Summary
Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevsel bir değerlendirilmesi sinir ve kas arasındaki iletişimi ilgili gerekli bilgileri sağlar. Burada biz kapsamlı bir şekilde kullanarak iki farklı kas-sinir hazırlıklar, yani soleus siyatik ve diyafram frenik NMJ ve kas işlevselliğini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak.
Abstract
Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevselliği motor nöron ve kas arasındaki iletişimi, yaşlanma ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi Engelli olduğu hastalıklar okurken çok önemli bir rol oynar. Burada iki tür elektriksel stimülasyon birleştirerek NMJ işlevselliği ölçmek için kullanılan bir deneysel protokol tarif: doğrudan kas zarı stimülasyon ve stimülasyon sinir aracılığıyla. Bu iki farklı elektrodlar kas cevaben karşılaştırılması işlev düzeyinde fonksiyonel kas düşüş yol olası değişiklikler NMJ içinde tanımlamak için yardımcı olabilir.
Ex vivo hazırlıkları iyi kontrollü çalışmalar için uygundur. Burada tarif biz kas ve NMJ işlevselliği soleus siyatik sinir hazırlık ve diyafram frenik sinir hazırlık birkaç parametrelerini ölçmek için yoğun bir iletişim kuralı. Protokol yaklaşık 60 dakika sürer ve kesintisiz bir ısmarlama aracılığıyla yapılır seğirme Kinetik özellikleri, sinir ve kas elektrodlar için güç frekanslı ilişki ve iki parametre NMJ işlevselliği için belirli Yani neurotransmission yetmezliği ve intratetanic yorgunluk ölçer yazılım. Bu metodoloji hasar soleus ve diyafram kas-sinir hazırlıkları SOD1G93A transgenik fare, ubiquitously mutant antioksidan enzim süperoksit dismutaz 1 (SOD1) overexpresses ALS deneysel bir model kullanarak bulmak için kullanıldı.
Introduction
Nöromüsküler kavşak (NMJ) kas fiber motor endplate ve motor nöron axon terminal arasında bağlantı oluşturduğu bir kimyasal synapse var. Kas ve sinir arasındaki iletişim, yaşlanma veya amyotrofik lateral skleroz (ALS) gerçekleştiği sırada bozulmuş olduğunda çok önemli bir rol oynamaya NMJ gösterilmiştir. Kas ve sinir bir çift yönlü yol1,2' olarak, NMJ kusurları kas defektleri dan ayrı olarak ölçmek için güçlü olmak onların Fizyopatolojik Interplay yeni görüşler sağlayabilir. Gerçekten de, bu işlevsel değerlendirme morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azaltmak değerlendirmek için yardımcı olabilir.
Kas contractile yanıt sinir stimülasyonu ve onun membran doğrudan uyarılması tarafından uyarılmış aynı kas yanıt elde edildi karşılaştırılması NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm evlenme teklif etti. Gerçekten de, sinyal membran stimülasyon geçer tarafından neurotransmission beri iki contractile yanıt-e doğru tüm farklılıkları NMJ değişikliklere atfedilen. Bu yaklaşım yaygın olarak fareler3,4,5,6,7için önerilen ve ayrıca fare modelleri8tarihinde,9,10,11,12bilgi toplamak için kullanılır.
Burada, tüketim ve soleus siyatik ve diyafram frenik hazırlıkları iki kas-sinir hazırlıklar, yani sınamak için bir yordam ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bir özel kullanarak yazılım, biz tasarlanmış işlevsellik, NMJ ve kas karakterize birkaç parametre ölçümü birleştirir sürekli bir test Protokolü böylece NMJ hasar kapsamlı bir değerlendirme ayrı ayrı bu kas verimli. Özellikle, protokol seğirme gücü, kas Kinetik, kuvvet-frekans eğrisi için doğrudan ve sinir elektrodlar, hem bir ateş ve tetanic sıklık ve intratetanic yorgunluk7neurotransmission başarısızlık13 ölçer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz açıklanan protokol fonksiyonel denervation birkaç nöromüsküler hastalıklar veya yaşlanma-mücadele hakkında bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı olup olmadığını (ve eğer öyleyse, hangi düzeyde) belirlemek için kullanılan kas değişiklikler çoğu kas kendisi veya nöromuskuler iletim oluşan seçici değişiklikleri nedeniyle. Aşağıda gösterilen veri amyotrofik lateral skleroz hastalığı20son aşamasında SOD1G93A transgenik fare modeli üzerinde yapılan bizim grup18tarafından bir önceki çalışmanın sonuçlarıdır. SOD1G93A transgenik fare ubiquitously mutant antioksidan enzim süperoksit dismutaz 1 (SOD1) overexpresses. Şekil 3 ve 4 dF/dt ve soleus siyatik sinir (solda) ve diyafram frenik sinir (sağda) hazırlıkları tetanic kuvvet değerlerinin göster. Bu sonuçlara NMJ için kesinlikle kas için ilgili tersine ilişkili transgenik kaslarda işlev hataları tespit etmek için burada önerilen teknik yeteneğini göstermek. Nitekim, dF/dt ve tetanic gücü için SOD1G93A soleus kas kontrolü kas, ne zaman doğrudan teşvik ve bir daha da azaltma sinir uyardığında görüntülenen ile karşılaştırıldığında düşük bir contractile yanıt görüntülenir. Buna karşılık, diyafram kas şeritler membran uyardığında diyafram kas sinir uyardığında önemli değişiklikler tespit edildi, ancak hafif değişiklikler bu iki parametre gözlendi.
Şekil 3 - Contractile Kinetik. DF/dt ± SEM soleus (A) ve diyafram (B) için hazırlıklar demek. Soleus numuneler görüntülenen bir önemli yavaşlama aşağı doğrudan uyardığında (-27%) ve bir daha da düşüş sinir uyardığında (-58%). Diyafram numuneler görüntülenen bir sinir uyardığında yavaşlama (-30%). Rizzuto vd. 18uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 - Tetanic kuvvet. Tetanic belirli kuvvet ± SEM soleus (A) ve diyafram (B) için hazırlıklar demek. Soleus numuneler görüntülenen bir önemli yavaşlama aşağı doğrudan uyardığında (-26%) ve sinir uyardığında daha fazla bir düşüş (-50%). Diyafram numuneler görüntülenen yalnızca sinir uyardığında kuvvet azalması (-44%). Rizzuto vd. 18uyarlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Değerlendirme intratetanic yorgunluk ve neurotransmission hata ölçülecek NMJ belirli parametrelere izin. Şekil 5 (Eğer tetanic yorgunluk paradigma soleus kaslar (şekil 5A) sırasında ölçülen) intratetanic yorgunluk ortalama değerleri gösterir ve diyafram (şekil 5B) şeritler. Protokol bölümünde bildirildiği gibi biz uygulanan yorgunluk paradigma değil kas NMJ yine de stres şekilde geliştirilmiştir. Sonuç olarak, doğrudan kas uyarımı asla değiştirildi için IF ölçülür. Sinir stimülasyonu farklı fare suşları arasında karşılaştırmalar için düşünülmelidir parametresi için gerçekten de, eğer hesaplanan. Bizim sonuçları IF transgenik soleus ve diyafram kaslarında kontrol karşıtları daha önemli ölçüde daha düşük gösteriyor. Bu fark içinde bir küçük kas hatası algılandı, diyafram, daha ve daha küçük soleus, hangi zaten önemli kas hasarı ölçülen. Transgenik soleus kas önemli ölçüde zarar görmüş olduğundan, NMJ değerlendirme sadece transgenik kas kuvvet uyarılmış zaman null değeri döndürmek gereken süredir stimülasyon, 8 dakikaya kadar için doğru akılda nce karşılanması. Transgenik soleus stimülasyon 8 dk sonra değerler temel olarak gürültü ifade EDERSEK.
Şekil 5 - İntratetanic yorgunluk. İntratetanic yorgunluk soleus (A) ve diyafram (B) kasları için transgenik NMJ işlevselliği önemli bir azalma görüntülenir. Ortalama ± SEM uyarlama sayfasından Rizzuto vd. 18değerlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 soleus (şekil 6A) ve diyafram (şekil 6B) numuneler ölçülen tetanic frekansta neurotransmission başarısızlık gösterir. Diyafram kas numuneler önemli bir artış nöromüsküler kavşak fatigability içinde görüntülenen, ancak eğer sonuçları doğrultusunda soleus kas neurotransmission hiçbir kusur tespit edilmiştir.
Şekil 6 -Neurotransmission hatası. Neurotransmission başarısızlık herhangi bir değişiklik soleus kasları (A) içinde göstermedi, NMJ işlevindeki transgenik önemli bir azalma vurgulanan iken diyafram (B) şeritler. Ortalama ± SEM uyarlama sayfasından Rizzuto vd. 18değerlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan deneysel protokol ölçme ve doğrudan kas veya meydana gelen herhangi bir işlevsel değişiklikler ayrımcılık dolaylı olarak nöromüsküler kavşak düzeyinde ideal bir yol sağlar. Bu teknik NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm üzerinde dayalı olduğundan, herhangi bir kusur morfolojik değişiklikler veya biyokimyasal değişiklikler ile ilişkili Eğer kurmak için kullanılamaz. Buna karşılık, herhangi bir morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azalttı olup olmadığını belirleme etkili bir yol sağlar. Ancak, kuvvet ölçümler tamamlandıktan sonra kas banyodan kaldırıldı, deyimiyle, optimum uzun uzadıya tutturulmuş, gömme bileşik tarafından çevrili olup hızla isopentane erime içinde donmuş. Kasları sonraki değerlendirme için-80 ° C'de gibi immunohistokimyasal ve morfolojik analiz için saklanır.
Burada önerdiğimiz tekniği, ilk kez, birkaç parametre NMJ ve kas işlevselliği karakterize ölçümü bir araya getiren deneysel test iletişim kuralı üzerinde temel alır. Üç önemli nokta bu tekniği güvenilir sonuçlar verir emin olun.
Kas iskelet eksizyon şimdi nispeten yaygın bir teknik olmasına rağmen ilk olarak, ilave sinir kas ile sağlam tutmak için cerrahi işlem yaparken özen göstermelidir. Önce başka bir deneysel model denenir operatör yeteneğini böylece kontrol fareler üzerinde test edilmelidir. Denetim farelerde kas contractile yanıt-e doğru doğrudan ve dolaylı elektrodlar, böylece operatör cerrahi yeteneğini denetime sağlayan aynı olacağı tahmin ediliyor.
Başka bir önemli nokta doğrudan bakliyat uyarıcı içi kas sinir dalları tarafından kas etkinleştirmezseniz ve sinir için uygulanan bakliyat kas yayarak artefactual bir şekilde banyoda geçerli etkinleştirmezseniz emin olmak için ihtiyaç vardır. İlk nokta önce ve sonra D-tubocurarine doğrudan membran üzerinde deneyler hangi kas uyarılmış ayrı bir kümesi gerçekleştirerek test edilebilir (25 µM) fizyolojik banyo için eklendi. Bir kez sabit supramaximal geçerli değer, kas yanıt D-tubocurarine eklenmesi tarafından değiştirilmesi değil. İkinci nokta eksize sinir uzunluğu ile ilgili ve böylece daha fazla varyasyon için duyarlı. Emme elektrot mevcut her test başlamadan önce Protokolü bölümünde açıklandığı gibi değerlendirilmelidir.
Son olarak, NMJ işlevsellik doğrudan ve dolaylı stimülasyon kas cevaben karşılaştırarak değerlendirilir beri elektrik darbeleri çok hassas eşitlenmelidir. Bu noktada özellikle sırasında kas bir kez membran üzerinde ve 14 kez sinir aracılığıyla uyarılır Protokolü sonundaki iki yorgunluk paradigmalar için önemlidir. Stimülasyon aşamaları ve dinlenme saatleri çok düşük olduğundan (0.33 s ve 0,67 diyafram için s), çok düşük bir gecikme bile bir iki bölmeleri dengesiz bir uyarılması için yol açacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarların laboratuvar çalışmalarında Fondazione Roma ve televizyon dizisi tarafından (Hayır ver. desteklenmiştir GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871 (2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
