Summary
Une évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire (NMJ) peut fournir des informations essentielles sur la communication entre le muscle et le nerf. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer globalement les fonctionnalités NMJ tant musculaire à l’aide de deux préparations différentes muscle-nerf, c'est-à-dire soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique.
Abstract
Fonctionnalité de la jonction neuromusculaire (NMJ) joue un rôle central dans l’étude des maladies dans lesquelles la communication entre les neurones moteurs et les muscles est altérée, comme le vieillissement et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons ici un protocole expérimental qui peut être utilisé pour mesurer la fonctionnalité NMJ en combinant deux types de stimulation électrique : direct stimulation membrane musculaire et la stimulation du nerf. La comparaison de la réponse du muscle à ces deux stimulations différentes peut aider à définir, au niveau fonctionnel, les altérations éventuelles dans le NMJ qui conduisent à un déclin fonctionnel dans le muscle.
Préparationsx vivo E sont adaptées aux études bien contrôlées. Nous décrivons ici un protocole intensif pour mesurer plusieurs paramètres de muscle et de la fonctionnalité NMJ pour la préparation de nerf sciatique-soléaire et pour la préparation du nerf phrénique-diaphragme. Le protocole dure environ 60 minutes et est réalisé sans interruption au moyen d’une mesure logiciel qui mesure les propriétés cinétiques de contraction, la relation force-fréquence de stimulation musculaire et du système nerveux et deux paramètres spécifiques aux fonctionnalités de NMJ, c'est-à-dire la défaillance de la neurotransmission et la fatigue intratetanic. Cette méthodologie a été utilisée pour détecter des dommages dans les préparations de nerf-muscle soléaire et le diaphragme à l’aide de souris transgéniques SOD1G93A , un modèle expérimental de la SLA qui risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1).
Introduction
La jonction neuromusculaire (NMJ) est une synapse chimique formée par la liaison entre la plaque de serrage moteur de la fibre musculaire et l’axone des motoneurones terminal. Le NMJ s’est avéré jouent un rôle crucial lorsque la communication entre le muscle et le nerf est altérée, comme le vieillissement ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Comme le muscle et le nerf communiquent en voie bidirectionnelle1,2, être capable de mesurer les défauts NMJ séparément des défauts de muscle peut apporter un nouvel éclairage sur leur interaction physiopathologique. En effet, cette évaluation fonctionnelle peut aider à déterminer si des altérations morphologiques ou biochimiques réduisent fonctionnalité de signalisation de la neurotransmission.
La comparaison de la réponse contractile musculaire provoquée par une stimulation nerveuse et la réponse du muscle même évoqué par stimulation directe de sa membrane a été proposée comme une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ. En effet, depuis la neurotransmission membrane stimulation de contournement de signalisation, toutes les différences dans les deux réponses contractiles peuvent être imputés à l’évolution de la NMJ. Cette approche a été largement proposée pour rats3,4,5,6,7et également utilisée pour recueillir des informations sur des souris modèles8,9,10,11,12.
Ici, nous décrivons en détail une procédure permettant d’accise et de tester deux préparations de muscle-nerf, i. e. les préparatifs du soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique. À l’aide de fait à l’ordre logiciel, nous avons conçu un protocole d’analyse continu qui combine la mesure des différents paramètres qui caractérisent la fonctionnalité NMJ et le muscle, réduisant ainsi à une évaluation complète des dommages NMJ séparément de celui du muscle. En particulier, le protocole de mesure de la force de la contraction, la cinétique de muscle, la courbe force-fréquence direct et les stimulations nerveuses, l' échec de neurotransmission13 pour une mise à feu et les fréquences tétaniques et la fatigue intratetanic7.
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Representative Results
Le protocole que nous décrit fournit des informations sur une dénervation fonctionnelle dans plusieurs maladies neuromusculaires ou vieillissement-sarcopénie. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si (et, dans l’affirmative, à quel niveau) altérations musculaires sont dues à des variations sélectives qui se produisent dans le muscle lui-même ou dans la transmission neuromusculaire. Les données présentées ci-dessous sont le résultat d’un travail antérieur de notre groupe18, réalisée sur le modèle de souris transgénique SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique à la phase terminale de la maladie20. La souris transgénique SOD1G93A risque partout la mutant antioxydant enzyme superoxyde dismutase 1 (SOD1). Figures 3 et 4 montrent la dF/dt et les valeurs de force tétanique pour le nerf sciatique-soléaire (à gauche) et les préparatifs du nerf phrénique-diaphragme (à droite). Ces résultats démontrent la capacité de la technique proposée ici pour détecter les défauts fonctionnels dans les muscles transgéniques qui sont reliés aux NMJ par opposition à celles qui sont strictement liées au muscle lui-même. En effet, pour les dF/dt et force tétanique, le muscle soléaire SOD1G93A affiche une diminution de la réponse contractile, comparée à muscle témoin, lorsque stimulé directement et affiche une réduction supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf. En revanche, légères modifications ont été observées dans ces deux paramètres lorsque les bandes de muscle diaphragme sont stimulées à travers la membrane, alors que des modifications importantes ont été détectées quand le muscle diaphragme a été stimulé par le nerf.
Figure 3 - Cinétique contractile. Moyenne ± SEM de dF/dt pour les préparations soléaire (A) et le diaphragme (B). Spécimens du soléaire affichent un ralentissement significatif vers le bas quand directement stimulé (-27 %) et une diminution supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf (-58 %). Spécimens de diaphragme affichent un ralentissement uniquement lorsque stimulé par le nerf (-30 %). Adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 - Force tétanique. Moyenne ± et tétaniques force spécifique pour les préparations soléaire (A) et le diaphragme (B). Spécimens du soléaire affichent un ralentissement significatif vers le bas quand directement stimulé (-26 %) et une diminution supplémentaire quand ils sont stimulés par l’intermédiaire du nerf (-50 %). Spécimens de diaphragme affichent une diminution de la force seulement lorsque stimulé par le nerf (-44 %). Adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
L’évaluation de la fatigue intratetanic et de l’échec de la neurotransmission permis paramètres spécifiques NMJ à mesurer. La figure 5 illustre les valeurs moyennes de fatigue intratetanic (si) mesurée pendant le paradigme tétaniques fatigue de muscle soléaire (Figure 5 a) et des bandes de diaphragme (Figure 5 b). Comme indiqué dans la section du protocole, le paradigme de fatigue, que nous avons appliqué a été développé de manière à souligner la NMJ cependant pas le muscle. En conséquence, la mesurée pour la stimulation musculaire directe n’a jamais été modifiée. En effet, l’IF calculée pour la stimulation du nerf est le paramètre qui doit être considéré pour les comparaisons entre les souches de souris différents. Nos résultats montrent que l’IF était significativement plus faible dans les soléaires transgéniques et muscles du diaphragme que dans les homologues de contrôle. Cette différence est plus grande dans le diaphragme, dans lequel a été détecté un défaut de petits muscles, et plus petits dans le muscle soléaire, dans lequel les lésions musculaires importants avaient déjà mesuré. Il faut avoir à l’esprit que puisque le muscle soléaire transgénique a été considérablement endommagé, l’évaluation de NMJ n’était correcte jusqu'à 8 min de stimulation, c'est-à-dire le temps que nécessaire pour que le muscle transgénique retourner la valeur nulle de force quand ils sont stimulés. Soléaire transgénique si valeurs après 8 min de stimulation expriment fondamentalement le bruit.
Figure 5 - Fatigue intratetanic. Intratetanic fatigue pour les muscles soléaires (A) et le diaphragme (B) affiche une baisse significative des fonctionnalités NMJ transgéniques. Les valeurs sont moyenne ± SEM. adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 6 illustre l’échec de la neurotransmission à la fréquence tétanique mesurée dans le soléaire (Figure 6 a) et les spécimens de diaphragme (Figure 6 b). En accord avec les résultats de l’IF, aucun vice de neurotransmission n’a décelé dans le muscle soléaire, tandis que les spécimens de muscle diaphragme affichent une augmentation significative dans la fatigabilité de la jonction neuromusculaire.
Figure 6 -Échec de Neurotransmission. Échec de neurotransmission n’affichait pas d’altérations dans les muscles soléaires (A), bien que mis en évidence une diminution significative de la fonctionnalité NMJ dans transgénique diaphragme bandes (B). Les valeurs sont moyenne ± SEM. adapté de Rizzuto et al., 18. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole expérimental décrit ci-dessus est un moyen idéal de mesure et de discriminer les altérations fonctionnelles qui ont eu lieu directement dans le muscle ou indirectement au niveau de la jonction neuromusculaire. Étant donné que cette technique est basée sur une mesure indirecte de la fonctionnalité NMJ, il ne peut servir à établir si tout défaut est lié à des changements morphologiques ou de changements biochimiques. En revanche, il fournit un moyen efficace de déterminer si des modifications morphologiques ou biochimiques ont réduit neurotransmission fonctionnalité de signalisation. Cependant, après que mesure de la force est terminés, le muscle peut être retiré de la salle de bain, effacé, épinglé à la longueur optimale, entouré d’encastrement composé et rapidement congelé en fonte isopentane. Les muscles peuvent être stockés à-80 ° C pour une évaluation ultérieure, comme pour immunohistochimiques et analyse morphologique.
La technique nous vous proposons ici est basée sur un protocole d’essai expérimental qui combine, pour la première fois, la mesure de plusieurs paramètres caractérisant la fonctionnalité NMJ et muscle. Trois points cruciaux, s’assurer que cette technique donne des résultats fiables.
Premièrement, bien que l’excision du muscle squelettique est maintenant une technique relativement courante, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l’exécution de l’intervention chirurgicale afin de préserver le nerf avec le muscle. Capacité de l’opérateur doit donc être testée sur des souris témoins avant que tout autre modèle expérimental est tentée. Chez les souris témoins, les réponses contractiles du muscle à des stimulations directes et indirectes sont censés être les mêmes, offrant ainsi un contrôle de capacité chirurgicale de l’opérateur.
Un autre point crucial est la nécessité de veiller à ce que les impulsions directes n’activent pas le muscle par stimulation intramusculaire branches du nerf et que les impulsions appliquées au nerf n’activent pas le muscle d’une manière artéfactuelles par épandage actuelle dans le bain. Le premier point peut être testé en effectuant un ensemble distinct d’expériences où le muscle est stimulé directement sur la membrane avant et après la D-tubocurarine (25 µM) a été ajouté à la baignoire physiologique. Une fois que la valeur actuelle de supramaximal a été fixée, la réponse du muscle ne devrait pas être modifiée par l’addition de la D-tubocurarine. Le deuxième point est lié à la longueur du nerf excisée et est donc plus sensible aux variations. Le courant à l’électrode d’aspiration doit être évalué avant le début de chaque essai, tel que décrit dans la section protocole.
Enfin, étant donné que la fonctionnalité NMJ est évaluée en comparant la réponse du muscle à une stimulation directe et indirecte, les impulsions électriques doivent être synchronisées avec précision. Ce point est particulièrement important pour les paradigmes deux fatigue à la fin du protocole au cours de laquelle le muscle est stimulé une fois sur la membrane et 14 fois par l’intermédiaire du nerf. Puisque aussi bien les phases de la stimulation et les temps de repos sont très faibles (0,33 s et 0,67 s pour le diaphragme), même un très faible décalage conduirait à une stimulation déséquilibrée de l’un des deux compartiments.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Travail en laboratoire des auteurs a été pris en charge par Fondazione Roma et téléthon (subvention no. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
