البراز في APW على 20 ملغ / مل، 40 - 50٪من السمك مات. ومع ذلك، كان تركيز الأكسجين الذائب 10٪ فقط (مقارنة ب> 80٪ في دلاء أو أحواض)، وبالتالي فإن ظروف نقص الأوكسجين مرتبك تفسير. عندما استخدمت مستويات أقل من 16 أو 10 ملغ / مل، أنه تم تدبير معدلات البقاء على قيد الحياة (اثنان من جانب واختبار فيشر بالضبط، ع = 0.95 أو أكثر للفرق بين مجموعات). وكانت مستويات الأوكسجين المذاب في هاتين التجربتين 65٪ فما فوق. الجمبوزيا هي الأنواع الغازية هاردي جدا التي يمكن أن تعيش في المياه ذات الجودة المنخفضة. سيكون من المثير للاهتمام أن استخدام هذه المقايسات من التعرض الميكروبي الطبيعي لقياس بقاء الأنواع الأخرى ضد تحديا من المياه الملوثة. عينات من المياه من مواقع بيئية محددة، خاصة تلك التي تتعرض لزيادة المغذيات، يمكن أن تستخدم في فحص مماثل، على الرغم من أن نوعية المياه (المنحلة O 2 والنترات والملوحة، الخ.) يجب أن يتم تحديدها كعامل يحتمل الخلط.
البريد الأسماكxposed إلى ريفامبيسين كانوا أكثر عرضة للإجهاد الاسموزي من الأسماك التحكم (الشكل 3). لاحظ اختبار سجل المرتبة فرق معنوي (p = 0.049) في معدل البقاء على قيد الحياة (وفاة 43٪ في المجموعة الضابطة وفاة 88٪ في المجموعة التي تلقت العلاج، ن = 9 لكلا الفريقين) عندما تحدى مع ملوحة مرتفعة. اتفقت نتائج هذا الاختبار مع تحديد 18.1 ملغ / مل كما LC 50 لكلوريد الصوديوم مع G. affinis في 24 ساعة في المياه العذبة 20. علامات الإجهاد الملحي الذي يحمل الأسماك تشمل احمرار حول الخياشيم وانخفض السباحة الحركة. مع هذا الاختبار، ومستويات الملوحة فوق 18 ملغ / مل أدى إلى وفاة الأسماك السريع.
عندما تتعرض لنترات السم في عمود الماء، لم قبل التعرض للمضادات الحيوية لا يؤثر على بقاء (الجدول 2). لكل محاكمة، وقد سجلت حالة وفاة في كل نقطة زمنية قصيرة وطويلة، تمثل التأثيرات الحادة والمزمنة أكثر من غيرهم. تركيزمن 10 ملغ وقد تم اختيار / مل على أساس كونها LD 50 لG. affinis في المياه العذبة في 48 ساعة 21. وكانت نتائج هذا الاختبار بما يتفق مع هذه القيمة LD 50، مع الفتك 50٪ في كل من المجموعات المعالجة والسيطرة عليها بعد 90 ساعة. وهناك تحد أكبر من نترات تم فحص (17.5 ملغ / مل) أيضا، مما يؤدي إلى مزيد من الموت السريع. مرة أخرى لم يكن هناك فرق في مجموعات العلاج. النتريت هو بشكل كبير أكثر سمية من نترات إلى G. affinis، مع LD 50 من 0.0015 ملغ / مل في 48 ساعة 22. المجتمع تحليل الكيمياء الحيوية باستخدام نظام مؤشر التعريف التحليلي (غير منشورة) تبين أن الجراثيم جلد السمك لديه القدرة على الحد من النترات. ومع ذلك، ظلت مستويات النتريت في APW خلال التجربتين أقل من الحد كشف (0.001 ملغ / مل). ويمكن استخدام هذه الطريقة التحدي مع أي مواد كيميائية قابلة للذوبان الصغيرة.
عندما فردية في أكواب ور بتغذيةانه نفس الكمية إلى كل السمك لمدة شهر، لوحظ وجود اتجاه للأسماك المعالجة المضادات الحيوية ليست زيادة الوزن وكذلك الأسماك السيطرة، دون فروق ذات دلالة إحصائية (لا تظهر البيانات). لتجنب الإجهاد من الفردية، وتم إيواء الأسماك معا كمجموعة للأسماك المعالجة وغير المعالجة في الدلاء لمدة شهر واحد، ونظرا كميات مطابقة المواد الغذائية. الحد من هذا الإعداد هو أن الأسماك لا يجوز يتلقون نفس الطعام على أساس فردي. ومع ذلك، في نموذج مجموعة، وتعامل الأسماك في المتوسط المفقودة مراقبة الوزن، والأسماك على متوسط الوزن المكتسبة (الجدول 3). لا يبدو كمية من المواد الغذائية والأسماك وتستهلك أن تتأثر التعرض للمضادات الحيوية مسبق، لذلك قمع الشهية هو تفسير المرشح المحتمل لعدم زيادة الوزن. عوامل أخرى عديدة يمكن أن تسهم، بما في ذلك التغيرات في التهاب في القناة الهضمية، ومستويات إنتاج المخاط، نفاذية الأمعاء، و / أو حركية الأمعاء. والميزة الرئيسية لهذا الاختبار لقياس nutritiآثار اونال هو البساطة. أنها غير مكلفة، وتتطلب فقط توازن المختبرات والأجهزة. وهي مناسبة للكشف عن تأثير، مما يؤدي إلى التجريب المعنية الأخرى لتحديد آلية.
أحد العوامل سبيل المثال لدراسة تتعلق زيادة الوزن الأسماك عبور وقت الطعام، والذي يرتبط إلى الأمعاء على الحركة. ويمكن إدراج ديكستران المسمى FITC إلى الغذاء مهيلم وهو غير قاتل للأسماك. قياس مضان في المياه المحيطة بها مع مرور الوقت يعطي قياس مدى سرعة FITC-ديكستران يمر من خلال القناة الهضمية. مضان فوق الخلفية يمكن اكتشافه في أقرب وقت 2 ساعة، مع كحد أقصى وصلت بعد 16 ساعة تغذية ما بعد (الشكل 4). هذه النتيجة مع الأسماك التحكم من حوض للماء. لم يتم الحصول على نتائج موثوقة من الأسماك المعالجة المضادات الحيوية. واحد الحد من هذا الإجراء هو أن فترة المجاعة 2-د مطلوب للأسماك لتناول الطعام. وأدف antage من البروتوكول هو حساسية عالية (منخفضة مضان الخلفية)، كما تناول الأسماك قسم الأغذية واحد فقط يمكن أن تعطي نتائج، على الرغم من أن البيانات هي أكثر اتساقا عندما تؤكل قسمين. هذا البروتوكول هو أقل تعقيدا من طريقة مماثلة وقاتلة للفئران 23.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي للبروتوكول التجريبية المشتركة. (أ) هو توضيح تدفق الرسم البياني، من اليسار إلى اليمين، الأسماك المنقولة من خزان ماء، وفصلها إلى (الأزرق) معاملة الجماعات المضادات الحيوية (التي يمثلها الماء الأحمر) أو السيطرة، ومن ثم وضعها في أكواب فردية لتتبع الظواهر. B و C تصوير عملية استخراج جلد السمك والأمعاء microbiomes. بعد vortexing ل، وعلقت البكتيريا في حل لتحليل المجتمع الميكروبي.55170 / 55170fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مسببات الأمراض الحساسية. منحنى البقاء على قيد الحياة خلال التعرض لE. ictaluri للأسماك قبل تعامل مع ريفامبيسين (خط أحمر) أو مجموعة ضابطة (خط أسود) الأسماك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الاستعداد للالإجهاد تنافذي. منحنى البقاء على قيد الحياة خلال التعرض لارتفاع نسبة الملوحة للأسماك في كلا المجموعتين المضادات الحيوية المعالجة وغير المعالجة. سبيل بورصة عمان انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المأكولات عبور الزمن. مضان مع مرور الوقت في المياه من الأسماك تغذية FITC-ديكستران. السمك وأكل قسمين الجيلاتين الغذائية والأسماك B أكلت واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: حساسية إلى الأعلى الميكروبية البيئات. تم تقييم التعرض للالبراز الإنسان في 3 تركيزات مختلفة. نسبة موت س: ص يظهر العدد الإجمالي للقتلى الأسماك في نقطة زمنية المشار س مقارنة مع العدد الكلي من الأسماك في المجموعة ذ التجريبية.
ضمن الصفحات = "1"> 
الجدول 2: نترات سمية التحدي. سجلت مرة وفيات الأسماك في المجموعات المعالجة والتحكم في جميع أنحاء التعرض لتركيز النترات السامة. نسبة موت س: ص يظهر العدد الإجمالي للقتلى الأسماك في نقطة زمنية المشار س مقارنة مع العدد الكلي من الأسماك في المجموعة ذ التجريبية.
الجدول 3: تحليل النمو. التغييرات في وزن الجسم الكلي بعد شهر واحد بعد العلاج بالمضادات الحيوية أو السيطرة عليها. الفرق في المئة في الأولي متوسط وزن الجسم (للأسماك في تلك المجموعة التجريبية) مقارنة النهائي متوسط وزن الجسم هو العمود Δweight. N هو عدد الأسماك في تلك المجموعة. وزن متوسط في الأسماك في نهاية المحاكمة هو نقص الوزن / الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتطلب بعض التحديات فترة راحة في APW نظيفة بعد العلاج بالمضادات الحيوية للدواء إلى أن تستنفد في أنسجة الأسماك. إذا تم تخطي فترة راحة ثم وجود المضادات الحيوية يمكن أن يربك النتائج، وخصوصا عندما ينطوي على فحص التعرض للبكتيريا. من أجل دراسة الآثار من تكوين microbiome تغير دون تغييرات كبيرة في عدد من الميكروبات على المضيف، والتجارب الأولية مراقبة تكوين microbiome (16S التنميط أو كله تسلسل الجينوم)، والكثافة السكانية (16S الكميات عبر QPCR) أثناء التعرض للمضادات الحيوية سيكون مطلوب. بينما 3 د هو الأمثل في هذا النظام، وتغيير المضيف و / أو أن المضادات الحيوية تتطلب إعادة تقويم.
نموذجية من البحوث الطبية الحيوية، ويستخدم نموذج الفأر عادة للدراسات microbiome. نموذج الأسماك الأكثر شيوعا هو الزرد. من أجل الحصول على فهم أفضل للخصائص عالمية للهيكل ووظيفة microb المخاطيةiomes والتفاعلات المضيف، ونماذج جديدة وغير نمطية هي ضرورة. يخدم نموذجنا الأسماك WT كمصدر أصيل لدراسة التفاعلات مضيف microbiome من قبل بما في ذلك التباين الوراثي المضيف الطبيعي أن نماذج أخرى قد فقدت بسبب أجيال التي أثيرت مختبر زواج الأقارب الحيوان 24. والميزة التجريبية الرئيسية للالجمبوزيا هي طبيعتها هاردي، تحمل مجموعة واسعة من الظروف. وقد لوحظت معدلات البقاء على قيد الحياة عالية في المياه التي تختلف في درجة الحرارة (4-38 درجة مئوية)، والملوحة (0-17 ملغ / مل)، الأكسجين الذائب (110-25٪)، ودرجة الحموضة (4-8). هذا لا يسمح بفحص فقط العديد من الظروف البيئية، ولكن أيضا لإجراءات تجريبية متعددة الخطوات التي غالبا ما تكون مرهقة جدا بالنسبة للأنواع الأسماك الأخرى.
هي مناسبة الإجراءات المعروضة هنا للفحص السريع لاكتشاف آثار المضيف من علاج معين. هناك حاجة لدراسات المتابعة لتحديد العلاقة السببية المباشرة والآلية. مثال تمديد ستوديوفاق لآثار المضيف microbiome الأسماك وتشمل: قياس التهاب الأمعاء، فحص صحة الأسماك عن طريق قياس مخازن الدهون، وقياس مستويات المخاط على الجلد والأمعاء. ويجري حاليا تطوير نظام معروف المعايشات للدراسة في الروابط التفاصيل من الميكروبات محددة لبعينها الظواهر المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
