Summary
Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.
Abstract
Funcionalidade de junção neuromuscular (JNM) desempenha um papel crucial ao estudar as doenças em que a comunicação entre neurônio motor e músculo é prejudicada, como envelhecimento e esclerose lateral amiotrófica (ela). Aqui descrevemos um protocolo experimental que pode ser usado para medir a funcionalidade MNJ combinando dois tipos de estimulação elétrica: direto de estimulação da membrana muscular e a estimulação através do nervo. A comparação da resposta muscular para esses dois estímulos diferentes pode ajudar a definir, a nível funcional, potenciais alterações no MNJ que levam ao declínio funcional no músculo.
Preparações dex vivo E são adequadas para estudos bem controlados. Aqui descrevemos um protocolo intensivo para medir vários parâmetros do músculo e funcionalidade Nicotínico para a preparação do nervo isquiático-sóleo e para a preparação nervo frênico-diafragma. O protocolo dura aproximadamente 60 minutos e é realizado ininterruptamente por meio de uma custom-made software que mede as propriedades de cinética de contração muscular, a relação força-frequência de estimulação do músculo e do nervo e dois parâmetros específicos para a funcionalidade de JNM, ou seja, falha de neurotransmissão e fadiga intratetanic. Esta metodologia foi utilizada para detectar danos em preparações de nervo-músculo sóleo e diafragma usando SOD1G93A mouse transgénico, um modelo experimental de ALS que ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1).
Introduction
Junção neuromuscular (JNM) é uma sinapse química formada pela conexão entre a placa terminal motor da fibra muscular e o axônio do neurônio motor terminal. O MNJ foi mostrado para jogar um papel crucial, quando a comunicação entre o músculo e do nervo é prejudicada, como ocorre no envelhecimento ou esclerose lateral amiotrófica (ela). Como o músculo e nervo comunicar-se em uma maneira de bidirecional1,2, sendo capaz de medir defeitos MNJ separadamente do músculo defeitos pode fornecer novos insights sobre sua interação fisiopatológica. Com efeito, esta avaliação funcional pode ajudar a avaliar se alterações morfológicas ou bioquímicas reduzem neurotransmissão funcionalidade de sinalização.
A comparação da resposta contrátil muscular, provocada pela estimulação do nervo e a resposta do mesmo músculo evocado por estimulação direta de sua membrana tem sido proposta como uma medida indireta da funcionalidade do MNJ. Com efeito, desde a membrana neurotransmissão de by-pass de estimulação sinalização, quaisquer diferenças nas duas respostas contráteis podem são imputáveis mudanças no MNJ. Esta abordagem foi extensivamente proposta para ratos3,4,5,6,7e também usada para reunir informações sobre modelos de rato8,9,10,11,12.
Aqui, descrevemos em detalhe um procedimento para excisar e testar duas preparações nervo-músculo, i. e. as preparações sóleo-isquiático e frênico-diafragma. Usando um Custom-Made software, nós projetamos um protocolo de teste contínuo que combina a medição de vários parâmetros que caracterizam a funcionalidade tanto Mioneural e músculo, desse modo, produzindo uma avaliação abrangente dos prejuízos MNJ separadamente do músculo. Em particular, o protocolo mede a força de contração muscular, a cinética de músculo, a curva força-frequência para direta e estímulos nervosos, a neurotransmissão falha13 para um despedimento e as frequências tetânica e a fadiga intratetanic7.
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Representative Results
O protocolo descrito fornece informações sobre denervação funcional em diversas doenças neuromusculares ou envelhecimento-sarcopenia. Este protocolo pode ser usado para determinar se (e, em caso afirmativo, em que nível) alterações musculares são devido a seletivas mudanças que ocorrem no músculo em si ou na transmissão neuromuscular. Os dados mostrados abaixo são os resultados de um trabalho anterior de nosso grupo18, realizado sobre o modelo de rato transgénico SOD1G93A de esclerose amiotrófica lateral na fase final da doença20. O rato transgénico SOD1G93A ubiquitously overexpresses o mutante antioxidante da enzima superóxido dismutase 1 (SOD1). Figuras 3 e 4 mostram os valores de força tetânica para o nervo isquiático-sóleo (à esquerda) e para as preparações nervo frênico-diafragma (à direita) e dF/dt. Estes resultados demonstram a capacidade da técnica aqui proposta para detectar os defeitos funcionais nos músculos transgênicos que estão relacionados com o MNJ em oposição aos estritamente relacionada com o músculo em si. Com efeito, por força tetânica e dF/dt, músculos sóleo SOD1G93A exibido uma resposta contrátil reduzida, em comparação com o músculo de controle, quando estimulado diretamente e exibido uma redução quando estimulado através do nervo. Por outro lado, leves alterações foram observadas estes dois parâmetros quando tiras de músculo diafragma foram estimuladas através da membrana, Considerando que alterações significativas foram detectadas quando o músculo diafragma foi estimulado através do nervo.
Figura 3 - Cinética contrátil. Quer dizer ± SEM das dF/dt para os sóleo (A) e o diafragma (B) os preparativos. Espécimes de sóleo exibido uma desaceleração significativa para baixo quando estimulado diretamente (-27%) e uma nova diminuição quando estimulado através do nervo (-58%). Espécimes de diafragma exibido uma desaceleração somente quando estimulada através do nervo (-30%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 - Força tetânica. Quer dizer SEM ± da força tetânica de específica para os sóleo (A) e o diafragma (B) os preparativos. Espécimes de sóleo exibido uma desaceleração significativa para baixo quando estimulado diretamente (-26%) e uma nova diminuição quando estimulado através do nervo (-50%). Espécimes de diafragma exibido uma diminuição de força só quando estimulado através do nervo (-44%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A avaliação da fadiga intratetanic e da neurotransmissão falha permitiu parâmetros específicos de JNM a ser medido. A Figura 5 mostra os valores médios de fadiga intratetanic (se) medido durante o paradigma de fadiga tetânica para músculos sóleo (Figura 5A) e tiras de diafragma (Figura 5B). Conforme relatado na seção de protocolo, o paradigma de fadiga que aplicamos foi desenvolvido de forma a salientar o MNJ embora não o músculo. Como resultado, o se medido para a estimulação direta do músculo nunca foi alterada. Com efeito, o se calculado para a estimulação do nervo é o parâmetro que deve ser considerado para comparações entre estirpes de mouse diferente. Nossos resultados mostram que o se foi significativamente menor em transgénico sóleo e os músculos diafragma do que as contrapartes de controle. Essa diferença foi maior no diafragma, na qual foi detectado um defeito pequeno músculo, e menor no sóleo, em que o dano muscular significativo já tinha medido. Ele deve ter em mente que, desde que o músculo sóleo transgénicos foi significativamente danificado, a avaliação MNJ só foi correta para até 8 min. de estimulação, que é o tempo que leva para o músculo transgênico retornar o valor nulo da força quando estimulado. Sóleo transgênico se valores após 8 min de estimulação basicamente expressam ruído.
Figura 5 - Fadiga intratetanic. Intratetanic fadiga para os músculos sóleo (A) e o diafragma (B) exibido um decréscimo significativo na funcionalidade de JNM transgénico. Os valores são média ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 6 mostra o fracasso da neurotransmissão na frequência tetânica medida no sóleo (figura 6A) e amostras de diafragma (Figura 6B). De acordo com os resultados, se nenhum defeito na neurotransmissão foi detectado no músculo sóleo, Considerando que os espécimes de músculo diafragma exibido um aumento significativo no cansaço da junção neuromuscular.
Figura 6 -Falha de neurotransmissão. Falha de neurotransmissão não exibir quaisquer alterações em que os músculos de sóleo (A), enquanto destacou um decréscimo significativo na funcionalidade de JNM em transgênicos tiras do diafragma (B). Os valores são média ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo experimental descrito acima fornece uma maneira ideal de medir e discriminar qualquer alterações funcionais ocorridas diretamente no músculo ou indirectamente a nível da junção neuromuscular. Uma vez que esta técnica baseia-se em uma medida indireta da funcionalidade de JNM, não pode ser usado para determinar se qualquer defeito está relacionado às alterações morfológicas ou a alterações bioquímicas. Por outro lado, ele fornece uma maneira eficaz de determinar se as alterações morfológicas ou bioquímicas reduziram a neurotransmissão funcionalidade de sinalização. No entanto, após concluídas as medições de força, o músculo pode ser removido do banho, apagado, fixado no comprimento ideal, rodeado por incorporação de composto e rapidamente congelado no derretimento isopentano. Os músculos podem ser armazenados a-80 ° C para posterior avaliação, tais como para imunohistoquímica e análise morfológica.
A técnica que aqui propomos baseia-se em um protocolo de teste experimental que combina, pela primeira vez, a medição de vários parâmetros que caracterizam a funcionalidade Mioneural e músculo. Três pontos cruciais certifique-se que esta técnica produz resultados confiáveis.
Em primeiro lugar, embora a excisão do músculo esquelético é agora uma técnica relativamente comum, extra deve ter cuidado ao realizar o procedimento cirúrgico, a fim de manter o nervo intacto com o músculo. Habilidade do operador, portanto, deve ser testada em ratos de controle antes de qualquer outro modelo experimental é tentado. Em ratos de controle, as respostas contráteis musculares para estímulos diretos e indiretos são esperadas para ser o mesmo, proporcionando um controle para habilidade cirúrgica do operador.
Outro ponto crucial é a necessidade de assegurar que pulsos diretos não ativar o músculo por estimulantes intramusculares ramos do nervo e que os pulsos aplicados ao nervo não ativar o músculo de forma artefactual espalhando atual no banho. O primeiro ponto pode ser testado por meio de um conjunto separado de experiências em que o músculo é estimulado diretamente a membrana antes e depois D-tubocurarina (25 µM) foi adicionado ao banho physiological. Uma vez que o valor atual de supramaximal foi corrigido, a resposta muscular não deve ser alterada pela adição de D-tubocurarina. O segundo ponto está relacionado ao comprimento do nervo extirpado e é, portanto, mais suscetível à variação. A corrente para o eletrodo de sucção deve ser avaliada antes do início de cada teste, conforme descrito na seção de protocolo.
Por último, desde que a funcionalidade de JNM é avaliada comparando a resposta muscular à estimulação direta e indireta, os impulsos eléctricos devem ser sincronizados com precisão. Este ponto é particularmente importante para os paradigmas de duas fadiga ao final do protocolo durante o qual o músculo é estimulado uma vez na membrana e 14 vezes através do nervo. Uma vez que tanto as fases de estimulação e os tempos de descanso são muito baixos (0,33 s e 0,67 s para o diafragma), até mesmo uma defasagem muito baixa conduziria à estimulação desequilibrada de um dos dois compartimentos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Trabalho no laboratório dos autores foi apoiado pela Fondazione Roma e Teleton (conceder n. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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