Summary
הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.
Abstract
צומת עצב-שריר (NMJ) פונקציונליות ממלא תפקיד מרכזי כשלמדתי מחלות בהן התקשורת בין נוירון מוטורי השריר הוא לקוי, כגון הזדקנות נוירודגנרטיביות (ALS). כאן נתאר טיפול נסיוני זה יכול לשמש כדי למדוד NMJ פונקציונליות על ידי שילוב של שני סוגים של גירוי חשמלי: ישיר שריר ממברנה גירוי, הגירוי דרך העצב. השוואת השריר בתגובה stimulations שונים שני אלה יכולים לעזור להגדיר, ברמה תפקודית, שינויים NMJ פוטנציאל להוביל לירידה תפקודית בשריר.
Ex vivo תכשירים מתאימים ללימודים ומבוקרות היטב. כאן נתאר פרוטוקול אינטנסיבית כדי למדוד את מספר הפרמטרים של שריר ופונקציונליות NMJ עבור הכנת עצב הסוליה-פציעה, הכנת עצב הסרעפת-הסרעפת. הפרוטוקול נמשך כ- 60 דקות, והוא מנוהל רציפה ותקינה של בעלי על-ידי מחוייט תוכנה המודדת את המאפיינים קינטיקה עווית הגומלין בתדר כוח עבור שריר וגם עצב stimulations, שני פרמטרים ספציפיים NMJ פונקציונליות, קרי עצבית כשל ועייפות intratetanic. מתודולוגיה זו נעשה שימוש כדי לזהות נזקים בהכנות עצב-שריר הסוליה והסרעפת באמצעות העכבר הטרנסגניים SOD1G93A , מודל ניסיוני של ALS זה ubiquitously overexpresses את חמצון מוטציה האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1).
Introduction
צומת עצב-שריר (NMJ) היא סינפסה כימית שהוקמה על ידי הקשר בין את motor endplate של סיבי השריר הדנדריטי לאקסון מוטור נוירון מסוף. NMJ הוכח לשחק תפקיד מכריע כאשר התקשורת בין שריר עצב הוא לקוי, כמו הזדקנות או נוירודגנרטיביות (ALS). כמו שריר ועצב לתקשר דו-כיוונית דרך1,2, היכולת למדוד פגמים NMJ בנפרד מן השריר פגמים עשויים לספק תובנות חדשות הגומלין physiopathological שלהם. אכן, הערכה תפקודית זו עשוי לעזור כדי להעריך אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי להפחית עצבית איתות פונקציונליות.
ההשוואה של שריר כויץ תגובה שהפיק גירוי עצבי ואת התגובה של אותו שריר עורר על ידי גירוי ישיר של הממברנה שלו הוצע כמו מדידה עקיפות של NMJ פונקציונליות. ואכן, מאז ממברנה גירוי על ידי עובר עצבית איתות, ייתכן ולשייך כל ההבדלים ביומן שתי התגובות כויץ לשינויים ב- NMJ. גישה זו יש בהרחבה תעצומ חולדות3,4,5,6,7, והוא משמש גם כדי לאסוף מידע על העכבר מודלים8,9,10,11,12.
כאן, אנו מתארים בפרוטרוט הליך בלו ולבדוק שני שריר-עצב ההכנות, כלומר את ההכנות הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת. שימוש של מחוייט תוכנה, עיצבנו פרוטוקול בדיקה רציפה המשלבת את המדידה של מספר פרמטרים המאפיינות פונקציונליות NMJ והן שריר, ובכך מניב הערכה מקיפה של נזק NMJ בנפרד מזה של השריר. בפרט, הפרוטוקול מודד הכוח עווית, קינטיקה של שרירים, עקומת כוח-תדירות עבור ישיר, עצב stimulations, כשל עצבית13 פיטורים ואת התדרים tetanic, וגם את עייפות intratetanic7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול שהסברנו מספק מידע על denervation פונקציונלי במספר מחלות נוירומוסקולריות או הזדקנות-sarcopenia. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם (, אם כן, באיזה רמה) שרירים המהווים עקב סלקטיבי שינויים המתרחשים בשריר עצמו או התמסורת neuromuscular. הנתונים המוצגים להלן הם תוצאה של עבודה קודמת מאת שלנו קבוצה18, שנערך על הדגם העכבר הטרנסגניים SOD1G93A של נוירודגנרטיביות בשלב הסופי של המחלה20. העכבר הטרנסגניים SOD1G93A overexpresses ubiquitously חמצון מוטציה האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). דמויות 3 ו-4 מציגות את dF/dt ואת ערכי כוח tetanic על העצב הסוליה-פציעה (משמאל) ועל ההכנות עצב הסרעפת-הסרעפת (מימין). תוצאות אלה מדגימים את היכולת של השיטה המוצעת כאן כדי לזהות את הליקויים פונקציונלי הטרנסגניים שרירים הקשורים NMJ לעומת אלו הקשורים אך ורק השריר עצמו. אכן, dF/dt וגם כוח tetanic, שרירי הסוליה SOD1G93A מוצגים לתגובה כויץ מופחתת, לעומת שליטה שריר, כאשר ישירות מגורה, הפחתה נוספת אחרי גירוי דרך העצב. לעומת זאת, שינויים קלים נצפו באלה שני פרמטרים כאשר שריר הסרעפת רצועות היו מגורה דרך הממברנה, ואילו שינויים משמעותיים התגלו כאשר שריר הסרעפת זורז דרך העצב.
איור 3 - קינטיקה כויץ. התכוונתי ± SEM של dF/dt הסוליה (א) ודיאפרגמה (ב) ההכנות. הסוליה דגימות שכאשר האטה משמעותית למטה ישירות מגורה (-27%), לבין ירידה נוספת אחרי גירוי דרך העצב (-58%). דיאפרגמה דגימות המוצגים של האטה רק כאשר גירוי באמצעות העצב (-30%). חיבור מקורי ריזוטו et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 - חיל tetanic. התכוונתי ± SEM של כוח מסוים tetanic הסוליה (א) ודיאפרגמה (ב) ההכנות. הסוליה דגימות שכאשר האטה משמעותית למטה ישירות מגורה (-26%), לבין ירידה נוספת אחרי גירוי דרך העצב (-50%). דיאפרגמה דגימות מוצגים ירידה בכוח רק כאשר גירוי באמצעות העצב (-44%). חיבור מקורי ריזוטו et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ההערכה עייפות intratetanic של הכישלון עצבית מותר NMJ פרמטרים ספציפיים שברצונך למדוד. איור 5 מציגה את הערכים הממוצע של עייפות intratetanic (אם) שנמדד במהלך הפרדיגמה tetanic עייפות שרירי הסוליה (איור 5A), הסרעפת רצועות (איור 5B). כפי שדווח במקטע פרוטוקול, הפרדיגמה עייפות שוהגשנו בקשה פותחה כך כדי להדגיש את NMJ. אבל לא את השריר. כתוצאה מכך, אם נמדד עבור גירוי השריר ישירה מעולם לא השתנה. אכן, אם שמחושב על הגירוי העצבי הוא הפרמטר להביא בחשבון להשוואות בין זנים שונים בעכבר. התוצאות שלנו להראות שאם היה נמוך באופן משמעותי הסוליה הטרנסגניים והן שרירי הסרעפת מאשר עמיתיהם שליטה. הבדל זה היה גדול יותר אצל הסרעפת, שבו זוהה פגם שריר קטן, קטן ב- הסוליה, שבו לנזק משמעותי כבר היה נמדד. זה כדאי לזכור כי מאז שריר הסוליה הטרנסגניים נפגע באופן משמעותי, ההערכה NMJ היה רק נכונות עבור עד 8 דקות של גירוי, אשר הוא הזמן שלוקח הטרנסגניים שרירים להחזיר את ערך null של כוח אחרי גירוי. הסוליה הטרנסגניים אם הערכים לאחר 8 דקות של גירוי בעיקרון אקספרס רעש.
איור 5 - עייפות intratetanic. עייפות intratetanic הסוליה (א) ודיאפרגמה (ב) שרירי להציג ירידה משמעותית הטרנסגניים NMJ פונקציונליות. ערכים הם זאת אומרת ± ב- SEM Adapted מ ריזוטו et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 מראה הכשל עצבית בתדר tetanic נמדד על הסוליה (איור 6A) ועל דגימות הסרעפת (איור 6B). עולה בקנה אחד עם התוצאות אם, אין פגם בעצבית זוהה שריר הסוליה, ואילו דגימות שריר הסרעפת המוצגים עלייה משמעותית צומת עצב-שריר fatigability.
איור 6 -עצבית כשל. כשל עצבית לא להציג שינויים הסוליה השרירים (A), בעוד מודגש ירידה משמעותית NMJ פונקציונליות בהטרנסגניים הסרעפת רצועות (ב). ערכים הם זאת אומרת ± ב- SEM Adapted מ ריזוטו et al. 18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הניסוי המתואר לעיל מספק דרך אידיאלית של מדידת וברמת להפלות שינויים פונקציונליים שהתרחשו ישירות בשריר או בעקיפין צומת עצב-שריר. מאז טכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפות של פונקציונליות NMJ, זה לא יכול לשמש כדי לקבוע אם כל פגם קשורה שינויים מורפולוגיים או שינויים ביוכימיים. לעומת זאת, הוא מספק דרך יעילה לקבוע אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי הפחיתו עצבית איתות פונקציונליות. עם זאת, לאחר השלמת כוח מדידות, השריר יכול להיות להסיר את האמבטיה, מחק, מוצמדת-האורך האופטימלי, מוקף מתחם ההטבעה, במהירות קפוא התכה איזופנטאן. השרירים ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס להערכה עוקבות, כגון immunohistochemical וניתוח מורפולוגי.
הטכניקה שאנו מציעים כאן מבוסס על טיפול נסיוני בדיקה המשלבת, בפעם הראשונה, המדידה של מספר פרמטרים אפיון פונקציונליות NMJ ושרירים. שלוש נקודות חיוני להבטיח כי טכניקה זו מניבה תוצאות אמינות.
ראשית, למרות כריתה שרירי השלד עכשיו טכניקה נפוצה יחסית, תוספת חייבים להקפיד בעת ביצוע הליך כירורגי כדי לשמור על העצב שלם עם השריר. היכולת של המפעיל חייב לכן להיבדק על בקרת עכברים לפני מודל ניסיוני אחר מתבצע ניסיון. בעכברים שליטה, שרירים כויץ התגובות stimulations הישירים והעקיפים צפויים להיות זהה, ובכך מספק פקד ליכולת הכירורגית של המפעיל.
נקודה מכרעת נוספת היא להבטיח כי פולסים ישירה לא להפעיל את השריר על ידי ענפים התוך שרירי גירוי של העצב, כי הפולסים חלה על העצב לא להפעיל את השריר בצורה artefactual על ידי הפצת הנוכחי באמבטיה. הנקודה הראשונה יכול להיבדק על ידי ביצוע מערכת נפרדת של ניסויים שבהם מגורה השריר ישירות על הקרום גם לפני וגם אחרי D-tubocurarine (25 מיקרומטר) נוספה לאמבטיה פיזיולוגיים. ברגע הערך הנוכחי supramaximal תוקנה, צריך התגובה שריר לא להשתנות על ידי התוספת של D-tubocurarine. הנקודה השנייה קשורה האורך של העצב נכרת, ולכן היא חשופה יותר וריאציה. הזרם על האלקטרודה היניקה הערכת לפני תחילתו של כל בדיקה, כפי שמתואר בסעיף פרוטוקול.
לבסוף, מאז NMJ פונקציונליות מוערך על-ידי השוואת את השריר בתגובה לגירוי ישיר ועקיף, פולסים חשמליים חייבים להיות מסונכרנים ברמת דיוק גבוהה ביותר. נקודה זו חשובה במיוחד הפארדיגמות שני עייפות בסוף הפרוטוקול במהלכן השריר מגורה פעם על הקרום ודרך 14 פעמים העצב. מאז השלבים גירוי ושעות מנוחה נמוכים מאוד (0.33 s ו- 0.67 s עבור הסרעפת), אפילו פער נמוך מאוד יוביל גירוי בלתי מאוזן של אחד שני תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה במעבדה של המחברים נתמכה על ידי רומא דל'אנג'לו ולהעניק הטלויזיונית (לא. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
