Summary
Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.
Abstract
Neuromuskuläre Synapse (NMJ) Funktionalität spielt eine zentrale Rolle bei Krankheiten zu studieren, in denen die Kommunikation zwischen Motoneuron und Muskel, wie Altern und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) vorliegt. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll, das verwendet werden kann, um NMJ Funktionalität zu messen, durch die Kombination von zwei Arten der elektrischen Stimulation: direkte Muskelstimulation Membran und die Stimulation durch den Nerv. Der Vergleich der Muskel-Reaktion auf diese zwei verschiedenen Stimulationen kann helfen, um zu definieren, auf der Funktionsebene, mögliche Änderungen in den NMJ, die funktionelle Rückgang der Muskulatur führen.
EX vivo Präparate eignen sich für gut kontrollierte Studien. Hier beschreiben wir eine intensive Protokoll um mehrere Parameter des Muskels und NMJ Funktionalität für die Vorbereitung der Soleus-sciatic Nerv und die Membran-Phrenicus Nerv Vorbereitung zu messen. Das Protokoll dauert ca. 60 Minuten und erfolgt ohne Unterbrechung durch eine maßgeschneiderte Software, die die Twitch-Kinetik-Eigenschaften, das Kraft-Frequenz-Verhältnis für Muskeln und Nerven Stimulationen und zwei Parameter spezifisch für NMJ Funktionalität, d.h. Neurotransmission scheitern und intratetanic Müdigkeit misst. Diese Methode wurde verwendet, um Schäden in Soleus und Zwerchfell Muskel-Nerv-Vorbereitungen mit SOD1G93A transgenen Maus, ein experimentelles Modell Alsen, die ubiquitär die mutierten antioxidative Enzym Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) overexpresses zu erkennen.
Introduction
Die neuromuskuläre Synapse (NMJ) ist eine chemische Synapse, die durch die Verbindung zwischen der motorischen Endplatte der Muskelfaser und das Motoneuron Axon terminal gebildet. Die NMJ nachweislich eine entscheidende Rolle zu spielen, wenn die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven beeinträchtigt, wie es bei Alterung oder Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Da Muskeln und Nerven in einer bidirektionalen Weg1,2 kommunizieren, kann NMJ Mängel getrennt vom Muskel Mängel Messen neue Einblicke in ihre pathophysiologischen Zusammenspiel vorsehen. In der Tat kann diese funktionale Bewertung helfen, um zu beurteilen, ob morphologische und biochemische Veränderungen Neurotransmission Signalisierung Funktionalität reduzieren.
Der Vergleich der Muskel kontraktile Antwort hervorgerufen durch Nervenstimulation und die Reaktion des gleichen Muskels hervorgerufen durch direkte Stimulation der seine Membran wurde vorgeschlagen, als eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität. In der Tat können keine Unterschiede in den beiden kontraktilen Antworten seit Membran Stimulation von Umgehungsstraßen Neurotransmission Signalisierung, Änderungen in den NMJ zugeschrieben werden. Dieser Ansatz intensiv vorgeschlagen für Ratten3,4,5,6,7wurde, und auch verwendet, um Informationen über Maus-Modelle8,9,10,11,12zu sammeln.
Hier beschreiben wir ausführlich ein Verfahren zur Verbrauchsteuer und zwei Muskel-Nerv-Präparate, d. h. die Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus Vorbereitungen zu testen. Mit einem maßgeschneiderten Software, entwickelt wir eine kontinuierliche Testprotokoll, das die Messung verschiedener Parameter kombiniert, die NMJ und Muskel Funktionalität charakterisieren damit eine umfassende Bewertung der NMJ Schaden separat von der Muskel nachgeben. Insbesondere misst das Protokoll Twitch Kraft, die Muskel-Kinetik, die Kraft-Frequenzkurve für direkte und Nerv Stimulationen, die Neurotransmission Fehler13 für eine feuern und tetanische Frequenzen, und die intratetanic Müdigkeit7.
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Representative Results
Das Protokoll, die, das wir beschrieben, informiert über funktionelle Denervierung in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen oder Alterung Sarkopenie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um festzustellen, ob (und wenn ja, auf welcher Ebene) Muskel Änderungen sind durch selektive Veränderungen, die im Muskel selbst oder in der neuromuskulären Übertragung auftreten. Die unten angezeigten Daten sind die Ergebnisse der bisherigen Arbeit von unserer Gruppe18, auf dem SOD1G93A transgenen Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose auf das Endstadium der Krankheit20durchgeführt. Die SOD1G93A transgenen Maus overexpresses ubiquitär die mutierten antioxidative Enzym Superoxid-Dismutase 1 (SOD1). Abbildungen 3 und 4 zeigen die dF/dt und tetanische Kraftwerte für den Soleus-sciatic Nerv (links) und für die Vorbereitung der Membran-Phrenicus Nerv (rechts). Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit der Technik hier vorgeschlagen, die funktionale Mängel in transgenen Muskeln zu erkennen, die im Gegensatz zu denen eng mit den Muskel selbst NMJ verwandt sind. In der Tat angezeigt SOD1G93A Soleus Muskeln für dF/dt und tetanische Kraft, eine reduzierte kontraktile Antwort, im Vergleich mit Kontrolle Muskel, wenn direkt stimuliert, und eine weitere Reduktion, wenn durch den Nerv stimuliert angezeigt. Im Gegensatz dazu wurden leichte Veränderungen in diese beiden Parameter beobachtet, wenn Zwerchfell Muskel Streifen durch die Membran angeregt wurden während wesentliche Veränderungen nachgewiesen wurden, wenn das Zwerchfell durch den Nerv stimuliert wurde.
Abbildung 3 - Kontraktile Kinetik. Bedeuten Sie ± SEM von dF/dt für den Soleus (A) und Zwerchfell (B) Vorbereitungen. Soleus Exemplare eine signifikante Verlangsamung unten angezeigt, wenn direkt stimuliert (-27 %), und einen weiteren Rückgang, wenn durch den Nerv stimuliert (-58 %). Membran Exemplare angezeigt eine Verlangsamung nur, wenn durch den Nerv stimuliert (-30 %). Adaptiert von Rizzuto Et Al. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 - Tetanische Kraft. ± SEM tetanische spezifische Kraft für die Vorbereitungen Soleus (A) und Zwerchfell (B) bedeuten. Soleus Exemplare eine signifikante Verlangsamung unten angezeigt, wenn direkt stimuliert (-26 %), und einen weiteren Rückgang, wenn durch den Nerv stimuliert (-50 %). Membran Exemplare angezeigt eine Abnahme der Kraft nur, wenn durch den Nerv stimuliert (-44 %). Adaptiert von Rizzuto Et Al. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die Auswertung der intratetanic Müdigkeit und Neurotransmission Scheitern erlaubt NMJ spezifische Parameter gemessen werden. Abbildung 5 zeigt die Mittelwerte der intratetanic Müdigkeit (IF) während das tetanische Müdigkeit Paradigma für Soleus Muskeln (Abb. 5A) gemessen und Zwerchfell Streifen (Abb. 5 b). Wie im Abschnitt Protokoll berichtet, wurde die Müdigkeit Paradigma verwendete wir so den NMJ aber betonen nicht den Muskel entwickelt. Als Ergebnis, gemessen IF für die direkte Muskelstimulation nie verändert wurde. In der Tat berechnet die IF für die Nervenstimulation ist der Parameter, der für Vergleiche zwischen verschiedenen Mausstämme berücksichtigt werden müssen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die IF in transgenen Soleus und Zwerchfell Muskeln als in der Kontrolle Gegenstücke deutlich geringer war. Dieser Unterschied war in der Membran, in der ein kleiner Muskel defekt erkannt wurde, größer und kleiner in den Soleus, in dem bedeutende Muskelschäden bereits gemessen hatte. Sie sollten berücksichtigen, dass da der transgenen Soleus Muskel erheblich beschädigt wurde, die NMJ-Bewertung nur für bis zu 8 Minuten der Stimulation, korrekt, die ist dauert es für transgene Muskel war wieder den Nullwert Kraft wenn Sie angeregt werden. Transgene Soleus wenn Werte nach 8 Minuten der Stimulation im Grunde Lärm zum Ausdruck bringen.
Abbildung 5 - Intratetanic Müdigkeit. Intratetanic Ermüdung der Muskulatur Soleus (A) und Zwerchfell (B) angezeigt eine signifikante Abnahme der transgenen NMJ-Funktionalität. Werte sind Mittelwert ± SEM Adapted Rizzuto Et Al. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 zeigt die Neurotransmission Versagen bei der tetanische Frequenz, gemessen in den Soleus (Abb. 6A) und Zwerchfell (Abb. 6 b) Exemplare. Im Einklang mit der IF-Ergebnisse war kein Mangel in Neurotransmission in Musculus soleus erkannt, während die Membran Muskel Exemplare eine deutliche Steigerung in neuromuskulären Müdigkeit angezeigt.
Abbildung 6 -Neurotransmission scheitern. Neurotransmission Scheitern Änderungen in den Soleus Muskeln (A) nicht angezeigt, während eine signifikante Abnahme der NMJ Funktionalität in transgenen hervorgehoben Membran Streifen (B). Werte sind Mittelwert ± SEM Adapted Rizzuto Et Al. 18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das experimentelle Protokoll beschriebenen bietet eine ideale Möglichkeit Mess-und diskriminieren funktionellen Veränderungen, die direkt in den Muskel oder eingetreten, indirekt auf die neuromuskuläre Synapse-Ebene. Da diese Technik auf eine indirekte Messung der NMJ Funktionalität basiert, kann es verwendet werden, um festzustellen, ob Mängel zu morphologischen Veränderungen oder biochemische Veränderungen zusammenhängt. Im Gegensatz dazu bietet es ein wirksames Mittel zur Feststellung, ob keine morphologische und biochemische Veränderungen Neurotransmission Signalisierung Funktionalität reduziert haben. Jedoch nachdem Kraftmessungen abgeschlossen sind, kann der Muskel werden aus dem Bad entfernt, ausgelöscht, angeheftet auf optimale Länge, umgeben von einbetten Verbindung, und schnell in schmelzen Isopentane eingefroren. Muskeln können bei-80 ° C für die anschließende Auswertung, wie z. B. für immunhistochemische und morphologische Analyse gespeichert werden.
Die Technik, die wir hier vorschlagen basiert auf einer experimentellen Testprotokoll, das erstmals die Messung verschiedener Parameter charakterisieren NMJ und Muskel-Funktionalität kombiniert. Drei wesentliche Punkte sicherstellen, dass diese Technik zuverlässige Ergebnisse liefert.
Zunächst zwar Skelettmuskulatur Exzision nun eine relativ häufige Technik, muss extra darauf geachtet werden, bei der Durchführung des chirurgischen Verfahrens um die Nerven mit den Muskeln intakt zu halten. Der Betreiber in der Lage muss somit auf Kontroll-Mäusen getestet werden, bevor andere experimentelle Modell versucht wird. Im Kontroll-Mäusen sollen die Muskel kontraktilen Antworten auf direkte und indirekte Stimulationen, wodurch eine Kontrolle des Betreibers chirurgische Fähigkeit übereinstimmen.
Ein weiterer entscheidender Punkt ist die Notwendigkeit, sicherzustellen, dass direkte Impulse den Muskel nicht durch anregende intramuskulären Äste des Nervus aktivieren und die Impulse des Nervs angewendet auf artifizielle Weise durch die Verbreitung von aktuellen in der Badewanne nicht den Muskel aktivieren. Der erste Punkt kann getestet werden, indem Sie einen separaten Satz von Experimenten, in denen der Muskel wird stimuliert, direkt auf der Membran durchführen, sowohl vor als auch nach D-Tubocurarin (25 µM) wurde hinzugefügt, um die physiologischen Bad. Wenn der aktuelle Wert supramaximalen behoben hat, sollte die Muskel-Reaktion nicht durch die Zugabe von D-Tubocurarin verändert werden. Der zweite Punkt bezieht sich auf die Länge des ausgeschnittenen Nerven und ist somit anfälliger für Variation. Der Strom an der Saug-Elektrode muss vor Beginn jeder Prüfung bewertet werden, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben.
Zu guter Letzt da NMJ Funktionalität durch den Vergleich der Muskel-Reaktion auf direkte und indirekte Stimulation bewertet wird, müssen die elektrischen Impulse sehr genau synchronisiert werden. Dieser Punkt ist besonders wichtig für die beiden Müdigkeit Paradigmen am Ende des Protokolls, in dem der Muskel einmal auf der Membran und 14 Mal durch den Nerv stimuliert wird. Da die Stimulierung Phasen und die Ruhezeiten sehr niedrig sind (0,33 s und 0,67 s die Membran), auch eine sehr geringe Verzögerung zu einer unausgewogenen Stimulation eines der beiden Fächer führen würde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Arbeit im Labor der Autoren wurde unterstützt von Fondazione Roma und Telethon (keine zu gewähren. GGP14066).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-Mode Lever System | Aurora Scientific Inc. | 300B | actuator/transducer |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701B | pulse stimulator (nerve) |
| High-Power Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc. | 701C | pulse stimulator (muscle) |
| In vitro Muscle Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 800A | |
| Preparatory tissue bath | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Suction Electrode | A-M Systems | 573000 | with a home-made reference |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 800 | |
| Cold light illuminator | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Acquisition board | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Connector block | National Instruments | NI 2110 | |
| Personal computer | AMD Phenom II x4 970 | Processor 3.50 Ghz with Windows 7 | |
| LabView 2012 software | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | physiological buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Calcium chloride CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhydrous, powder, ≥97% |
| Buffer HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
| Dishes 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polystyrene |
| Silicone | Sylgard | 184 Silicone | Elastomer Kit 0.5Kg. |
| Thermostat | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pump | Newa Mini | MN 606 | for aquarium |
| Heat resistance Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Bucket | any 10 liters | Polypropylene | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mix gas | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 items |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tools | 15024-10 | nerve excision |
| Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | muscle removal |
| Delicate Scissors | Wagner | 02.06.32 | external of the animal |
| Student Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| nylon wire Ø0.16 mm | any |
References
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