Summary
De primaire cilium fundamenteel belang neurale proliferatie, neuronale differentiatie en volwassen neuronale functie. Hier beschrijven we een werkwijze voor ciliogenese en het transport van signalerende eiwitten trilharen neurale stam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen in het primaire neurosfeerculturen bestuderen.
Introduction
De primaire cilium is een microtubulus gebaseerde dynamische subcellulair compartiment dat functioneert als een zintuiglijke antenne coördinatie cellulaire signaalroutes, zoals de Sonic-hedgehog (Shh) route tijdens de embryonale neuronale ontwikkeling 1, 2 en gecompartimenteerde subcellulaire signalering bij volwassen neuronale functie 3, 4 . Signaleringscomponenten van deze routes, zoals Shh receptor Patched 5; het pad activator Smoothened (Smo) 6; en Gpr161 7, wees G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) die negatief reguleert de Shh route, lokaliseren op cilia op een dynamische wijze. Meerdere GPCRs zijn gerapporteerd te lokaliseren aan de cilia van neuronen in de hersenen 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defecten in cilia en trilharen gegenereerde signaalroutes beïnvloeden meerdere weefsels en zijn gezamenlijk bekend als ciliopathieën 17, 18, 19. De ciliopathie ziektespectrum omvat vaak neurologische afwijkingen zoals craniofaciale abnormaliteiten 20, 21, 22. Daarnaast kunnen primaire cilia in neuronen van de hypothalamus regelen centrale verzadiging paden en defecten leiden centrale obesitas 23, mirroring obesitas bij syndromale ciliopathieën zoals Bardet Biedel syndroom 24. Bovendien, neuropeptide receptor signalering bij cilia regelt central verzadiging trajecten 11, 14. Ciliaire lokalisatie van adenylylcyclase III (ACIII) en GPCR's zoals somatostatine receptor 3 in hippocampale neuronen leiden tot nieuwe defecten objectherkenning en geheugenstoornissen 25, 26 en parallel met een gebrek aan integriteit ciliaire 27. De ontwikkelingsdoelen aspecten van trilharen-gegenereerde signalering zijn nauw verbonden met weefsel homeostase; met name cilia zijn belangrijk voor de voortgang van Shh-subtype medulloblastomas gevolg van granule voorlopers in het cerebellum 28, 29. Zo primaire cilia een belangrijke rol spelen tijdens de embryonale, postnatale en volwassen neuronale ontwikkeling en functie.
Neurale stamcellen (NSC's) zijn gehuisvest in de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel, de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus, enventriculaire zone van het derde ventrikel in de hypothalamus bij zoogdieren 30, 31, 32. NSCs zijn multipotente, bezitten het vermogen tot zelf-vernieuwing, en zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen en regeneratieve geneeskunde 30. De meeste NSC in de SVZ zijn rust en beschikken over een eenzame primaire cilium dat, in veel gevallen, strekt zich uit naar de laterale ventrikel 33. De primaire cilium signalen via de lokalisatie van de verschillende receptoren induceren stroomafwaartse cellulaire reacties, met name met betrekking tot Shh, TGFp en receptor tyrosine kinase pathways 2, 34, 35, 36. Aangezien primaire cilia uitstrekken in de laterale ventrikel, wordt verondersteld dat primaire cilia cytokines gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof (CSF) om NSC's 37 activeren 38, 39, 40, 41. Echter, de mechanismen die CSF communiceert met NSC en of primaire cilia zijn betrokken zijn niet bekend. Hechtende NSCs in cultuur worden trilharen; lokaliseren Shh pathway componenten zoals Smo en Gpr161 in trilharen; en zijn Shh responsief 42. Aldus kan NSC dienen als een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen Shh route, ciliaire handel en neuronale differentiatie paden. Bovendien kunnen neuronen opzichte van NSC ook voor ciliaire handel assays.
Neurospheres zijn samengesteld uit clusters van vrij zwevende cellen die voortvloeien uit de proliferatie van neural stam / progenitorcellen die groeien in de aanwezigheid van specifieke groeifactoren en klevende oppervlakken 43, 44. Neurosferen zijn belangrijke in vitro cultuurmodellen neurale stam / progenitorcellen in de normale ontwikkeling en ziekte 31, 45, 46, 47 bestuderen. We beschrijven hier een neurosfeer gebaseerde test voor het kweken van neurale stam / progenitorcellen en differentiatie tot neuronen / glia. Wij benadrukken het bijzonder het transport van signaleringscomponenten op cilia van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen (Figuur 1). In tegenstelling tot het kweken van primaire neuronen, primaire neurosferen zijn relatief gemakkelijk te kweken, zijn ontvankelijk voor meervoudige passages en vries-dooicycli en kunnen differentiëren tot neuronen / glia. Belangrijker, we vastgesteld dat neurosfeer afgeleide neuralestam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen zijn trilharen in kweek en te lokaliseren signalerende moleculen trilhaarfunctie in deze compartimenten relevant. Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden kan dienen als een ideaal model voor het bestuderen ciliogenese en trilharen handel in NSCs en gedifferentieerde neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van Neurosferen van de volwassen muis Brain
- Euthanaseren een volwassen muis (ongeveer 2 maanden oud) door een overdosis van isofluraan. Double-check dat de muis ademhaling is gestopt en ontleden onmiddellijk na de dood.
- Met een schaar, maak een middellijn incisie aan de schedel te openen. Verwijder de hersenen.
- Plaats de hersenen in koude PBS in een 10 cm schotel op ijs. Volg de hele-mount versnijdingsmethode de SVZ van het laterale ventrikel 48 te verkrijgen.
- Plaats de laterale ventrikel in een 1,5 ml buis, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
- Na 15 minuten, voeg 500 ul stoppen medium en voorzichtig pipetteren 20-30 keer met 1 ml tip. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het pipetteren.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de overleving van de cel. - Draai de cellen bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PBS en resuspendeer tHij cellen door voorzichtig pipetteren met een 5x 1 ml tip.
- Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium.
- (Optioneel) Als celresten worden opgemerkt, laat de cellen door een 70 urn cel zeef.
- Tel het aantal cellen met een hemocytometer; in het algemeen, ongeveer 30.000 - 60.000 cellen / SVZ verkregen.
- Plaat de cellen van de ene SVZ in een 10 cm schaal met 10 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2.
- (Optioneel) fusie tussen gebieden 49 te vermijden, zet 1.000 cellen in één putje van een ultralage binding 6-wells plaat die is voorgevuld met 1,5 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2.
OPMERKING: Na het 5-7 dagen, neurospheres kan worden waargenomen (Figuur 2A). De kweekperiode kan verschillen met de leeftijd van de muis of de genetische achtergrond. - Voeg 2 ml van NSC medium elke 3-4 dagen om de cultuur te behouden(Niet bij de reguliere medium te verwijderen).
2. Analyse van het differentiatievermogen neurosferen en ciliogenese Tests
- Om de differentiatie capaciteit te analyseren, het analyseren van de neurospheres onder klevende omstandigheden in differentiatie medium.
- Steriliseren 12 mm rond dekglaasjes autoclaaf of met UV-blootstelling voor gebruik. Voor een hechtende celkweek, zet een gesteriliseerde 12 mm rond dekglaasje in een putje van een plaat met 24 putjes onder steriele omstandigheden.
- Bekleden van het dekglas gedurende 10 s met 500 ui 0,002% poly-L-lysine (PLL). Aspireren de oplossing en drogen gedurende 10-15 minuten.
- Voeg 500 ul van laminine-oplossing (5 ug / ul). Incubeer de dekglas gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Zuig het laminine en voeg 500 ul van differentiatiemedium of NSC medium (ongedifferentieerde controle).
- Voor de differentiatie assay, pak een 100-200 urn bol met een 200 pi tip onder de microscoop. Toevoegen5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 7-10 dagen in differentiatie medium.
- Om ongedifferentieerde neurospheres analyseren, voeg 5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 1-2 dagen in NSC medium. Bevestigd neurosferen verspreiden en groeien als een monolaag (figuur 2B).
- Na zorgvuldige verwijdering van het medium, bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en daarna wassen met PBS tweemaal gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De plaat kan 1-2 maanden worden bewaard bij 4 ° C.
Opmerking: Om neurale stam / progenitorcellen in NSC medium en gedifferentieerde cellen in differentiatiemedium visualiseren Voer immunokleuring tegen Nestin (neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker), β-tubuline III (TUJ1 monoklonaal neuronale merker), GFAP (glia fibrillair zuur eiwit , astrocyt marker) en O4 (oligodendrocyt marker) (Figuur 2B-E). Om de trilharen te analyseren, uitvoeren van immunokleuring tegen Arl13b (primair cilia marker) en Gpr161 (ciliaire GPCR) (figuur 3). - Monteer het dekglaasje met montage oplossing op een glasplaatje. Kantel het objectglaasje om overmaat oplossing te verwijderen.
3. Analyse van ciliogenese in Neurosferen
- Aan cellen in intacte neurosferen geanalyseerd door immunokleuring breng 1 ml kweekmedium bevattende meervoudige neurosferen een 1,5 ml buis en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten. Bevestig de bolletjes met 4% (PFA) na verwijdering van het medium gedurende 15 minuten en wassen met PBS. Spin down bollen bij 500 xg gedurende 8 minuten, verwijder supernatant en incubeer de sferen O / N met 30% sucrose bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 500 ul van oktober oplossing wordt een ondergrens 1 ml tip. Snijd de rand van het uiteinde van de opening groter naarmate oktober viskeus.
- Breng de oktober oplossing die de neurosferen in een wegwerp plastic bevriezing vorm (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Bevries de moud op droog ijs gedurende ten minste 15 min.
- (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de schimmel in een -80 ° C vriezer gedurende 1 jaar.
- Snijd de secties met een cryostaat; de dikte van gedeelten moeten 15-30 urn.
- De primaire cilia in een neurosfeer visualiseren voeren immunokleuring tegen Arl13b (figuur 4).
4. Cultuur en Passage van Neurosferen en Adherent NSC
- Passage de neurospheres terwijl de bol grootte is tussen 100-200 urn; wanneer de neurospheres zijn te groot (300 micrometer of hoger), ze zijn niet ideaal voor experimenten.
- Breng de neurosferen in een 50 ml buis met een 1 ml tip en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten.
- Verwijder het supernatant met behulp van een zuigpomp, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De hoeveelheid trypsine afhankelijk van het aantal sferen.
- Voeg 500 ul serum medium en voorzichtig pipet 20 maal met 1 ml tip.
- Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium.
- (Optioneel) Als celafval of gedissocieerde neurosferen worden gezien, laat de cellen door een 70 urn cel zeef.
- Passage van de cellen in een schaal van 10 cm bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm2 in NSC medium; de cellen klaar voor de volgende passage na een week zijn.
- (Optioneel) cellen in te vriezen, voeg invriesmiddel 500.000 tot 1.000.000 cellen / ml suspensie te genereren. Bevries de cellen met behulp van cryo invriezen containers; gedissocieerde neurosferen kunnen ook worden bevroren.
- De hechtende kweek, dillute de cellen 50.000 cellen / cm2 op PLL en laminine beklede dekglaasjes met NSC medium en kweek gedurende 1-2 dagen.
5. Honger en analyse van Cilia
- Bereid uitputtingsmedium (tabel 1).
- 1-2 dagen na de eerste plating hechtende cellen na dissociatie, wijziging NSC medium in een putje (controle) en uitputtingsmedium in een andere put (experiment).
- Kweek de hechtende cellen gedurende 24 uur.
- Fixeer de cellen met 4% PFA in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal wassen met PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
- (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de 24-wells platen met dekglaasjes in PBS bij 4 ° C gedurende 1-2 maanden.
- Uitvoeren van een protocol voor immunofluorescentie kleuring 7, 50.
- Monteer de dekglaasjes u aan een montage-oplossing. Droog het objectglaasje O / N bij kamertemperatuur in het donker.
- Acquire beelden op een samengestelde microscoop op de noodzakelijke vergroting. Gebruik een microscoop, een camera, en doelstellingen (40X / 1.3 olie- en 63x / 1,4 olie), geregeld met behulp van de meegeleverde software. Neem voldoende z-secties 0.5-0.8 urn intervallen (Figuur 5).
- Voor de kwantitatieve analyse van trilharen lokalisatie inhechtende cellen verwerven stapels beelden 3-8 opeenvolgende velden met confluente cellen door te kijken naar de DAPI kanaal. Kwantificeren van het aantal primaire cilia behulp ImageJ / Fiji. Typisch, gebruik dan de "Cell teller" tool in de ImageJ Plugins> Analyse dialoogvenster om de cellen met GPCR-positieve cilia te tellen; maximale projecties van stapels beelden kunnen ook van ImageJ / Fiji.Use gelijke beeldintensiteit en contrast parameters worden uitgevoerd voor alle beelden van hetzelfde experiment voor het tellen en export doeleinden.
6. Transfectie van Neurosferen
- Hechten gedissocieerde cellen dekglaasjes gedurende 24 uur. Gebruik een celdichtheid typisch tussen 75.000 en 150.000 cellen in 500 pl medium NSC in een enkel putje van een plaat met 24 putjes.
- Meng 25 pl verlaagde serum medium en 1,5 pl transfectiereagens in een 0,5 ml microbuisjes door wervelen gedurende 5 s.
- Voeg 2,5 ug endotoxine-vrij plasmide DNA aan een afzonderlijke 0,5 ml microtube bevattende 25 pl verminderde serum media en meng door vortexen gedurende 5 s.
- Voeg 1 ul van transfectiereagens tot de tweede microbuis die DNA en mengen door vortexen gedurende 5 s.
- Voeg het mengsel van het DNA-bevattende buis naar de eerste microbuisjes en meng door pipetteren.
- Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie voorzichtig het transfectiemengsel druppelsgewijs toevoegen putjes bovenop de NSC medium (500 pl / putje).
- Verander het medium 24 h na transfectie met medium (NSC gemiddeld) of uitputtingsmedium (500 ul / putje) besturen.
- Fixeer de cellen door het veranderen van het medium tot 4% PFA na 24 uur en immunokleuring voeren; kenmerkend tot 10% transfectie efficiëntie verkregen met dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na plating van de cellen van de SVZ in NSC medium voor een week, dreven neurosferen waargenomen (Figuur 2A). De afmetingen van de bolletjes varieerde tussen 50 en 200 urn. Te onderzoeken of de bolletjes werden afgeleid van neurale stam / progenitorcellen werden de neurosferen uitgeplaat op PLL en laminine beklede dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen. Zij werden vervolgens immunostained tegen de neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker, Nestin. Twee dagen waren nodig om de bollen te hechten aan de dekglaasjes en te groeien als een monolaag van cellen. De monolaag van cellen was positief voor Nestin (Figuur 2B). Het differentiatievermogen van de neurosferen onderzoeken wij ze uitgeplaat volgende stappen in sectie 2 op PLL en laminine beklede dekglaasjes bij differentiatie medium zonder dissociatie gedurende 7-10 dagen. Het duurt minstens een week voor differentiatie. De neurosferen aan de dekglaasjes en vergrotened om te groeien als een monolaag van cellen. We vast de cellen en immunostained tegen neuron, astrocyten, en oligodendrocytenmarkers. Wij namen hechtende neurosferen die gedifferentieerd in β-tubuline III-positieve neuronen, GFAP-positieve astrocyten en oligodendrocyten O4-positieve (Figuur 2C-E). Zo kan multipotente neurospheres worden afgeleid uit volwassen muis SVZ.
Om te bepalen of hechtende neurosferen en gedifferentieerde neuronen primaire cilia, we immunostained tegen Arl13b (primaire cilium marker) 51 en Gpr161 (-ciliaire gelokaliseerd GPCR) 7. In onze ervaring, in de beschikbare muismodellen uitdrukken ARL13B-mCherry, en in studies met het ontwikkelen van de muis cortex, de meeste (zo niet alle) neuronale trilharen in de hersenen uiten Arl13b, terwijl alle neuronen niet ACIII-positief 52, 53, 54. Dons, we voornamelijk gebaseerd op Arl13b neuronale cilia te detecteren. Detecteerden we primaire cilia en de lokalisatie van Gpr161 de cilia van progenitorcellen in neurosferen gehecht (figuur 3A) en in gedifferentieerde neuronen (Figuur 3B). Zo aanhanger neurospheres en gedifferentieerde lijnen zijn trilharen in cultuur en lokaliseren signaalmoleculen.
Om te bepalen of drijvende neurosferen zijn primair cilia, we cryosectioned drijven neurosferen na fixatie, zoals uiteengezet in sectie 3. We waargenomen primaire cilia in neurale stamcellen / voorlopercellen in het gesegmenteerde neurosferen (Figuur 4A-B). Het is belangrijk om z-profielen te verkrijgen over de neurosferen volledig zichtbaar primaire cilia, omdat het moeilijk is de primaire cilia in een z-vlak te onderzoeken. Kortom, ongedifferentieerde neurospheres hebben heterogene populaties van trilharen en niet-haarcellen.
(Figuur 5A-B). Bovendien merkten we een verhoogd aantal Gpr161-positieve cilia na verhongering (% Gpr161-positieve cilia / Arl13b-positieve cilia) (Figuur 5A-B). Interessant is dat een eerdere studie met behulp ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellijnen aangetoond dat humane embryonale stamcellen in kweek bezitten ook primaire cilia 55. Het aantal en de lengte van cilia toename na serumuithongering in deze cellijnen en deze trilharen ook over onderdelen van de machine Shh.
We getransfecteerde ook aanhangend neurale stamcellen / progenitor cellen, zoals beschreven in paragraaf 6. We meestal gedetecteerd een transfectie-efficiëntie tot 10%, vergelijkbaar met primaire neuronkweken in het lab (figuur 6).
| Oplossing | bestanddeel |
| 1x PBS | Verdun 10x PBS met geautoclaveerd water |
| NSC medium | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-glutamine | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-basic (humaan bFGF) (voorraadoplossing 25 ng / ml in Neurobasal medium): 20 ng / ml of 2 mg totaal voor 100 ml medium | |
| EGF (voorraadoplossing 25 ng / ml in Neurobasal medium): 20 ng / ml of 2 mg totaal voor 100 ml medium | |
| 95 ml basismedium | |
| Menselijke FGF-basic (humaan bFGF) | 1 ml basismedium commerciële humaan bFGF 25 ug fles |
| Bewaren in steriele microbuisjes van -20 ° C of lager. Met een 80 pi aliquot of 2 ug / 100 ml NSC media. | |
| EGF | Voeg 8 ml basaal medium aan commerciële EGF 20 ug fles |
| Opslaan steriele microbuisjes bij -20 ° C of lager. Gebruik één portie 80 ug / 100 ml medium. | |
| Stoppen medium | 1 ml FBS |
| 75 U DNase I (75 U / ul in PBS) | |
| 9 ml PBS | |
| serum medium | 1 ml FBS |
| 9 ml basismedium | |
| Invriezen medium | 4 ml DMSO |
| 24 ml basismedium | |
| 12 ml 30% FBS | |
| differentiatie medium | 90 ml basismedium |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamine | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-basic (humaan bFGF) (voorraad oplossing van 25 ng / ml in Neurobasal medium): 10 ng / ml of 1 mg totaal van 100 mL | |
| uithongering medium | 95 ml basismedium |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamine | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabel 1: Recept van de Solutions.
ve_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figuur 1: Schematische weergave van neurosfeercultuur en differentiatie protocollen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Neurosferen Exhibit differentiatievermogen. (A) Representatieve neurospheres getoond. (B) Neurosferen werden uitgeplaat op PLL en laminine beklede dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen en werd immunologisch gekleurd met Nestin (neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker). (CE) Neurosferen werden uitgeplaat na de stappen in hoofdstuk 2 op PLL en laminine beklede dekglaasjes bij differentiatie medium gedurende 7 dagen without dissociatie; vastgesteld; en immunologisch gekleurd met β-tubuline III (neuronale merker), GFAP (astrocyten marker) en O4 (oligodendrocyt marker). De kernen werden gekleurd met DAPI. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Neurosferen en neuronen In Hechtende gedifferentieerde Neurosferen zijn Trilhaaromvattende. (A) gedissocieerde neurosferen werden uitgeplaat op gecoate dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen; vastgesteld; en immunostained tegen Gpr161 (groen), Arl13b (rood), en DNA (blauw). (B) gedifferentieerde neuronen werden immunologisch gekleurd met Gpr161 (groen), Arl13b (rood, A) of β-tubuline III (rood, B) en DNA (blauw). Witte pijlen geven Gpr161 lokalisatie in trilharen.Rechts panelen (A) zijn vergrote aanzichten van de primaire cilium aangegeven met de witte pijl. De Gpr161-positieve trilharen in de witte doos neuron wordt getoond aan de rechterkant van (B). Schaal = 10 urn (A); 50 urn (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: drijven, ongedifferentieerd Neurosferen Bezitten haarcellen. Zwevende neurosferen werden gefixeerd, ingebed in OCT, cryosectioned en verwerkt voor immunofluorescentie tegen Arl13b (rood) en DNA. Arl13b-positieve primaire cilia in een neurosfeer getoond. Het paneel (A) is een maximum-intensiteitsprojectie 14 z-secties 0,8 urn intervallen van een neurosfeer. De panelen (B) tonen de vergrote weergave van ciliated cellen in de witte doos gebied (A). Het beeld maximale projectie van alle z-profielen getoond als stapel, terwijl nummers 1-14 geven afzonderlijke z-profielen. De witte pijlen geven primaire cilia. Schaalstaaf = 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: uithongering induceert ciliogenese in gedissocieerde adherente neurale stam / progenitorcellen. (A) gedissocieerde cellen werden uitgeplaat op gecoate dekglaasjes in NSC medium of uitputtingsmedium gedurende 24 uur; vastgesteld; en immunostained tegen Gpr161 (groen), Arl13b (rood), en DNA (blauw). Gpr161-positieve cilia waargenomen in controle (links) en uitgehongerde (rechts) cellen. De onderste panelen zijn vergrote aanzichten van de aangegeven witte dozen in de betreffendebovenste panelen. De witte pijlen en pijlpunten geven Gpr161-positieve en -negatieve trilharen, respectievelijk. Schaal bar = 100 urn. (B) Kwantificering van Arl13b-positieve haarcellen (linker grafiek) en Gpr161 lokaliseren in Arl13b-positieve cilia (rechter grafiek) controle en uitgehongerde cellen. De percentages van zowel Arl13b-positieve haarcellen en Gpr161 lokaliseren in Arl13b-positieve cilia verhoogd na verhongering. De kwantificering werd uitgevoerd vanaf twee gezichtsvelden elk uit twee technische replica van een enkel experiment. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van alle 4 gezichtsvelden ± de standaarddeviatie. *, P <0,05; **, P <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Transfectie inGedissocieerde adherente neurale stam / progenitorcellen. Gedissocieerde cellen uitgeplaat op gecoate dekglaasjes werden met een LAP-TULP3 N-terminus (aa 1-183) mut12 construct dat niet bindt aan de kern IFT-A complex 56. Het medium werd veranderd in uitputtingsmedium 24 uur na transfectie. De cellen werden gefixeerd na 24 uur en immunologisch gekleurd met GFP (groen), Gpr161 (rood), Arl13b (magenta) en DNA (blauw). Een getransfecteerde cel met Gpr161- en Arl13b-positieve cilium wordt gemarkeerd met een witte pijl, terwijl een getransfecteerde cel zonder trilharen is getoond met een witte pijl. Gele pijlen en pijlpunten wijzen naar ongetransfecteerde cellen met of zonder Gpr161 / Arl13b resp. Schaalstaaf = 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een methode om te genereren en te onderhouden neurosphere culturen uit volwassen muis SVZ. Enkele relevant ten aanzien van de culturen zijn als volgt. Ten eerste, de afmetingen van de bolletjes zijn typisch tussen 50-200 urn. In onze ervaring, wanneer een neurosphere groter wordt dan 300 micrometer in diameter, is de optimale tijd voor passage gemist. Deze grotere bolletjes bevatten dode cellen in de kern. Ten tweede, als neurosferen algemeen worden gebruikt voor neurale stamcellen / voorlopercellen cellen te bestuderen, is het belangrijk om EGF en FGF-basic (bFGF) om deze stemness van deze cellen te handhaven. Daarom factoren die differentiatie induceren, zoals FBS, moet bij het onderhoud van de neurosferen vermeden. Er is aangetoond dat 10% FBS neurosferen in astrocyten 47 kan onderscheiden. Ten derde, kan de mate van neuronale differentiatie afhankelijk van de leeftijd van de muis. Als nog een neuronale differentiatie van neurosferen, jongere muizen verlangens (postnatale day 0) worden gebruikt. Ten vierde, als het starten van nieuwe culturen, het is altijd goed om de differentiatie capaciteit van de neurosferen te onderzoeken. Ten vijfde, onze methode maakt het ook invriezen en ontdooien van gevestigde neurosphere culturen voor toekomstig experimenteel gebruik. Na ontdooien cellen gewoonlijk groeien als hechtende spoelvormige cellen zonder poly-L-lysine of laminine. Dit kan worden veroorzaakt door vries-dooi schade aan de cellen. Het is belangrijk om de cellen te groeien totdat ze 60 te houden - 80% confluent vóór passage. Na de passage cellen groeien typisch als neurosferen en kunnen in het algemeen worden doorgekweekt tot 5-10 maal.
Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden ons toelaten om ciliaire mensenhandel en signaalwegen in neurale stamcellen / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen te bestuderen. We onderzochten primaire cilia in drijvende / aanhanger en gedifferentieerde neurospheres. Het is belangrijk om een aantal z-profielen verwerven cilia visualiseren gedurende de volledige omvang van de neurosferen. Bovendien aftER genereren hechtende kweken van die neurosferen en uithongeren 24 uur de meeste cellen trilharen (figuur 5) en verrijkt in de GPCR zonder bekende ligand, Gpr161. Langdurige verhongering van de hechtende kweken resulteert in vacuolaire subcellulaire structuren. Derhalve is het belangrijk om honger perioden voor bepaalde experimentele doeleinden zorgvuldig te optimaliseren.
Momenteel, studies over ciliogenese worden voornamelijk uitgevoerd in enkele ciliated geïmmortaliseerde cellijnen 57. Deze cellijnen niet altijd trouw herhalen neuronen en neurale stamcellen / voorlopercellen in het uiten van signalering componenten, zoals GPCR's of Shh pad machines, waardoor het noodzakelijk om nieuwere methoden om de rol van de trilharen in biologische processen te bestuderen ontwikkelen. De neurosfeer gebaseerde methoden hier beschreven ons toelaten om trilharen-gereguleerde cellulaire routes, waaronder GPCR en Shh signalering in het kader van neurale stamcellen / voorlopercellen en diff bestuderenerentiated neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
