Summary
وكثيرا ما تستخدم أشعة الليزر في دراسات الاستجابة الخلوية للتلف الحمض النووي. ومع ذلك، فإنها تولد الآفات التي تباعد، والتردد، والتصادم مع تكرار الشوك نادرا ما تتسم. هنا، نحن تصف النهج الذي تمكن من تحديد هذه المعايير مع الليزر المترجمة crosslinks interstrand.
Abstract
الاستجابة DNA الأضرار (DDR) تميزت على نطاق واسع في دراسات فواصل حبلا مزدوجة (DSBs) الناجمة عن الليزر الجزئي شعاع الإشعاع في الخلايا الحية. وDDR إلى الحلزون تشويه التعديلات DNA التساهمية، بما في ذلك crosslinks DNA interstrand (ICLS)، لم يتم تعريف أيضا. لقد درسنا DDR يحفزه ICLS، مترجمة من قبل تنشيط ضوئي ليزر psoralens immunotagged، في نوى الخلايا الحية. من أجل معالجة المسائل الأساسية حول توزيع ناتج إضافة واللقاءات تكرار مفترق الطرق، ونحن الجمع بين التعريب الليزر مع اثنين من التقنيات الأخرى. وغالبا ما تستخدم الألياف DNA لعرض التقدم من تكرار الشوك المناعي من نظائرها نيكليوزيد أدرجت خلال نبضات قصيرة. وقد استخدمت على نطاق واسع النقاط Immunoquantum للتصوير جزيء واحد. في النهج الجديد، وتنتشر الألياف DNA من خلايا تحمل ICLS الليزر المحلية على الشرائح المجهر. يتم عرض ICLS الموسومة مع نقاط immunoquantum والعشرينالبريد المسافات بين الآفة تحدد. اصطدام شوكة النسخ المتماثل مع ICLS يمكن تصور وتحديد أنماط مختلفة لقاء وquantitated.
Introduction
الحمض النووي هو تتعرض لهجوم مستمر من وكلاء خارجي مثل الإشعاع، والأشعة فوق البنفسجية، والسموم البيئية، ونواتج الاحتراق، الخ بالإضافة إلى ذلك، تعرضت لهجوم من قبل أيضا الأنواع المتطرفة الذاتية التي تنتجها عملية الأيض التأكسدي. كل هذه لديها القدرة على تعطيل كيميائيا أو فيزيائيا على سلامة DNA 1. الاضطرابات في الجينوم يمكن تنشيط الاستجابة DNA الأضرار (DDR)، والتوظيف وآخر متعدية سلسلة تعديل مع مئات، إن لم يكن الآلاف، من البروتينات وmicroRNAs المشاركة في إصلاح الآفة، وتنظيم دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، الشيخوخة، ومسارات للالتهابات 2.
معظم المعلومات التي لدينا حول DDR يأتي من الدراسات مع DSBs. هذا هو في جزء كبير نظرا لتوافر تكنولوجيات لإدخال فواصل، بما في ذلك فواصل محددة تسلسل، في الحمض النووي الجيني في الخلايا الحية 3. بالإضافة إلى ذلك، propensitذ فواصل للحث على بؤر البروتينات DDR، والتي يمكن أن يتحلى بها المناعي، كانت مفيدة جدا لتحديد حركية ومتطلبات البروتينات الاستجابة. وقدم واحدة من التكنولوجيات الرئيسية لدراسة DDR التي كتبها بونر والزملاء، الذين استخدموا شعاع ليزر لتوجيه شريط من DSBs في "منطقة الاهتمام" (ROI) في نوى الخلايا الحية 4. في الواقع، وأنشأوا التركيز مطول التي يمكن من خلالها تحديد البروتينات من DDR المناعي. وقد تجلى ذلك من خلال مظاهرتهم من شريط قوي من H2AX هيستون فسفرته (γ-H2AX) في الخلايا الليزر عرضة للخطر. منذ ذلك الحين، تم توظيف النهج الليزر في العديد من الدراسات من DDR الناجمة عن DSBs. وعلى الرغم من قوة وشعبية، ومصدر الصور المناعي مثيرة، وتجدر الإشارة إلى أنه في معظم التجارب يتم ضبط كثافة الليزر وذلك لتحقيق نتائج ملحوظة، من دون قلق للهوية الآفة،الكثافة، أو تباعد. في الواقع، يمكن أن يكون من الصعب وضع هذه التقديرات. وبالتالي فإنها يتم تجاهل إلى حد كبير، على الرغم من تعدد الإصابات التي أدخلت الحمض النووي عن طريق الليزر 5. هذا يساهم في العديد من التناقضات في الأدب 6.
وعلى النقيض من DSBs، معظم التعديلات الكيميائية من DNA لا تحفز تشكيل بؤر منفصلة من البروتينات DDR. وهذا أمر مهم في ضوء فهمنا الحالي للترددات الآفة. وتشير التقديرات إلى أن خلايا الإنسان في الثقافة تتحمل ما يصل الى 50 DSBs في دورة الخلية، شكلت إلى حد كبير خلال المرحلة S 7 و 8 و 9. وتشكل أقل في الخلايا غير المتكاثرة. وهذا يتناقض مع عدد من الخسائر nucleobase أو الأحداث التعديل، والتي هي في عشرات الآلاف في كل خلية / يوم 1 و 10. وهكذا، ونحن نعرف أكثر عنوDDR الناجمة عن الأحداث التي هي نادرة نسبيا، وأقل بكثير عن تلك الناجمة عن الحلزون تشويه الآفات، والتي في مجموعها هي أكثر شيوعا بكثير.
ومن أجل التصدي لأسئلة حول الاستجابة الخلوية لالتساهمية التعديلات من الحمض النووي الجيني، أردنا أن نعمل مع الحلزون تشويه ناتج إضافة DNA الذي كان ملازم النشاط DDR الاستقراء. وعلاوة على ذلك، لتسهيل التصميم التجريبي والتفسير نحن مهتمون في هيكل التي يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق الوقت، وكانت قابلة للتصور المقدمة. وفقا لذلك، وضعنا إستراتيجية تعتمد على السورالين. Psoralens تتميز أيضا intercalators DNA متفاعل صالح 5 "TA: AT المواقع. على عكس وكلاء يشابك الأخرى مثل الخردل النيتروجين وميتوميسين C (MMC) أنهم ليسوا الحمض النووي رد الفعل ما لم تتعرض لموجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية (UVA) الضوء. جزيئات مقحم تتفاعل مع قواعد الثايمين على مسارات معاكسة لإنتاج الحلزون تشويه crosslinks interstrand (ICLS) 11. مع السورالين ثلاثي المستخدمة في تجاربنا معظم المنتجات ICLS، يتم إنشاء عدد قليل monoadducts نسبيا (أقل من 10٪) 12، وcrosslinks intrastrand بين القواعد المجاورة على واحدة حبلا لا تتشكل. لأنهم كتل قوية لتكرار والنسخ، السورالين وغيرها من العوامل يشابك، مثل رابطة الدول المستقلة البلاتين وMMC، وتستخدم عادة في العلاج الكيميائي. وبالتالي تمكين السورالين الدراسات التي أعقبت تفعيل DDR من قبل الحلزون تشويه هيكل، وقدم أيضا نظرة ثاقبة على الاستجابة الخلوية للمجمع مع أهمية سريرية.
نحن توليفها كاشف الذي ارتبط السورالين ثلاثي لdigoxigenin (حفر)، وستيرول النبات لا توجد في خلايا الثدييات، وكثيرا ما تستخدم باعتبارها immunotag. شرط لتنشيط ضوئي يسمح التعريب بواسطة ضوء الليزر (365 نانومتر) من ICLS السورالين في العائد على الاستثمار المحددة في نوى في الخلايا الحية. هذه يمكن عرضها من قبل IMMunofluorescence ضد العلامة حفر. إصلاح الحمض النووي والبروتينات DDR ظهرت في خطوط الليزر المترجمة ICLS 13 و 14.
وDDR تفعيلها من خلال كثافة الليزر العالية المستخدمة لإنتاج DSBs يمكن أن يكون راجعا إلى معزولة أو تتجمع الضرر 15 و 16. وبالتالي، فإن أهمية نتائج هذه التجارب لتحدث بشكل طبيعي الآفات والحاضر تركيز على أقل من ذلك بكثير، غير مؤكد. لمعالجة مسائل مماثلة حول تردد ناتج إضافة السورالين والتباعد في الحمض النووي، وإننا قد استفادت من تكنولوجيا الألياف DNA 17 والنقاط immunoquantum. النقاط الكمومية هي أكثر إشراقا بكثير من الأصباغ الفلورية ولا المبيض عن التعرض للضوء. وهكذا في كثير من الأحيان يتم استخدامها للتصوير جزيء واحد 18، وهو التطبيق الذي الأصباغ الفلورية مشرقة بما فيه الكفاية. الألياف DNA الفردية يمكن أن تمتد على زالشرائح معشوقة ويمكن عرضها من قبل المناعي ضد نظائرها نيكليوزيد أدرجت خلال حضانات قبل الخلية الحصاد. كنا نعامل والخلايا مع حفر-السورالين وتعرض عائد الاستثمار لأشعة الليزر الدقيقة. أعدت ألياف من الخلايا وadducts-حفر السورالين الفردية يمكن تصوره مع النقاط immunoquantum. تعريض الخلايا لنيكليوزيد نظائرها لأوقات قصيرة نسبيا (20-60 دقيقة) يسمح عرض مساحات النسخ المتماثل في محيط ICLS الليزر المترجمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حفر-TMP
- مزيج 50 ملغ (0.18 mmoles) من 4'-كلورو-4،5، 8 trimethylpsoralen و 590 ملغ (2.7 mmoles) من 4،7،10-trioxa-1،13-tridecanedi-أمين في الجافة 25 جولة مل قارورة القاع تحت النيتروجين. إضافة 10 مل التولوين والجزر لمدة 12 ساعة. إزالة المذيب في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض.
- تنقية المخلفات التي كتبها flash العمود اللوني على هلام السيليكا. أزل عمود مع الكلوروفورم، والميثانول، وحل 28٪ الأمونيا (9: 1: 0.5). تتبخر المذيب في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض، واستعادة نقية 4 '- [N- (13-أمينو-4،7،10-trioxatrideca)] بروبانول-4،5، 8 trimethylpsoralen باعتباره الأصفر الشاحب لزج السائل.
- خلط 5.5 ملغ (0.012 mmoles) من 4 '- [N- (13-أمينو-4،7،10-trioxatrideca)] بروبانول-4،5، 8 trimethylpsoralen مع 5 ملغ (0.008 mmoles) من digoxigenin استر NHS في جافة قارورة جولة القاع تحت النيتروجين. إضافة 0.5 مل ثنائي ميثيل اللامائية الفورماميد (DMF) لد 3.4 ميكرولتر من ثلاثي ميثيل أمين ويقلب عند 50 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- إزالة المذيب في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض.
- حل هذه البقايا في الحد الأدنى من ثنائي كلورو ميثان. تطبيق الحل في 2 البقع ميكرولتر أفقيا عبر الجزء السفلي من لوحة طبقة رقيقة التحضيرية مع هلام السيليكا كمرحلة ثابتة. تشغيل TLC إعدادي في الكلوروفورم: الميثانول: هيدروكسيد الأمونيوم 28٪ (8: 1: 0.1).
- قناع لوحة باستثناء الحواف العمودية والتعرف على الفرقة من الناتج قصيرة الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية 254 مصباح نانومتر. تتخلص من المنتج من لوحة مع ملعقة وعزل المنتج النقي باستخدام الكلوروفورم: الميثانول: هيدروكسيد الأمونيوم 28٪ (8: 1: 0.1) الخليط.
- إزالة المذيبات في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض. حل الكريات المتبقية في 1 مل من 50٪ ETOH: H 2 O، موزعة إلى 50 مكل في أنابيب 1.5 مل (~ 20 أجزاء مأخوذة) وجافة في المبخر الطرد المركزي حتى يتم تبخر كل مذيب (~ 3 ساعات).
- تنحل كل قسامة في 200 ميكرولتر من 50٪ ETOH: H 2 O والجافة مرة أخرى في المبخر الطرد المركزي. حل كل قسامة مرة أخرى في 200 ميكرولتر من 50٪ ETOH: H 2 O وجافة في الطرد المركزي المبخر وتخزين الكريات في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
- للاستخدام، حل بيليه في 50 ميكرولتر من 50٪ ETOH: H 2 O. إعداد التخفيف 1: 100 من حل حفر-TMP في H 2 O وقياس OD في 250 نانومتر. معامل انقراض حفر-TMP هو 25000. الحل هو مستقر لمدة شهر تقريبا إذا المخزنة في -20 ° C. تحقق من التركيز عن طريق قياس OD في 250 نانومتر قبل كل استعمال.
- حساب تركيز الأسهم: عبس × 100 X10 6/25000 = التركيز (في ميكرومتر). عادة محلول المخزون حوالي 3 ملم. من المهم أن يكون في هذا النطاق من أجل تقليل حجم ETOH تضاف إلى متوسطة.
2. الليزر المترجمة حفر-TMP ICLS
- المؤسسة العامةتوطين الليزر rform مع المجهر متحد البؤر مع ليزر النيتروجين SRS (337 نانومتر) ضخه عبر خلية الصبغة انبعاث خط 365 نانومتر، وإطلاق 3 نانوثانية البقول في 10 هرتز، مع قوة من 0.7 NW.
- جعل علامة عمودية على جانب من الزجاج 35 مم قاع الطبق الثقافة خلية بالقلم العلامات. الصفر تقاطع في وسط الزجاج على سطح الثقافة مع قلم الماس بحيث شريط أسود على جانب الطبق هو في الجزء العلوي من ذراع واحدة من الصليب. يتم وضع علامة على الصليب على سطح النمو من الزجاج بحيث والخلايا ستكون في المستوى البؤري نفسها.
- تعقيم لوحة بعد وضع العلامات مع شطف من 70٪ ETOH. الجاف قبل خلايا الطلاء.
- خلايا لوحة (سلالات مختبر القياسية مثل هيلا أو U2OS) في الصليب ملحوظ أطباق الثقافة قبل يوم أو يومين. خلية يجب تقسيم بنشاط و50-70٪ متكدسة في يوم التجربة. احتضان 24 ساعة مع 1 ميكرومتر 5-كلورو-2-deoxyuridine (CldU) لDNA تسمية موحد.
- إضافةحفر-TMP في 50٪ ETOH: H 2 O إلى مستنبت الخلية إلى تركيز النهائي من 20 ميكرومتر. جلب المتوسط إلى 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة على الخلايا وضعها في حاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة للسماح للحفر-TMP للتوازن.
- في حين أن الخلايا تحتضن، وإقامة س / ص الإحداثيات من مجال الرؤية التي الليزر نشط. اتبع إجراء المعايرة الشركة المصنعة التي يتم توجيه الليزر من قبل البرنامج لحفر شريحة زجاجية معكوسة على طول خط أفقي وقطري. السطرين تحدد حدود المجال الذي الليزر يمكن أن يضرب هدفا.
- وضع لوحة في غرفة البيئية، عند 37 درجة مئوية مع CO تسيطر 2 والرطوبة، على المسرح المجهر والتركيز مع الهدف النفط 60X على تقاطع الصليب.
- توجيه شعاع ليزر 365 نانومتر إلى العائد على الاستثمار، التي أنشئت من قبل المحقق مع أداة الشكل في البرنامج، لتشكيل شريط من 3 &# 181؛ MX 0.6 ميكرون. يتم وضع الخطوط العريضة للROI بواسطة المؤشر في نوى الخلايا الموجودة في المنطقة المجاورة مباشرة من تقاطع الصليب. ضبط البؤري ض لاستهداف في منتصف الطريق من خلال الليزر النواة. استخدام الليزر في نطاق 350-370 نانومتر. 405 نانومتر الليزر لا يمكن أن تحدث crosslinks 19.
ملاحظة: نحن في موقع العائد على الاستثمار في المناطق النواة للهيولى خارج نويات، والتي يمكن تمييزها عن جبلة النواة في فرق التدخل النقيض (DIC) التصوير. - تحقق من التركيز والنشاط ليزر عن طريق زيادة الإعداد السلطة إلى مستوى كاف لطمس خلية (لن الخلية تلقي بظلالها ثم تختفي). هذا هو التشخيص مهم لمسار الضوء دون عوائق ليزر من خلال المجهر ومن ثم من خلال ساترة وفي الخلايا.
- خفض وضع السلطة إلى ما يكفي لتفعيل السورالين وDDR ICL التي يسببها (وهذا يجب أن يتم تحديد تجريبيا لكل الليزر / هيئة التصنيع العسكريroscope الجمع). استخدام كثافة الليزر وضع (1.7٪ هنا) لا تفعيل DDR في غياب السورالين (رصدتها تشكيل γ-H2AX).
ملاحظة: هذا هو تقرير مهم وقد تتطلب إعدادات الضبط إذا تم تغيير مصدر الليزر أو مكون في مسار الضوء. اتبع تراكم GFP الموسومة البروتينات إصلاح مثل XPC أو FAN1، وكلاهما يتم تعيينهم بسرعة (بالثواني) إلى المشارب السورالين الليزر، ولكن ليس لعائد الاستثمار تتعرض ليزر وحده. ويبدو أن بعض البروتينات من DDR في غضون ثوان، في حين قد يكون مطلوبا عدة دقائق للآخرين. فمن الضروري لأداء الوقت قرارات بالطبع لكل بروتين من الفائدة. ونلاحظ أيضا أنه في الخلايا التي لم تتعرض ليزر لا توجد خطوط للبروتينات الاستجابة.
- خفض وضع السلطة إلى ما يكفي لتفعيل السورالين وDDR ICL التي يسببها (وهذا يجب أن يتم تحديد تجريبيا لكل الليزر / هيئة التصنيع العسكريroscope الجمع). استخدام كثافة الليزر وضع (1.7٪ هنا) لا تفعيل DDR في غياب السورالين (رصدتها تشكيل γ-H2AX).
- بعد أن تم استهداف جميع الخلايا في حقل التحرك لوحة لحقل جديد، والبقاء على مقربة من تقاطع الصليب.
- في التجارب تهدف إلى determالمعهد الوطني للإحصاء توزيع المسافات بين الآفة تعرض الخلايا إلى الليزر في المجالات 20-25 (4-5 خلايا / حقل) حول التقاطع. من أجل تحليل أنماط النسخ المتماثل في محيط ICLS محلية احتضان الخلايا مع 10 ميكرومتر 5-يودو-2-deoxyuridine (إيدو) بعد إطلاق الليزر.
ملاحظة: الوقت من الحضانة مع إيدو تعسفي إلى حد ما. وقد استخدمنا قصيرة بقدر 20 دقيقة، وطالما 60 دقيقة (انظر أدناه). نبضات أطول (بضع ساعات) غالبا ما تؤدي إلى مساحات تكرار متعددة ائتلافه، وبالتالي فقدان الفرصة للصورة التقدم من الشوك واحدة. في بعض التجارب وصفت المجال الاقتصادي الموحد مع CldU لمدة 24 ساعة لموحد DNA التسمية قبل التعرض للحفر-TMP يليه وضع العلامات نبض مساحات النسخ المتماثل.
3. حصاد الخلايا وتمتد من ألياف DNA
- إزالة لوحة من المسرح، وإزالة المتوسطة، ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة حل PBS. وضع قطرة 10 ميكرولتر من التربسين التجاري/ حل EDTA على تقاطع الصليب في منتصف سطح الزجاج.
- احتضان لمدة 3-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم رسم الحل التربسين مع خلايا منفصلة في تلميح الماصة. ليست هناك حاجة لتحييد التربسين.
- وضع قطرة من التربسين / EDTA مع الخلايا في واحدة من نهاية silanized شريحة ميكروسكوب زجاجية. ليز الخلايا والافراج عن الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.5٪ محلول SDS واحتضان لمدة 3-4 دقيقة في RT خلط بلطف مع طرف الماصة، والسماح للمحيط تجمع لتجف.
- إمالة الشريحة 20º والسماح للسائل لتشغيل وصولا الى نهاية. وتمتد ألياف DNA / امتدت من قبل قوات الهيدروديناميكية من السائل المتدفق. اسمحوا الجافة الشرائح الهواء (~ 10 دقيقة)، وإصلاح في 3: 1 الميثانول / حامض الخليك لمدة 10 دقيقة. إزالة الشرائح من الحل الإصلاح والهواء الجاف مرة أخرى. عند هذه النقطة يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في ETOH 70٪ -20 ° C. على الإزالة من 70٪ ETOH السماح للهواء الجاف قبل نيخطوة XT.
- غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني، ومن ثم تفسد في 2.5 M حمض الهيدروكلوريك لمدة 1 ساعة على RT. هذا العلاج depurinates DNA جعل nucleobases الهالوجينية أدرجت في متناول الأجسام المضادة.
- تحييد الشرائح في 0.4 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. يغسل مرتين في PBS / 0.5٪ توين 20 (PBST) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- كتلة الشرائح مع 5٪ الزلال المصل البقري (BSA)، و 10٪ مصل الماعز في برنامج تلفزيوني. تغطية الشرائح بلطف مع بارافيلم لنشر عرقلة الحل بالتساوي على الشرائح واحتضان لمدة 1 ساعة عند RT.
- الماصة 100 ميكرولتر من 1: 200 التخفيف في عرقلة الحل من الفئران مكافحة bromodeoxyuridine (بالكشف على وجه التحديد CldU) الأجسام المضادة الأولية إلى كل شريحة. تغطية الشرائح بلطف مع بارافيلم لنشر تخفيف بالتساوي على الشرائح واحتضان في غرفة ترطيب لمدة 1 ساعة على RT. إزالة بارافيلم وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- الماصة 100 ميكرولتر من المخفف (1: 100) الماعز المضادة للفأر اليكسا فلور 647 في عرقلة الحل لكل شريحة. غطي الينزلق بلطف مع بارافيلم واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- الماصة 100 ميكرولتر من المخفف (01:40) الماوس مكافحة bromodeoxyuridine (بالكشف عن ليجا ديبورتيفا وCldU هذه النوعية المزدوجة يستلزم حجب CldU من قبل مكافحة BrdU الفئران في الحضانة السابقة.) الأجسام المضادة الأولية والأرنب مكافحة DIG الأضداد (1: 200 ) في عرقلة الحل لكل شريحة. تغطية الشرائح بلطف مع بارافيلم واحتضان في غرفة ترطيب لمدة 1 ساعة على RT. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- الماصة 100 ميكرولتر من المخفف (1: 100) الماعز لمكافحة فأر اليكسا فلور 488 andc (1: 5000) الماعز المضادة للأرنب التحقيق (على سبيل المثال، Qdot 655) في عرقلة الحل لكل شريحة. تغطية الشرائح بلطف مع بارافيلم واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT. غسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- استنزاف PBST الزائد على منشفة ورقية. إضافة 50 ميكرولتر من antifade المتوسطة المتزايدة على كل شريحة، وتغطي مع ساترة. صورة أو مخزن لللا يزيد عن 48 ساعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
4. التصوير الألياف بواسطة الإسفار المجهر
- أداء الحصول على الصور من خلال الهدف 63X على مجهر مقلوب مع عجلة تصفية بمحركات تماما المرفقة مع FITC، Cy5 وQ نقطة 655 الكشف. مرشح الإثارة هو 425 نانومتر، وتصفية الانبعاثات هو 655 نانومتر مع 20 نانومتر تركزت في ذروة الانبعاثات 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ليزر محلي حفر-TMP (الشكل 1A) ICLS يمكن عرضها من قبل المناعي ضد حفر العلامة مرتبطة السورالين. على الرغم من أن الليزر يمكن توجيهها إلى الإضراب في مساحة أي كفاف، والمشارب ليست الأشكال "الطبيعية" في الخلايا، وإشارات مشروعة يمكن تمييزها بسهولة من القطع الأثرية بسبب غير محددة وملزمة من قبل الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية. هذه الميزة مفيدة عند استخدام الأجسام المضادة تقل عن خصوصية كاملة. ويرد مثال على علامة معروفة من DDR، γ-H2AX، في شريط من حفر-TMP ICLS في الشكل 1B.
والمناعي للحفر الموسومة الآفات في خطوط الليزر لا تسمح لأي استنتاجات فيما يتعلق بتواتر والمباعدة بين الولادات adducts. من أجل جعل حضنت هذه الخلايا تقرير مع CldU لمدة 24 ساعة قبل إدخال ICLS. تلطيخ ضد اليسمح ه CldU التصور للحفر الموسومة آفات على ألياف طويلة وينتج أنماط الألياف أكثر وضوحا من البقع المباشرة مثل دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) أو YOYO {1،1 '- (4،4،8 8-ميثيل-4،8-diazaundecamethylene) مكرر [4 - [(3-methylbenzo-1،3-oxazol-2-YL) methylidene] -l، 4 dihydroquinolinium] tetraiodide}. بعد إدخال ICLS من تنشيط ضوئي ليزر، وانتشرت ألياف من الخلايا المستهدفة. وكشف تحليل الإشارات حفر على الألياف مثل تلك التي تظهر في الشكل 2 أن المسافات بين ICL تراوحت بين أقل من 10 كيلو بايت إلى أكبر من 160 كيلو بايت، كما هو موضح في منطقتنا نشر مؤخرا 21. لم يكن هناك أي دليل على adducts متفاوت المسافات. وهكذا فإن شريط العلامة حفر، وتراكم البروتينات DDR في الشريط، يعكس وجود آفات فصل جيدا، على الأقل كما يقاس طول DNA الموسعة. تعتبر من حيث لونين الخلوي إذا كان ICLS تشكلت في صفائف nucleosomal، مع 6أضعاف ضغط من طول DNA الموسعة، فإنها لا تزال تفصل ما يعادل حوالي 1.6 كيلو بايت من DNA.
تجارب يتميز الليزر التي يسببها الحمض النووي من التلف متابعة عموما تحريض من DDR. هذه التجارب نادرا ما نشعر بالقلق مع أسئلة بخصوص تكرار الحمض النووي. من ناحية أخرى، وتستخدم DNA فحوصات الألياف عادة للدراسات النسخ المتماثل. تعرض الخلايا لنبضات قصيرة من المهلجنة نظائرها نيكليوزيد النتائج في إدماجها في DNA. التحليل المناعي للألياف الحمض النووي يكشف مساحات من نظائرها أدرجت يمثل تركيب الحمض النووي مؤخرا. وكان من مصلحة أن نسأل إذا حدث تكرار الحمض النووي في الليزر المترجمة المشارب ICL، وإذا كان الأمر كذلك، ما من شأنه أن يكون نمط النسخ المتماثل في محيط ICLS؟ وحضنت الخلايا لمدة 24 ساعة مع CldU لتسهيل عرض ألياف طويلة. أدخلت ليزر المترجمة ICLS إلى خلايا تليها نبضة 1 ساعة من تعاطي المخدرات بالحقن. DNA و أعدت ibers من الخلايا المستهدفة وحفر الكلمات الدلالية ICLS ومساحات تكرار عرضها. أشارت النتائج إلى أن تفعيل الليزر من السورالين عدم إيقاف النسخ أو تؤثر على وتيرة العام لأنماط النسخ المتماثل. وقعت النسخ المتماثل على جانب واحد، وكذلك على جانبي ICLS، مع أنماط مزدوجة من جانب في 4: أغلبية 1 كما بينا في الآونة الأخيرة 21.
الشكل 1: جيل من الليزر المترجمة حفر-TMP ICLS. (A) هيكل السورالين حفر-ثلاثي. (B) تراكم γ-H2AX (الأخضر) في ROI تحتوي على ICLS الليزر الموضعي (حفر والأحمر). اتسخت النواة مع دابي (الأزرق). تبين الصورة brightfield خلية جزئيا على العلامة التي أدلى بها قلم الماس. لاحظ نويات، ووضع العائد على الاستثمار خارجها.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الالياف DNA مع إشارات الليزر المترجمة حفر-TMP. وحضنت (A) خلايا لمدة 24 ساعة مع CldU لتسمية DNA. ثم أدخلت ICLS الليزر المحلية و(B) كانت تحصد الخلايا والألياف ينتشر. (C، D) وعرضت إشارات حفر مع نقطة immunoquantum (أحمر) وCldU المناعي (الخضراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتطلب تكنولوجيا الليزر توطين استخدام الخلايا الملتصقة مع نوى التي تظهر في المجهر مشرق الميدان. حاولنا أن نعلق خلايا غير ملتصق، مثل الخلايا الليمفاوية الأولية، أو الخلايا المستزرعة ملتصقة فضفاضة مثل AD293، على سطح الزجاج مع الاستعدادات خلية لاصقة مثل متعدد الليزين أو الكولاجين، أو خليط أكثر تعقيدا. على الرغم من أن هذه العلاجات قد ربط الخلايا على السطح، نجد أن يبقوا عموما مقربة مما يجعل من الصعب جدا على التركيز في نوى. وعلاوة على ذلك، غالبا ما تفشل الخلايا من أجل البقاء في غسل الأولي بعد إزالة المتوسطة النمو. ومع ذلك، ضمن متطلبات الخلايا الملتصقة، وقد استخدمنا بنجاح مجموعة واسعة من خطوط الخلايا القياسية وكذلك الخلايا الأولية لهذه الدراسات. ومن المفيد أن اختبار الخلايا للتلوث الميكوبلازما. نجد أن استجابات الخلايا يتم تعديلها من قبل هذه العدوى.
البؤري ليزر هو المهم. والهدف هووضع ICLS داخل النواة. عالية جدا وسوف تنشيط ضوئي يكون فوق النواة. منخفضة للغاية وسيكون على الزجاج. نجد أنه من المفيد أن زيادة تركيز الصورة DIC عند تقاطع السيتوبلازم والنواة.
المقايسات الألياف ليست صعبة، ولكنها تحتاج إلى بعض الممارسات قبل أن يتم استرداد حقول التأويل. ومن المهم لتنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح. عدد الخلايا المستخرجة من تجارب الليزر منخفض ويستخدم كل عينة في مجملها على شريحة واحدة. ونتيجة لذلك فإنه من الضروري لتعظيم العائد من كل تجربة، وعينات لا يمكن تقسيم، مع أجزاء مأخوذة حفظها لتحليلها لاحقا. ومع ذلك، ومئات من الأحداث يمكن استردادها من عينة واحدة. اثنين من الميزات الإجراء هي ذات أهمية مركزية. واحد هو معدل تدفق المحللة خلية أسفل الشريحة. إذا بسرعة كبيرة، والكثير من الحمض النووي سوف تعمل خارج الشريحة. نوعية الشرائح الزجاجية أمر بالغ الأهمية أيضا. نحن RECE أحياناإيف الكثير التي هي غير فعالة. وبناء على ذلك كل الكثير جديد يجب أن يتم اختبار قبل استخدامها.
وكما هو الحال بالنسبة لجميع التلاعب مختبر موثوقية التجارية الكواشف الأجسام المضادة، النقاط immunoquantum، وما إلى ذلك، هو دائما مصدر قلق. هذه ليست دائما مستقرة وعادة ما تتبعت فشل التجريبي للمشاكل مع واحد أو كاشف آخر. النقاط immunoquantum هي إشكالية للغاية وأكثر من قطعة واحدة قد تحتاج إلى اختبار من أجل تحديد واحد الذي هو مقبول. وتتميز الكثير غير فعالة إشارات خلفية عالية. هذه لا ترتبط مع الألياف وسيتبين في مناطق الشريحة التي ليس لها DNA.
أصبح استخدام الليزر لإدخال الحمض النووي من التلف المحلي شعبية كبيرة منذ أن تم عرضه من قبل مجموعة بونر 4. في تلك، والتجارب أكثر لاحقة يتم تعيين إعدادات الطاقة الليزر وذلك للحث على DDR مباشرة. وقد استخدمنا قوة وضع يمث منخفضة بما فيه الكفايةح أن تفعيل DDR يعتمد على كلا الليزر والسورالين. وكما ذكر أعلاه، والفصل بين adducts السورالين يقول أننا نبحث في الرد على أحداث فردية. في حين أن عدد ICLS التي يتم تشكيلها من قبل وكلاء يشابك الذاتية غير معروف، نلاحظ أن توطين adducts السورالين لا يقتل الخلايا، كما أنها قادرة على إزالة adducts السورالين في غضون 6-8 ساعة (بيانات غير منشورة)، و موجودة وصحية بعد 24 ساعة. وبالتالي فإن هذا النهج هو أقل سمية بكثير لخلايا من البروتوكولات التي تتطلب التعرض للعوامل التي تدخل الحمض النووي من التلف طوال النواة والميتوكوندريا.
الجمع بين الليزر / السورالين يعرض على تشويه بنية الحلزون التي تنشط DDR. وفي هذا الصدد النتائج المتحصل عليها من هذه الطريقة هي التي تنطبق على مجموعة من الآفات الحلزون تشويه، نظرا لطبيعة المتتالية من DDR، وبعد تفعيل ATM / DNAPK / ATR تحركات 22.وفي هذا الصدد يمكن تمديد الألياف نهج DNA هو موضح هنا إلى أي بنية الحمض النووي التي يمكن الكشف عنها بواسطة الوسائل المناعية أو الكيميائية أو الحيوية التي يمكن عرضها من قبل مضان. يمكن أن تتضمن هذه الأشعة فوق البنفسجية photoproducts 23، alkylators ضخمة 24، quadruplexes G 25، والآفات التأكسدي 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة (Z01 AG000746-08) وصندوق أبحاث فقر دم فانكوني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
