Summary
Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.
Abstract
Funzionalità della giunzione neuromuscolare (NMJ) svolge un ruolo fondamentale nello studio di malattie in cui la comunicazione tra il motoneurone e il muscolo è alterata, come invecchiamento e sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Qui descriviamo un protocollo sperimentale che può essere utilizzato per misurare la funzionalità NMJ combinando due tipi di stimolazione elettrica: diretta stimolazione della membrana muscolare e la stimolazione attraverso il nervo. Il confronto della risposta muscolare a queste due diverse stimolazioni può aiutare a definire, a livello funzionale, potenziali alterazioni nella giunzione neuromuscolare che portano al declino funzionale nel muscolo.
Preparazioni dix vivo E sono adatti a studi ben controllati. Qui descriviamo un protocollo intensivo per misurare diversi parametri del muscolo e funzionalità NMJ per la preparazione del nervo sciatico soleo e per la preparazione del nervo frenico a membrana. Il protocollo dura circa 60 min e viene condotta ininterrottamente per mezzo di un su misura software che misura le proprietà di cinetica di contrazione, il rapporto di forza-frequenza per stimolazioni del nervo e del muscolo e due parametri specifici per funzionalità NMJ, cioè la neurotrasmissione guasto e la fatica intratetanic. Questa metodologia è stata utilizzata per rilevare danni nelle preparazioni di nervo del muscolo soleo e diaframma utilizzando mouse transgenico SOD1G93A , un modello sperimentale di ALS che overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1).
Introduction
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un prodotto chimico sinapsi formato dalla connessione tra il terminale del motoneurone della fibra muscolare e l'assone del neurone di motore terminal. NMJ ha dimostrato di giocare un ruolo cruciale quando la comunicazione tra il nervo e del muscolo è alterata, come si verifica nell'invecchiamento o sclerosi laterale amiotrofica (ALS). Come nervo e del muscolo di comunicare in modo bidirezionale1,2, potendo misurare NMJ difetti separatamente da difetti muscolari può fornire nuove intuizioni loro interazione fisiopatologici. Infatti, questa valutazione funzionale può aiutare a valutare se le alterazioni morfologiche o biochimiche riducono neurotrasmissione funzionalità di segnalazione.
Il confronto della risposta contrattile del muscolo suscitato da stimolazione del nervo e la risposta del muscolo stesso evocata dalla stimolazione diretta della sua membrana è stata proposta come una misura indiretta di funzionalità NMJ. Infatti, dal neurotrasmissione di by-pass di stimolazione della membrana di segnalazione, eventuali differenze nelle due risposte contrattili possono essere attribuite ai cambiamenti nella giunzione neuromuscolare. Questo approccio è stato ampiamente proposto per ratti3,4,5,6,7e utilizzato anche per raccogliere informazioni su mouse modelli8,9,10,11,12.
Qui, descriviamo in dettaglio una procedura per asportare e testare due preparati di nervo del muscolo, cioè i preparativi Soleo-sciatic e diaframma-frenico. Utilizzando un su misura software, abbiamo progettato un protocollo di test continuo che combina la misurazione di diversi parametri che caratterizzano la funzionalità del muscolo e NMJ, quindi ottenendo una valutazione completa del danno NMJ separatamente da quella del muscolo. In particolare, il protocollo di misura la forza di contrazione, la cinetica di muscolo, la curva di forza-frequenza per diretta e stimolazioni nervose, la neurotrasmissione guasto13 per un infornamento e le frequenze tetaniche e la fatica di intratetanic7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il protocollo che abbiamo descritto fornisce informazioni su denervazione funzionale in diverse malattie neuromuscolari o invecchiamento-sarcopenia. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare se (e, in caso affermativo, a quale livello) le alterazioni muscolari sono dovuti a cambiamenti selettivi che si verificano nel muscolo stesso o nella trasmissione neuromuscolare. I dati riportati qui sotto sono i risultati di un precedente lavoro di nostro gruppo18, condotto sul modello di topo transgenico SOD1G93A della sclerosi laterale amiotrofica presso lo stadio finale della malattia20. Il topo transgenico SOD1G93A overexpresses ubiquistmente il mutante antiossidante degli enzimi superossido dismutasi 1 (SOD1). Figure 3 e 4 mostrano i valori di forza tetanica per il nervo sciatico Soleo (a sinistra) e per le preparazioni del nervo frenico a diaframma (a destra) e dF/dt. Questi risultati dimostrano la capacità della tecnica qui proposta per rilevare i difetti funzionali in muscoli transgenici che riguardano NMJ al contrario di quelle strettamente legate al muscolo stesso. Infatti, per entrambi dF/dt e forza tetanica, i muscoli soleo SOD1G93A visualizzata una ridotta risposta contrattile, rispetto al muscolo di controllo, quando direttamente stimolato e visualizzata un'ulteriore riduzione quando stimolato tramite il nervo. Al contrario, lievi alterazioni sono state osservate in questi due parametri quando strisce del muscolo diaframma sono stati stimolati attraverso la membrana, mentre le alterazioni significative sono state rilevate quando il muscolo del diaframma è stato stimolato attraverso il nervo.
Figura 3 - Cinetica contrattile. Media ± SEM di dF/dt per le preparazioni Soleo (A) e diaframma (B). Gli esemplari Soleo visualizzato un significativo rallentamento giù quando direttamente stimolato (-27%) e una diminuzione ulteriore quando stimolato tramite il nervo (-58%). Esemplari di diaframma visualizzato un rallentamento solo quando stimolato tramite il nervo (-30%). Adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 - Forza tetanica. Media ± SEM di tetanica force specifica per le preparazioni Soleo (A) e diaframma (B). Gli esemplari Soleo visualizzato un significativo rallentamento giù quando direttamente stimolato (-26%) e una diminuzione ulteriore quando stimolato tramite il nervo (-50%). Esemplari di diaframma ha visualizzato una diminuzione di forza solo quando stimolato tramite il nervo (-44%). Adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La valutazione della fatica di intratetanic e di neurotrasmissione fallimento ha permesso di misurare i parametri specifici NMJ. La figura 5 Mostra i valori medi della fatica intratetanic (se) misurata durante il paradigma di affaticamento tetanica per muscoli soleo (Figura 5A) e diaframma strisce (figura 5B). Come riportato nella sezione protocollo, il paradigma di affaticamento che abbiamo applicato è stato sviluppato in modo da sottolineare le NMJ però non il muscolo. Di conseguenza, se misurata per la stimolazione muscolare diretto mai è stata alterata. Infatti, se calcolato per la stimolazione del nervo è il parametro che deve essere considerato per i confronti tra diversi ceppi di topi diversi. I nostri risultati indicano che il se era significativamente più basso in transgenico soleo e muscoli del diaframma rispetto negli omologhi controllo. Questa differenza era maggiore nel diaframma, in cui è stato rilevato un difetto piccolo muscolo, e minore nel Soleo, in cui danno muscolare significativa aveva già misurato. Da tener presente che, poiché il muscolo soleo transgenico è stato significativamente danneggiato, la valutazione di NMJ solo era corretta per fino a 8 min di stimolazione, che è il tempo che necessario per il muscolo transgenico restituire il valore null di forza quando stimolati. Soleo transgenico se valori dopo 8 min di stimolazione fondamentalmente express rumore.
Figura 5 - Fatica intratetanic. Intratetanic fatica per muscoli soleo (A) e diaframma (B) visualizzato una diminuzione significativa nella funzionalità di NMJ transgenici. I valori sono la media ± SEM. adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 Mostra il fallimento di neurotrasmissione alla frequenza tetanica misurata nel Soleo (Figura 6A) e campioni di membrana (Figura 6B). In linea con i risultati se, nessun difetto nella neurotrasmissione è stato rilevato nel muscolo soleo, mentre gli esemplari del muscolo diaframma visualizzato un aumento significativo nella affaticabilità della giunzione neuromuscolare.
Figura 6 -Errore di neurotrasmissione. Neurotrasmissione guasto non ha visualizzato tutte le alterazioni in muscoli soleo (A), mentre ha evidenziato una diminuzione significativa nella funzionalità di NMJ in transgenici diaframma strisce (B). I valori sono la media ± SEM. adattato da Rizzuto et al. 18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo sperimentale descritto sopra fornisce un modo ideale di misurazione e discriminare eventuali alterazioni funzionali che si sono verificati direttamente nel muscolo o indirettamente a livello della giunzione neuromuscolare. Poiché questa tecnica è basata su una misura indiretta di funzionalità NMJ, non può essere utilizzato per stabilire se qualsiasi difetto è correlato a cambiamenti morfologici o cambiamenti biochimici. Al contrario, fornisce un modo efficace di determinare se eventuali alterazioni morfologiche o biochimiche hanno ridotto la neurotrasmissione funzionalità di segnalazione. Tuttavia, al termine di misure di forza, il muscolo può essere rimosso dal bagno, cancellato, bloccato a lunghezza ottimale, circondato da incasso composto e rapidamente congelato in isopentano di fusione. Muscoli possono essere memorizzati a-80 ° C per la valutazione successiva, come per analisi morfologica e immunohistochemical.
La tecnica che vi proponiamo qui si basa su un protocollo di prova sperimentale che unisce, per la prima volta, la misura di diversi parametri che caratterizzano la funzionalità NMJ e muscolo. Tre punti cruciali assicurano che questa tecnica produce risultati affidabili.
In primo luogo, anche se l'asportazione del muscolo scheletrico è ormai una tecnica relativamente comune, supplementare deve prestare attenzione quando si esegue l'intervento chirurgico al fine di mantenere il nervo intatto con il muscolo. Capacità dell'operatore così devono essere testati su topi di controllo prima di qualsiasi altro modello sperimentale viene tentato. Nei topi di controllo, le risposte contrattili del muscolo a stimolazioni dirette e indirette sono dovrebbe essere lo stesso, fornendo così un controllo di capacità chirurgica dell'operatore.
Un altro punto cruciale è la necessità di garantire che gli impulsi diretti non attivare il muscolo intra-muscolare stimolando rami del nervo e che gli impulsi applicati al nervo non attivare il muscolo in modo artefactual diffondendo corrente nel bagno. Il primo punto può essere verificato eseguendo una serie separata di esperimenti in cui il muscolo viene stimolato direttamente sulla membrana, sia prima che dopo D-tubocurarina (25 µM) è stato aggiunto al bagno di fisiologico. Una volta che il valore corrente di supramaximal è stato risolto, la risposta muscolare non deve essere modificata con l'aggiunta di D-tubocurarina. Il secondo punto è relativo alla lunghezza del nervo asportato e così è più suscettibile di variazione. La corrente all'elettrodo aspirazione deve essere valutata prima dell'inizio di ciascuna prova, come descritto nella sezione protocollo.
Infine, poiché la funzionalità NMJ è valutata confrontando la risposta muscolare alla stimolazione diretta e indiretta, gli impulsi elettrici devono essere sincronizzati molto precisamente. Questo punto è particolarmente importante per i paradigmi di due fatica alla fine del protocollo durante la quale il muscolo è stimolato una volta sulla membrana e 14 volte attraverso il nervo. Poiché sia le fasi di stimolazione e i tempi di riposo sono molto bassi (0.33 s e 0,67 s per il diaframma), anche un ritardo molto basso porterebbe ad una stimolazione sbilanciata di uno dei due comparti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lavoro in laboratorio degli autori è stato sostenuto dalla Fondazione Roma e Telethon (grant no. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
