Summary
לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.
Abstract
תגובת נזק לדנ"א (DDR) התאפיינה בהרחבה במחקרים של הפסקות גדיל כפול (DSBs) המושרה על ידי הקרנה קרן מיקרו לייזר בתאים חיים. המזרח-גרמנית Helix מעוותת שינויים DNA קוולנטי, כולל crosslinks interstrand DNA (ICLs), הוא לא כמו גם מוגדר. למדנו את DDR מגורה על ידי ICLs, למקום על ידי לייזר photoactivation של psoralens immunotagged, האצור בגרעיני התאים לחיות. על מנת לענות על שאלות בסיסיות אודות חלוקת adduct ומפגשים מזלג שכפול, שילבנו לוקליזציה לייזר עם שתי טכנולוגיות אחרות. סיבים DNA משמשים לעתים קרובות כדי להציג את ההתקדמות של מזלגות שכפול ידי immunofluorescence של אנלוגים nucleoside שולבו במהלך פולסים קצרים. נקודות Immunoquantum הועסקו נרחב עבור הדמית מולקולה בודדת. לפי הגישה החדשה, סיבים DNA מתאי נושאת ICLs מקומי לייזר פרוסים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ICLs מתויגת מוצגת עם נקודות immunoquantum ו המרחקי e-נגע השאר נקבעו. שכפול מזלג התנגשויות עם ICLs ניתן דמיינו ודפוסי מפגש שונים מזוהים ונרשמים.
Introduction
DNA נמצאת תחת מתקפה מתמדת מצד סוכנים חיצוניים כגון קרינה, אור אולטרה סגול, רעלים סביבתיים, תוצרי בעירה, וכו 'בנוסף, הוא תקף גם על ידי מינים רדיקליים אנדוגניים מיוצרים על ידי מטבוליזם חמצונים. לכל אלה פוטנציאל כימי או פיזי לשבש את תקינות DNA 1. הפרעות בגנום יכול להפעיל את תגובת נזק לדנ"א (DDR), גיוס ומתפזרות שינוי פוסט translational עם מאות, אם לא אלפי, של חלבונים מיקרו-רנ"א מעורב תיקון הנגע, הסדרת מחזור התא, אפופטוזיס, הזדקנות, והמסלולים דלקתיות 2.
רוב המידע שלנו לגבי DDR מגיע ממחקרים עם DSBs. זהו במידה רבה בשל הזמינות של טכנולוגיות מציגים הפסקות, כוללים רצף הפסקות ספציפיות, ב DNA הגנומי בתאים חיים 3. בנוסף, propensity של הפסקות לגרום מוקדים של חלבונים DDR, אשר יכול להיות מוצג על ידי immunofluorescence, עזר לי מאוד לזיהוי קינטיקה והדרישות של חלבונים להגיב. אחת מהטכנולוגיות מפתח ללימוד DDR הוצג על ידי בונר ועמיתיו, שהשתמשו קרן לייזר לכוון פס של DSBs בתוך "אזור של אינטרס" (ROI) האצור בגרעיני התאים החיים 4. למעשה, הם יצרו מוקד ארוך, שבו חלבונים של DDR יכולים להיות מזוהים על ידי immunofluorescence. הדבר הומחש על ידי ההפגנה שלהם של הפס החזק של H2AX היסטון פוספורילציה (γ-H2AX) בתאים שנחשפו הליזר. מאז, הגישה לייזר כבר המועסקים מחקרים רבים של DDR המושרה על ידי DSBs. למרות חזק ופופולרי, ואת המקור של תמונות immunofluorescence דרמטיות, יש לציין כי ברוב הניסויים עוצמי הליזר מותאם על מנת לייצר תוצאות נצפות, בלי דאגת זהות נגע,צפיפות, או ריווח. ואכן, זה יכול להיות קשה לבצע אומדנים אלה. לכן הם התעלמו במידה רבה, למרות ריבוי הנגעים הציגו לתוך ה- DNA על ידי לייזרים 5. זה תורם סתירות רבות בספרות 6.
בניגוד DSBs, השינויים הכימיים ביותר של דנ"א לא לעורר היווצרות מוקדים הנפרדים של חלבוני DDR. זה חשוב לאור ההבנה הנוכחית שלנו של תדרי נגע. ההערכה היא כי תאי האדם בתרבות נגרמו רבים ככל 50 DSBs לכל מחזור התא, נוצר ברובו במהלך S שלב 7, 8, 9. פחות נוצרים בתאים שאינם מתרבים. זאת בניגוד מספר הפסדים nucleobase או אירועים שינוי, אשר נמצאים עשרות אלפי לכל תא / יום 1, 10. לפיכך, אנו יודעים הכימהרפובליקה מושרה על ידי אירועים נדירים יחסית, והרבה פחות על אלה המושרים על ידי נגעים מעוותי סליל, אשר במצטבר שכיח הרבה יותר.
על מנת לענות על שאלות לגבי תגובת התאים קוולנטיים שינויים של DNA גנומי, רצינו לעבוד עם adduct DNA מעוותת Helix שיש פעילות אינדוקציה DDR הטבועה. יתר על כן, כדי להקל על עיצוב ניסיוני ופרשנות היינו מעוניינים מבנה המבוא אשר יכול להיות נשלט ביחס לזמן והיה מקובל ויזואליזציה. בהתאם לכך, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על psoralen. Psoralens גם מאופיינים intercalators DNA photoactive העדפת 5' ת"א: באתרים. בניגוד סוכנים crosslinking אחרים כגון חרדל חנקן ו mitomycin C (MMC) הם אינם DNA תגובתי אלא חשופים גל ארוך UV (UVA) אור. מולקולות intercalated מגיבות עם בסיסי תימין על גדילי היפך לייצר crosslinks interstrand מעוותת סליל (ICLs11). עם psoralen trimethyl השתמש בניסויים שלנו רוב המוצרים הם ICLs, מעטים יחסית monoadducts נוצר (פחות מ 10%) 12, ו crosslinks intrastrand בין בסיסים הסמוכים על גדיל אחד לא נוצר. מכיוון שהם אבני עוצמה כדי שכפול שעתוק, psoralen וסוכני crosslinking אחרים, כמו ציס-פלטינה ו- MMC, משמשים בדרך כלל כימותרפיה. לפיכך psoralen לאפשר מחקרים שלאחר הפעלת DDR ידי מבנה מעוות Helix, וגם ספקו תובנה התגובה התאית למתחם עם חשיבות קלינית.
אנחנו מסונתז ריאגנט שבו psoralen trimethyl היה מקושר digoxigenin (DIG) חברה sterol הצמח לא נמצא בתאי יונקים שימוש תכוף כמו immunotag. הדרישה עבור photoactivation מתיר לוקליזציה ידי אור לייזר (365 ננומטר) של ICLs psoralen ב ROI מוגדר בגרעין בתאים חיים. אלה יכולים להיות מוצגים על ידי IMMunofluorescence נגד תג Dig. תיקון דנ"א וחלבונים DDR הופיעו פסים של לייזר מקומי 13 ICLs, 14.
מהרפובליקה מופעל על ידי בעוצמות לייזר גבוהה משמש לייצור DSBs יכול להיות בגלל הנזק מבודד או מקובצים 15, 16. כתוצאה מכך, את הרלוונטיות של תוצאות מניסויים אלה המתרחשים נגעים טבעיים, נוכח הרבה ריכוז נמוך, אינו ברור. כדי לענות על שאלות דומות לגבי תדירות adduct psoralen והריווח ב DNA, לקחנו את היתרונות של טכנולוגיית סיבים DNA 17 ונקודות immunoquantum. נקודות קוונטיות הן הרבה יותר בהירות צבעי ניאון ואינם מולבנות על ידי חשיפה לאור. לכן הם משמשים לעתים קרובות עבור הדמית מולקולה בודדת 18, בקשה אשר צבעי ניאון בהירים מספיק. ניתן למתוח סיבי DNA בודדים על gמגלשות נַעֲרָה ויכולים להיות מוצגות על ידי immunofluorescence נגד אנלוגים nucleoside שולבו במהלך incubations לפני תא קציר. התייחסנו תאים עם Dig-psoralen וחשף את ההחזר על ההשקעה הקרנה מיקרו לייזר. סיבים הוכנו מן התאים adducts Dig-psoralen הפרט יכול להיות דמיינו עם הנקודות immunoquantum. חשיפת תאי nucleoside אנלוגים לזמנים קצרים יחסית (20-60 דקות) מאפשרת את התצוגה של שטחים שכפולים בסביבה של ICLs הליזר מקומי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Dig-TMP
- מערבבים 50 מ"ג (0.18 mmoles) של 4'-chloromethyl-4,5' , 8-trimethylpsoralen ו 590 מ"ג (2.7 mmoles) של 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-אמין ב סבב 25 מ"ל יבש בקבוק -bottom תחת חנקן. להוסיף 10 מ"ל טולואן ריפלוקס עבור 12 h. הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת.
- לטהר את השאריות ידי כרומטוגרפיה בעמודה פלאש מעל ג'ל סיליקה. Elute הטור עם כלורופורם, מתנול, פתרון אמוניה 28% (9: 1: 0.5). לאדות את הממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת, וכן לשחזר את טהור 4 '- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen כמו צהוב חיוור צמיג נוזל.
- מערבבים 5.5 מ"ג (0.012 mmoles) של 4 '- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', 8-trimethylpsoralen עם 5 מ"ג (0.008 mmoles) של אסתר NHS digoxigenin ב בקבוק מסביב לתחתית יבש תחת חנקן. להוסיף 0.5 לפוראמיד דימתיל נטול מ"ל (DMF) עלד 3.4 μL של trimethylamine ומערבבים על 50 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
- הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת.
- ממיסים את שאריות בסכום מינימום של dichloromethane. החל את פתרון 2 נקודות μL אופקית לאורך החלק התחתון של צלחת שכבה דקה ההכנה עם ג'ל סיליקה כשלב נייח. הפעל את TLC ההכנה כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1).
- להסוות את הצלחת להוציא את הקצוות האנכיים ולזהות את הלהקה של המוצר עם מנורה ננומטר 254 UV באורך גל קצר. גרד את המוצר מהצלחת עם מרית לבודד את המוצר הטהור באמצעות כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1) תערובת.
- סר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. ממיסים את כדורי שיורית 1 מ"ל של 50% EtOH: H 2 O, לוותר לתוך 50 aliquots μL ב 1.5 מ"ל צינורות (~ 20 aliquots) ויבש המאייד צנטריפוגלי עד שכל הממס הוא התאדה (~ 3 h).
- Redissolve כל aliquot ב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O ויבש שוב המאייד צנטריפוגלי. ממיסים כל aliquot שוב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O, יבש בתוך כדורי המאייד וחנות צנטריפוגלי ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
- לשימוש, לפזר את הגלולה ב 50 μL של EtOH 50%: H 2 O. כן 1: דילול 100 של Dig-TMP מומס H 2 O ולמדוד OD ב 250 ננומטר. מקדם הכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. הפתרון הוא יציב במשך חודש על אותם אם הם נמצאים -20 ° C. בדוק את הריכוז ידי מדידת OD ב 250 ננומטר לפני כל שימוש.
- חישוב ריכוז המניות: ABS x 100 x10 6 / 25,000 = ריכוז (ב מיקרומטר). בדרך כלל פתרון המניות הוא כ 3 מ"מ. חשוב להיות בטווח זה על מנת למזער את היקף EtOH מתווסף בינוני.
2. לייזר מותאם למקום Dig-TMP ICLs
- פלוקליזציה לייזר rform עם מיקרוסקופ confocal עם לייזר חנקן SRS (337 ננומטר) נשאבים באמצעות תא צבע פולטות קו של 365 ננומטר ו ירי 3 פולסים NS ב 10 הרץ, עם כוח של 0.7 NW.
- הפוך סימן אנכי בצד של זכוכית 35 מ"מ תחתי צלחת תרבית תאים עם עט סימון. גרד צלב במרכז הזכוכית על פני השטח בתרבות עם עט יהלום כזה פס שחור בצד של המנה הוא בראש זרוע אחת של הצלב. הצלב הוא מסומן על פני שטח הצמיחה של הזכוכית כך והתאים יהיו באותו מישור המוקד.
- לעקר את הצלחת לאחר סימון עם שטיפה של 70% EtOH. ניקוי לפני ציפוי התאים.
- תאי פלייט (זני מעבדה סטנדרטיים כגון הלה או U2OS) ב cross המסומנים מנות תרבות אחת או ימים לפני. תא צריך להיות חלוקה פעילה 50-70% ומחוברים ביום הניסוי. דגירה 24 שעות עם 1 מיקרומטר 5-כלורו-2-deoxyuridine (CldU) ל- DNA תווית באופן אחיד.
- לְהוֹסִיףDig-TMP ב EtOH 50%: H 2 O ל תרבית תאים בינוניים לריכוז סופי של 20 מיקרומטר. תביא את המדיום כדי 37 מעלות צלזיוס. שינוי המדיום מעל התאים ומכניסים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 30 דקות כדי לאפשר Dig-TMP כדי לאזן.
- בעוד התאים דוגרים, להקים את x / y של שדה ראייה שבה הליזר פעיל. בצע את הליך הכיול של היצרן שבו הלייזר מכוון על ידי תוכנה כדי לחרוט שקופית זכוכית מראות לאורך קו אופקי אלכסוני. שתי השורות להגדיר את גבולות התחום שבו הלייזר יכול להכות מטרה.
- מניח את הצלחת בתא הסביבתי, ב 37 מעלות צלזיוס עם נשלט CO 2 ולחות, על במת מיקרוסקופ ולהתמקד במטרת שמן 60X על ההצטלבות של הצלב.
- כוונו את קרן לייזר 365 ננומטר ל ROI, הוקמה על ידי החוקר עם כלי הצורה בתוכנה, כדי ליצור פס של 3 &# 181; MX 0.6 מיקרומטר. המתווה של ROI מושמת על ידי סמן גרעינים של תאים הממוקמים בסביבה הקרובה של ההצטלבות של הצלב. התאם את המטוס z מוקד למקד את מידוויי לייזר דרך הגרעין. השתמש בלייזר בטווח של 350-370 ננומטר. 405 nm לייזרים לא יכול לגרום crosslinks 19.
הערה: אנו לאתר את ההחזר על ההשקעה באזורים nucleoplasmic מחוץ nucleoli, אשר ניתן להבחין בין nucleoplasm בניגוד התערבות ההפרש (DIC) הדמיה. - בדוק את המיקוד ואת הפעילות של הלייזר על ידי הגדלת ההספק לרמה מספיקה כדי למחוק תא (תא תחשיך ואז נעלמים). זהו אבחון חשוב עבור נתיב האור הפרעה עבור לייזר באמצעות מיקרוסקופ ואז דרך coverslip ו לתוך התאים.
- הפחת את הגדרת הכוח מספיק כדי להפעיל את psoralen ואת DDR המושרה כיל (זו צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל לייזר / מיקרופוןroscope שילוב). השתמש עוצמת הלייזר הגדרת (1.7% כאן) כי אינו להפעיל את DDR בהעדר psoralen (פיקוח על ידי היווצרות של γ-H2AX).
הערה: זוהי קביעה חשובה ואת ההגדרות עשויות לדרוש התאמה אם מקור הליזר או רכיב בנתיב האור משתנה. בצע את ההצטברות של GFP מתויגת חלבוני תיקון כגון XPC או FAN1, אשר שניהם גייסו במהירות (תוך שניות) אל פסי psoralen ליזר, אבל לא לרועי חשופי הליזר לבד. חלבונים מסוימים של DDR להופיע בתוך שניות, תוך דקות אחדות עשויות להידרש ואחרים. יש צורך לבצע קביעות כמובן זמן עבור כל חלבון של עניין. נציין כי בתאים שלא נחשפו לייזר אין פסים של חלבונים להגיב.
- הפחת את הגדרת הכוח מספיק כדי להפעיל את psoralen ואת DDR המושרה כיל (זו צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל לייזר / מיקרופוןroscope שילוב). השתמש עוצמת הלייזר הגדרת (1.7% כאן) כי אינו להפעיל את DDR בהעדר psoralen (פיקוח על ידי היווצרות של γ-H2AX).
- אחרי הכל מתאים בשדה היה ממוקד מהלך הצליחו לתחום חדש, להישאר קרוב לצומת של הצלב.
- בניסויים שנועדו determine חלוקת מרחקי נגע שאר לחשוף תאים אל הליזר ב 20-25 שדות (4-5 תאים / שדה) סביב הצומת. על מנת לנתח דפוסים שכפולים בסביבה של ICLs המקומי לדגור תאים עם 10 מיקרומטר 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) לאחר ירי ליזר.
הערה: זמן דגירה עם IdU היא שרירותית. השתמשנו קצר ככל 20 דקות וכל עוד 60 דק '(ראה להלן). פולסים ארוכים יותר (כמה שעות) לעתים לגרום שטחים שכפולים מרובים התגבשו, ובכך לאבד את הזדמנות תמונת התקדמות מזלגות חד. בניסויים מסוימים CES מסומנים עם CldU עבור 24 שעות כדי אחיד DNA התווית לפני חשיפה לחפור-TMP ואחריו תיוג הדופק של שטחים שכפול.
קציר 3. תאים ומתיחה של סיבי DNA
- הסר את הצלחת מן הבמה, להסיר את המדיום, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). הסר את פתרון PBS. מניחים ירידה 10 μL של טריפסין מסחרי/ פתרון EDTA על ההצטלבות של הצלב באמצע משטח הזכוכית.
- דגירה של 3-4 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן לצייר את הפתרון טריפסין עם תאים מנותקים לתוך קצה pipet. אין צורך לנטרל את טריפסין.
- מניחים את טיפת טריפסין / EDTA עם תאים בקצה אחד של המיקרוסקופ שקופית זכוכית silanized. Lyse את התאים לשחרר את ה- DNA על ידי תוספת של 10 μL של פתרון 0.5% SDS דגירה במשך 3-4 דקות ב RT ערבוב בעדינות עם קצה pipet, המאפשר בפריפריה של הבריכה לייבוש.
- הטה את השקופית 20º ולאפשר את הנוזל לרוץ עד הסוף. סיבי DNA מורחבים / נמתחו על ידי הכוחות הידרודינמית של הנוזל זורם. תנו אוויר יבש מגלשות (~ 10 דקות) ולתקן ב 3: 1 מתנול / חומצה אצטית עבור 10 דקות. הסר את השקופיות מפתרון לתקן ואוויר יבש שוב. בשלב זה הם יכולים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן ב 70% EtOH ב -20 מעלות צלזיוס. על הסרה מן EtOH 70% ולאפשר לאוויר יבש לפני neצעד XT.
- לשטוף שקופיות PBS, ולאחר מכן לפגל ב 2.5 M HCl עבור 1 ש 'ב RT. טיפול זה depurinates DNA שהופך את nucleobases הלוגנים משולב נגישה נוגדנים.
- לנטרל שקופיות 0.4 M Tris-HCl, 7.4 pH. פעמיים לשטוף ב PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) במשך 5 דקות כל אחד.
- בלוק מחליק עם 5% שור סרום אלבומין (BSA) ו 10% בסרום עיזים ב PBS. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את הפתרון חוסם באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה של 1 ש 'ב RT.
- Pipet 100 μL של 1: 200 דילול פתרון חסימה של האנטי-bromodeoxyuridine חולדה (במיוחד מזהה CldU) נוגדן ראשוני לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את דילול באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified עבור 1 ש 'ב RT. הסר את parafilm לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד.
- Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד עכברוש אלקסה פלואוריד 647 בחסימת פתרון לכל שקופית. תכסה אתמחליק בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד.
- Pipet 100 μL של דילול (01:40) עכבר bromodeoxyuridine אנטי (מזהה ldU ו CldU זה סגוליות כפול מצריך חסימת CldU ידי BrdU אנטי עכברוש הדגירה לפני.) נוגדן ראשוני ארנב אנטי DIG נוגדן (1: 200 ) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה בתא humidified עבור 1 ש 'ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד.
- Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד העכבר Alexa פלואוריד 488 andc (1: 5000) בדיקה נגד ארנב עיזים (למשל, Qdot 655) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד.
- מסנני PBST העודף על גבי מגבת נייר. להוסיף 50 μL של antifade הרכבה בינונית על כל שקופית ומכסים coverslip. תמונה או חנותלא יותר מ 48 שעות ב -20 מעלות צלזיוס.
4. הדמיה סיבים ידי הקרינה מיקרוסקופית
- בצע רכישת התמונה דרך אובייקטיבית 63X על מיקרוסקופ הפוכה עם גלגל מסנן ממונע המצורפת במלואה עם FITC, Cy5 ו- Q Dot 655 זיהוי. מסנן העירור הוא 425 ננומטר, ואת מסנן הפליטה הוא 655 ננומטר עם 20 ננומטר מרוכזים בשיא הפליטה 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dig-TMP מקומי לייזר (איור 1A) ICLs ניתן להציג על ידי immunofluorescence נגד Dig-תג צמוד psoralen. למרות הליזר יכול להיות הופנה לשבות בשטח של איזשהו חלק, פסים הם לא "טבעיות" צורות בתאים, אותות לגיטימיים ניתן להבחין בקלות בין חפצים בשל כריכה הלא ספציפית על ידי נוגדנים ראשוניים או משניים. תכונה זו שימושית בעת שימוש נוגדנים של פחות מ סגולי מושלם. דוגמא של הסמן הידוע של DDR, γ-H2AX, הוארה בפס ICLs Dig-TMP מוצגת באיור 1B.
Immunofluorescence של Dig מתויג נגעים ב הפסים לייזר אינו מאפשר שום מסקנות לגבי התדירות ואת המרווח של adducts. על מנת להפוך את התאים להגדרה זו הודגרו עם CldU עבור 24 שעות לפני כניסתה של ICLs. מכתים נגד הדואר CldU מאפשרת ויזואליזציה של Dig מתויגת נגעים על סיבים ארוכים מניבה דפוסי סיבים ברורים יותר כתמים ישירים כגון DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) או YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-י.ל) methylidene] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}. לאחר כניסתה של ICLs ידי לייזר photoactivation, סיבים הופצו מן התאים הממוקדים. ניתוח אותות Dig על הסיבים כגון אלה שמוצגים באיור 2 חשף כי מרחקי כיל השאר נעו בין פחות מ 10 KB עד יותר מ 160 kb, כמתואר בפרסום האחרון שלנו 21. לא היו שום ראיות adducts מקובצים. לכן הפס של תג Dig, ואת ההצטברות של חלבוני DDR ב הפס, שקף את הנוכחות של נגעים מופרדים היטב, לפחות כפי שנמדד לאורך הדנ"א המורחבת. נחשב מבחינת הכרומטין סלולארי אם ICLs נוצר מערכי nucleosomal, עם 6לקפל דחיסה של אורך DNA המורחבת, הם עדיין יהיו מופרדים השווה לכ 1.6 kb של DNA.
ניסויים הכוללים נזק לדנ"א המושרה לייזר בדרך כלל לבצע את הגיוס של DDR. ניסויים אלה לעיתים נדירות נוגעים בשאלות לגבי שכפול ה- DNA. מצד השני, מבחני סיב DNA משמשים בדרך כלל עבור מחקרים של שכפול. חשיפה של תאים כדי פולסים קצרים של תוצאות אנלוגים nucleoside תולדותיהן ב והכללתם DNA. ניתוח Immunofluorescence של סיבי DNA מגלה שטחים של אנלוגים משולבים המייצגים סינתזת DNA אחרונה. זה היה העניין לשאול אם שכפול הדנ"א התרחש הליזר מקומי פסי כיל, ואם כן, מה יהיה הדפוס שכפול בסביבה של ICLs? התאים הודגרו במשך 24 שעות עם CldU כדי להקל התצוגה של סיבים ארוכים. ICLs לייזר מקומי הוכנסו לתאי ואחריהם פולס 1 h של IdU. דנ"א F ibers הוכנו מן התאים הממוקדים ואת Dig מתויג ICLs ואת השטחים שהכפולים מוצגים. התוצאות הצביעו על כך שהפעלת לייזר של psoralen אינו כבה שכפול או להשפיע על התדר הכללי של דפוסי שכפול. שכפול התרחש בצד אחד, וגם על שני הצדדים של ICLs, עם דפוסי דו צדדי בתוך 4: הרוב 1 כפי שהראינו 21 לאחרונה.
איור 1: הדור של לייזר מותאם למקום Dig-TMP ICLs. (א) מבנה של psoralen Dig-trimethyl. (ב) צבירת γ-H2AX (ירוק) ב ROI המכיל ICLs לייזר מקומי (Dig, אדום). הגרעין הוא מגואלות DAPI (כחול). תמונת brightfield מראה תא חלקית על הסימן שנעשה על ידי עט היהלום. שימו לב nucleoli, ואת המיקום של ROI מחוץ להם.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: סיבים DNA עם לייזר מותאם למקום Dig-TMP אותות. (א) התאים הודגרו במשך 24 שעות עם CldU לתייג DNA. ואז ICLs לייזר מקומי הוכנסו ו (ב) התאים נקצרו הסיבים להתפשט. (C, D) אותות Dig הוצגו עם נקודת immunoquantum (אדום) ואת CldU ידי immunofluorescence (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכנולוגיה לוקליזציה לייזר מחייב שימוש בתאי חסיד עם גרעינים הנראים מיקרוסקופ שדה בהיר. ניסינו לצרף תאי nonadherent, כגון לימפוציטים עיקרי, או תאים בתרבית חסיד רופף כמו AD293, אל משטח הזכוכית עם הכנות דבקות תא כגון polylysine או קולגן, או תערובות מורכבות יותר. למרות טיפולים אלה עשויים להיקשר לתאים פני השטח, אנו מוצאים כי הם נשארים בדרך כלל מעוגלים מה שהופך אותו מאוד קשה להתמקד לתוך הגרעינים. יתר על כן, התאים לעיתים קרובות אינם מצליחים לשרוד את שטיפת הראשונית לאחר הסרת מדיום הגידול. עם זאת, בתוך דרישת תאים חסידים, השתמשנו בהצלחה במגוון רחב של שורות תאים סטנדרטיות, כמו גם תאים ראשוניים ללימודים אלה. כדאי לבדוק תאים עבור זיהום mycoplasma. אנו מוצאים כי תגובות תא משתנות על ידי זיהומים אלה.
במישור המוקד של הלייזר הוא חשוב. המטרה היאלמקם את ICLs בתוך הגרעין. גבוה מדי ואת photoactivation יהיה מעל הגרעין; נמוך מדי וזה יהיה על הזכוכית. אנו מוצאים אותו שימושי כדי לחדד את הפוקוס של התמונה DIC בצומת של הציטופלסמה לבין הגרעין.
מבחני הסיבים אינם קשים, אך דורשים מעט תרגול לפני שדות לפירוש הם התאוששו. חשוב ליישם את הטכניקה הזו כמו שצריך. מספר התאים התאוששו מן ניסויי הליזר הוא נמוך כל דגימה משמשת בשלמותו בשקופית אחת. כתוצאה מכך הוא חיוני על מנת למקסם את התשואה בכל ניסוי, כמו דגימות לא ניתן לפצל, עם aliquots הציל לניתוח מאוחר יותר. עם זאת, מאות אירועים ניתן לשחזר ממדגם יחיד. שני מאפיינים של התהליך הם בעלי חשיבות מרכזית. האחד הוא קצב זרימת lysate התא במורד המגלשה. אם מהר מדי, הרבה של ה- DNA יהיה לברוח המגלשה. איכות שקופיות הזכוכית היא גם קריטית. מדי פעם אנו Receאייב הרבה כי הם לא יעילים. כתוצאה מכך כל הרבה חדשים חייבים להיבדק לפני השימוש.
כפי שנכון עבור כל מניפולציות מעבדת האמינות של חומרים נגד נוגדנים מסחריים, נקודות immunoquantum, וכו ', היא תמיד דאגה. אלה אינם תמיד יציבים וכישלון הניסיון בדרך כלל לייחס לבעיות עם אחד או מגיב אחר. נקודות immunoquantum בעייתיות במיוחד ויותר מ הרבה אחד ייתכן שיהיה צורך להיבדק על מנת לזהות אחד כי הוא מקובל. המון יעיל מסומנים על ידי אותות רקע גבוהים. אלה אינם משויכים עם סיבים יראו על אזורים של השקופית שאין להם DNA.
השימוש בלייזר להציג נזק לדנ"א המקומי הפך פופולרי למדי שכן הוא הוצג על ידי קבוצת בונר 4. באותם וניסויים העוקבים ביותר הגדרות כוח הליזר נקבעות כדי לגרום DDR ישירות. השתמשנו כוח הגדרת suc מספיק נמוךh כי הפעלת DDR תלויה בשני לייזר ו psoralen. כפי שפורט לעיל, ההפרדה בין adducts psoralen טוען שאנחנו מסתכלים בתגובה לאירועים פרטיים. בעוד מספר ICLs כי נוצרים על ידי סוכני crosslinking אנדוגניים אינו ידוע, נציין כי הלוקליזציה של adducts psoralen שלא הורגת תאים, כפי שהם מסוגלים להסיר את adducts psoralen בתוך 6-8 שעות (נתונים שלא פורסמו) ו נוכחים ובריאים כעבור 24 שעות. לכן גישה זו היא הרבה פחות רעיל לתאים מ פרוטוקולים הדורשים חשיפה לחומרים כי להציג נזק לדנ"א ברחבי גרעין המיטוכונדריה.
שילוב הליזר / psoralen להציג מבנה מעוות סליל חשמלי שיפעיל את DDR. בהקשר זה את התוצאות שהתקבלו בגישה זו חלות מגוון של נגעים מעוותים Helix, בהתחשב באופי המדורג של DDR, בעקבות הפעלת הכספומט / DNAPK / ATR קינאזות 22.בהקשר זה את גישת סיבי DNA המתוארת כאן יכולה להתארך לכל מבנה ה- DNA כי ניתן לאתר באמצעות חיסוני או כימי או ביוכימיים שניתן להציג על ידי קרינה. אלו יכולים לכלול UV photoproducts 23, alkylators מגושם 24, quadruplexes G 25, ונגעים חמצוני 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי להזדקנות (Z01 AG000746-08) וקרן מחקר אנמיה Fanconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
