Summary
（诸多） 神经肌肉接头功能评估可以提供有关肌肉和神经之间的通信的基本信息。在这里，我们描述一项议定书，全面评估的诸多和肌肉功能使用两种不同的肌肉神经制剂，即比目鱼坐骨神经和膈肌膈。
Abstract
学习运动神经元和肌肉之间的通信受损，老化和萎缩侧索硬化 (ALS) 等疾病时，神经肌肉接头 （诸多） 功能发挥了关键作用。在这里，我们描述了一个实验性的协议，可以用于衡量诸多功能相结合的电刺激的两种类型： 直接肌肉膜刺激和通过神经刺激。对这些两不同刺激的肌肉反应的比较可以帮助定义，一级功能，在诸多导致肌肉功能下降的潜在变化。
Ex vivo筹备工作适合于严谨的研究。在这里，我们描述密集的协议来衡量的肌肉和诸多功能为比目鱼坐骨神经制备和膈肌膈神经编写几个参数。议定书 》 持续约 60 分钟，进行不间断地定制抽搐动力学性质、 力频率关系的肌肉和神经的刺激和两个参数特定于诸多功能，即神经递质失败和 intratetanic 疲劳的措施的软件。这种方法用于检测损害比目鱼肌和膈膜肌肉神经制剂中通过使用 SOD1G93A转基因小鼠，ALS 无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 实验模型。
Introduction
神经肌肉接头 （诸多） 是由肌肉纤维运动终板和运动神经元轴突末端之间的连接形成化学突触。诸多已被证明至关重要的作用，当肌肉和神经之间的通信是受损，发生在老化或萎缩侧索硬化 (ALS)。肌肉和神经沟通双向方式1，2，能够衡量诸多缺陷分别从肌肉缺损可提供其病理相互作用的新见解。事实上，这个功能的评价可能有助于评估是否形态或生化改建减少神经传递信号的功能。
作为间接测量的诸多功能，提出了肌肉收缩反应诱发神经刺激和诱发其膜的直接刺激同一块肌肉的反应的比较。事实上，自膜刺激通过传递神经传递信号，任何两个收缩反应的差异可归因于诸多的变化。这种方法已经被广泛提出大鼠3，4，，56，7，并也用于在鼠标模型8，，910，，1112上收集信息。
在这里，我们描述详细的消费税和测试两种肌肉神经制剂，即的比目鱼坐骨神经和膈肌膈筹备工作的过程。使用定制软件，我们设计了一个连续的测试协议，结合测量的几个重要参数表征诸多和肌肉的功能，从而产生诸多损害综合评价分别从那肌肉。特别是，议定书 》 的措施抽搐力、 肌肉动力学、 直接力频率曲线和神经刺激，神经递质失败13射击和破伤风的频率，和 intratetanic 疲劳7。
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Representative Results
我们描述了议定书 》 提供了几种神经肌肉疾病或衰老骨骼肌功能失神经支配有关的信息。这个协议可以用于确定是否 （以及，如果是这样，在哪个层面） 肌肉变化是发生在本身的肌肉或神经肌肉传递的选择性变化。如下图所示的数据是工作的以前由我们组18，肌萎缩侧索硬化疾病20结束阶段 SOD1G93A转基因小鼠模型上进行的结果。SOD1G93A转基因小鼠无所不在 overexpresses 突变体的抗氧化剂酶超氧化物歧化酶 1 (SOD1)。图 3 和图 4 显示了 dF/dt 和破伤风力值比目鱼坐骨神经神经 （左） 和膈肌膈神经 （右） 的筹备工作。这些结果表明在这里提出来检测功能缺陷在转基因的肌肉而不是那些严格有关肌肉本身相关的诸多的技术能力。事实上，对于 dF/dt 和破伤风力，SOD1G93A比目鱼肌显示相比控制肌肉，直接刺激，并显示通过神经受到刺激时进一步减少时减少收缩反应。相比之下，轻度改变观察这两个参数通过膜，刺激隔膜肌条而显著变化检测时膈肌刺激通过神经。
图 3- 收缩动力学。比目鱼肌 （A） 和横膈膜 （B） 筹备工作的意思是 dF/dt 的 ± 扫描电镜。比目鱼肌标本显示出现明显放缓下来直接刺激时 (-27%)，和通过神经受到刺激时进一步减少 (-58%)。横膈膜标本显示放缓仅当通过神经刺激时 (-30%)。改编自鲁祖德等18。请点击这里查看此图的大版本。
图 4-破伤风力。比目鱼肌 （A） 和横膈膜 （B） 筹备工作的意思是 ± SEM 的破伤风的比力。比目鱼肌标本显示出现明显放缓下来直接刺激时 (-26%)，和进一步的减少，通过神经受到刺激时 (-50%)。横膈膜标本显示仅当通过神经刺激时力下降 (-44%)。改编自鲁祖德等18。请点击这里查看此图的大版本。
Intratetanic 疲劳和神经递质失败评价允许诸多具体参数来衡量。图 5显示了 intratetanic 疲劳 （如果） 期间比目鱼肌 (图 5A) 的破伤风疲劳范式测量的平均值和横膈膜带 (图 5B)。据报告在协议部分中，我们应用的疲劳范式开展了这样的方式来强调诸多虽然不是肌肉的。因此，如果测量为直接肌肉刺激永远不变。事实上，如果计算的神经刺激是不同的小鼠品系之间的比较时必须考虑的参数。我们的结果表明，如果转基因比目鱼肌和横隔膜肌肉比在控制同行是显著降低。这种差异是在横膈膜，其中小肌肉缺损检测，更大的和小比目鱼肌，严重的肌肉损伤已经来衡量。应该铭记，既然转基因比目鱼肌明显受损，诸多评价是正确的刺激，是转基因的肌肉要返回 null 值的力当刺激的时间达 8 分钟。如果值在 8 分钟的刺激后基本上表示噪声的转基因比目鱼。
图 5-Intratetanic 疲劳。Intratetanic 疲劳的比目鱼肌 （A） 和横膈膜 （B） 肌肉显示转基因的诸多功能显著降低。值是平均 ± 镜适应从鲁祖德等18。请点击这里查看此图的大版本。
图 6显示了破伤风的频率测量中的比目鱼 (图 6A) 和隔膜 (图 6B) 标本的神经传递失败。如果结果，符合神经递质没有缺陷检测到比目鱼肌，而横膈膜肌肉标本在神经肌肉接头疲劳性显示显著的增加。
图 6-神经递质失败。神经递质失败没有显示任何改变在比目鱼肌 （A），虽然强调了在转基因的诸多功能显著降低隔膜条 （B）。值是平均 ± 镜适应从鲁祖德等18。请点击这里查看此图的大版本。
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Discussion
上述实验协议提供一个理想的测量和识别任何功能的改变发生在肌肉中直接或间接在神经肌肉接头处一级途径。由于这项技术基于间接测量的诸多功能，它不能用于建立与形态学变化或与生化指标的变化，是否有关任何缺陷。与此相反的是，它提供确定是否任何形态或生化改建有减少神经递质信号功能的有效途径。然而，力测量完成后，肌肉可以从浴、 涂抹、 在最佳长度固定，，包围嵌入化合物，并移除迅速冻结在融化异戊烷。肌肉可以存储在-80 ° C 后续评估，如免疫组织化学和形态学分析等。
我们在这里提出的技术基于实验的测试协议，结合，第一次，表征诸多和肌肉功能的几个参数的测量。三个关键点可确保这种技术产生可靠的结果。
第一，虽然骨骼肌肉切除现在是一个比较常见的技术，以保持肌肉神经外科手续时，必须采取额外的照顾。尝试任何其他实验的模型之前，因此必须对控制小鼠测试经营者的能力。在对照组小鼠，直接和间接刺激肌肉收缩反应预计是相同的从而提供对运营商的手术能力的控制。
另一个关键的一点是需要确保直接脉冲却不会在刺激内神经肌支的激活肌肉和应用于神经脉冲不激活肌肉出土文物的方式通过传播当前在洗澡。通过膜上直接执行单独的一组实验中，刺激肌肉，D-筒箭毒碱前后都可以测试的第一个点 (25 µ M) 已添加到生理浴。一旦被固定的耐力的当前值，不应由 D-筒箭毒碱的添加修改的肌肉反应。第二点与离体神经的长度相关，因此更易发生变异。在吸电极电流必须进行评估，每个测试开始前议定书 》 一节中描述。
最后，因为诸多功能由对直接和间接刺激肌肉反应的对比评估，必须非常精确地同步电脉冲信号。这一点是特别重要的两个疲劳范式在结束了议定书 》 在此期间肌肉一次刺激，膜上和 14 倍通过神经。由于刺激阶段和休息时间都很低 (0.33 s 和 0.67 s 横膈膜)，甚至很低的滞后将导致不平衡刺激的两节车厢之一。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
在作者的实验室的工作被支持基金会罗姆人和节目 （给予。GGP14066)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
