Summary
Lasrar används ofta i studier av cellulärt svar på DNA-skada. Emellertid, de genererar lesioner vars avstånd, frekvens, och kollisioner med replikationsgafflar sällan känne. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att bestämma dessa parametrar med laser lokaliserad interstrand tvärbindningar.
Abstract
DNA Damage Response (DDR) har i stor utsträckning kännetecknad av studier av dubbelsträngsbrott (DSB) inducerade av lasermikrostråle bestrålning i levande celler. DDR att helix snedvrida kovalenta DNA-modifieringar, inklusive interstrand DNA tvärbindningar (ICLs), inte är lika väl definierade. Vi har studerat DDR stimuleras av ICLs, lokaliseras genom laserfotoaktivering av immunotagged psoralener, i kärnan av levande celler. För att ta itu med grundläggande frågor om distributions addukt och replikationen möten, vi kombinerat laser lokalisering med två andra tekniker. DNA-fibrer används ofta för att visa förloppet för replikationsgafflar genom immunofluorescens av nukleosidanaloger inkorporerade under korta pulser. Immunoquantum punkter har i stor utsträckning använts för enda molekyl avbildning. I den nya metoden, är DNA-fibrer från celler som bär laser lokaliserade ICLs spreds ut på objektglas. De märkta ICLs visas med immunoquantum prickar och the inter lesion avstånd bestäms. Replikationsgaffeln kollisioner med ICLs kan visualiseras och olika möter mönster identifieras och kvantifieras.
Introduction
DNA är under konstant angrepp från exogena medel, såsom strålning, ultraviolett ljus, miljögifter, förbränningsprodukter, etc. Dessutom är det också attackeras av endogena radikaler producerade av oxidativ metabolism. Alla dessa har potential att kemiskt eller fysikaliskt störa integriteten av DNA 1. Störningar i genomet kan aktivera DNA-skador Response (DDR), en rekrytering och posttranslationell modifiering kaskad med hundratals, om inte tusentals, proteiner och mikroRNA involverade i lesion reparation, reglering av cellcykeln, apoptos, senescens, och inflammatoriska reaktionsvägar 2.
De flesta av våra uppgifter om DDR kommer från studier med DSB. Detta är till stor del på grund av tillgängligheten av teknik för att införa pauser, inklusive sekvensspecifika raster, i genomiskt DNA i levande celler 3. Dessutom, propensity pauser för att framkalla härdar av DDR proteiner, som kan visas genom immunofluorescens, har varit till stor hjälp för att identifiera kinetiken och krav svara proteiner. En av de viktigaste teknikerna för att studera DDR infördes av Bonner och kollegor, som använde en laserstråle för att rikta en rand av DSB i en "Region of Interest" (ROI) i kärnan av levande celler 4. I själva verket skapade de en lång fokus vilka proteiner i DDR kunde identifieras genom immunofluorescens. Detta illustrerades av sin demonstration av den starka rand av fosforylerad histon H2AX (γ-H2AX) i laser exponerade celler. Sedan dess har laser tillvägagångssätt använts i ett flertal studier av DDR inducerade av DSB. Även kraftfulla och populära, och källan till dramatiska immunofluorescens bilder, bör det noteras att laserintensiteten i de flesta experiment justeras för att åstadkomma observer resultat, utan oro för skada identitet,densitet, eller avståndet. I själva verket kan det vara svårt att göra dessa beräkningar. De är således till stor del ignoreras, trots mångfalden av lesioner som införs i DNA genom lasrar 5. Detta bidrar till de många motsägelser i litteraturen 6.
I motsats till DSBs, de flesta kemiska modifikationer av DNA som inte stimulera bildandet av diskreta foci av DDR-proteiner. Detta är viktigt med tanke på vår nuvarande förståelse av skada frekvenser. Det har uppskattats att humana celler i odling ådra så många som 50 DSB per cellcykeln, bildade i stort sett under S-fas 7, 8, 9. Färre är formade i icke-prolifererande celler. Detta står i kontrast med antalet nukleobas förluster eller modifierings händelser, som i de tiotusentals per cell / dag 1, 10. Således vet vi mest omDDR induceras av händelser som är relativt sällsynta, och mycket mindre om de som induceras av spiral snedvrida skador som sammanlagt är betydligt vanligare.
För att ta itu med frågor om det cellulära svaret på Kovalenta modifieringar av genomiskt DNA, ville vi arbeta med en helix förvränga DNA-addukt som hade inneboende DDR induktionsaktivitet. Dessutom för att underlätta experimentell design och tolkning vi var intresserade av en struktur vars inledning kunde kontrolleras med avseende på tid och var mottagliga för visualisering. Således har vi utvecklat en strategi baserad på psoralen. Psoralener är väl karakteriserade fotoaktiva DNA-interkalatorer som gynnar 5' TA: AT webbplatser. Till skillnad från andra tvärbindningsmedel, såsom kvävesenaper och mitomycin C (MMC) de är inte DNA reaktiva såvida exponeras för långvågig UV (UVA) ljus. De inskjutna molekyler reagerar med tymin baser på motsatta strängar för att producera spiral snedvrida interstrand tvärbindningar (ICLs) 11. Med trimetyl psoralen som används i våra experiment de flesta produkterna är ICLs, relativt få monoaddukter genereras (mindre än 10%) 12 och intrastrand tvärbindningar mellan intilliggande baser på en sträng inte är bildade. Eftersom de är kraftfulla block till replikation och transkription, psoralen och andra tvärbindningsmedel, såsom cis-platina och MMC, används ofta i kemoterapi. Sålunda psoralen aktiverade studier som följde aktiveringen av DDR genom en spiral förvränga struktur, och även anordnade insikt i den cellulära responsen till en förening med klinisk betydelse.
Vi syntetiserade ett reagens i vilket trimetyl psoralen var kopplat till digoxigenin (DIG), en växtsterol som inte finns i däggdjursceller och används ofta som en immunotag. Kravet på fotoaktivering medger lokalisering av laserljus (365 nm) av psoralen ICLs i definierade ROI i kärnor i levande celler. Dessa kan visas genom IMMunofluorescence mot Dig taggen. DNA-reparation och DDR-proteiner dök upp i ränder av laser lokaliserade ICLs 13, 14.
DDR aktiveras av de höga laserintensiteter används för att producera DSB skulle kunna bero på isolerad eller klustrade skada 15, 16. Följaktligen relevansen av resultaten från dessa experiment för att naturligt förekommande lesioner, närvarande vid mycket lägre koncentration, är osäkert. Att ta itu med liknande frågor om psoralen addukt frekvens och avstånd i DNA, tog vi fördel av DNA-fiberteknologi 17 och immunoquantum prickar. Kvantprickar är mycket ljusare än fluorescerande färger och inte bleks av exponering för ljus. De är således ofta för enda molekyl avbildning 18, en tillämpning för vilken fluorescerande färgämnen är otillräckligt ljus. Individuella DNA fibrer kan sträckas på glass diabilder och kan visas genom immunofluorescens mot nukleosidanaloger inkorporerade under inkubationer före cellskörd. Vi behandlade celler med Dig-psoralen och exponeras ROI till lasermikro bestrålning. Fibrer framställdes från cellerna och enskilda gräver-psoralen addukter kunde visualiseras med immunoquantum prickar. Exponering av cellerna för nukleosidanaloger under relativt korta tider (20-60 min) möjliggör visning av replikerings skrifter i närheten av laser lokaliserad ICLs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Dig-TMP
- Blanda 50 mg (0,18 mmol) 4'-klormetyl-4,5' , 8-trimetylpsoralen och 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en torr 25 ml rund -bottom kolv under kväve. Lägga 10 ml toluen och återflöde i 12 h. Avlägsna lösningsmedlet i en rotationsindunstare under reducerat tryck.
- Rena återstoden med flash-kolonnkromatografi över silikagel. Eluera kolonnen med kloroform, metanol och 28% ammoniaklösning (9: 1: 0,5). Indunsta lösningsmedlet i en rotationsindunstare under reducerat tryck, och återvinna den rena 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometyl-4,5', 8-trimetylpsoralen som en blekgul viskös flytande.
- Blanda 5,5 mg (0,012 mmol) 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometyl-4,5', 8-trimetylpsoralen med 5 mg (0,008 mmol) digoxigenin NHS-ester i en torr rundbottnad kolv under kväve. Lägga 0,5 ml vattenfri dimetylformamid (DMF) end 3,4 mikroliter av trimetylamin och rör om vid 50 ° C under 18 timmar.
- Avlägsna lösningsmedlet i en rotationsindunstare under reducerat tryck.
- Lös återstoden i en minimal mängd diklormetan. Applicera lösningen i 2 | il fläckar horisontellt över botten på en preparativ tunnskiktsplatta med kiselgel som en stationär fas. Köra preparativ TLC i kloroform: metanol: 28% ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1).
- Maskera plattan med undantag för de vertikala kanterna och identifiera bandet av produkten med kort våglängd UV 254 nm lampa. Skrapa produkten från plattan med en spatel och isolera den rena produkten med användning av kloroform: metanol: 28% ammoniumhydroxid (8: 1: 0,1) blandning.
- Avlägsna lösningsmedel i en roterande indunstare under reducerat tryck. Upplösa kvarvarande pellets i en ml 50% EtOH: H2O, dispensera i 50 mikroliter alikvoter i 1,5 ml rör (~ 20 alikvoter) och torka i en centrifugalindunstare tills allt lösningsmedlet indunstas (~ 3 h).
- Återupplösa varje alikvot i 200 mikroliter av 50% EtOH: H2O och torka igen i en centrifugindunstare. Upplösa varje alikvot igen i 200 mikroliter av 50% EtOH: H2O, torka i en centrifugal förångare och lagra pellets vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- För användning, upplösa pelleten i 50 mikroliter av 50% EtOH: H 2 O. Förbered en 1: 100 spädning av det upplösta Dig-TMP i H2O och mäta OD vid 250 nm. Extinktionskoefficienten för Dig-TMP är 25 tusen. Lösningen är stabil i ungefär en månad vid förvaring vid -20 ° C. Kontrollera koncentrationen genom att mäta OD vid 250 nm före varje användning.
- Beräkna lager koncentration: Abs x 100 x 10 6/25 tusen = koncentration (i ^ M). Typiskt förrådslösningen är ca 3 mM. Det är viktigt att vara i detta intervall för att minimera volymen av EtOH till mediet.
2. Laser Lokaliserade Dig-TMP ICLs
- PeR formlaserlokalisering med ett konfokalt mikroskop med en SRS kvävelaser (337 nm) pumpades genom en färgämnescell emitterande en linje av 365 nm och bränning 3 ns pulser vid 10 Hz, med en effekt på 0,7 nW.
- Göra ett vertikalt märke på sidan av en 35 mm glas botten cellodlingsskål med en märkpenna. Repa ett kors i mitten av glaset på odlingsytan med en diamantpenna, så att den svart band på sidan av skålen är på toppen av en arm av korset. Korset markeras på tillväxtytan av glaset, så att det och cellerna kommer att vara i samma fokalplan.
- Sterilisera plattan efter märkning med en sköljning av 70% EtOH. Torra innan plätering celler.
- Platt celler (vanliga laboratoriestammar såsom HeLa eller U2OS) i tvär märkta odlingsskålar en eller två dagar innan. Cell bör aktivt dela och 50-70% sammanflytande på dagen för experimentet. Inkubera 24 h med 1 ^ M 5-klor-2-deoxiuridin (CldU) att likformigt etikett DNA.
- Lägg tillDig-TMP i 50% EtOH: H2O till cellodlingsmediet till en slutlig koncentration av 20 pM. Bringa mediet till 37 ° C. Ändra mediet över cellerna och plats i inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 30 min för att tillåta Dig-TMP till jämvikt.
- Medan cellerna inkubera, fastställa x / y-koordinaterna för synfältet i vilken lasern är aktiv. Följ tillverkarens kalibreringsförfarande i vilket lasern riktas av programvaran för att etsa en speglad glasskiva längs en horisontell och diagonal linje. De två linjerna definierar gränserna för det område där lasern kan slå ett mål.
- Placera plattan i miljökammaren, vid 37 ° C med kontrollerad CO 2 och fuktighet, på mikroskop scenen och fokus med 60X olja mål på skärningspunkten mellan korset.
- Rikta den 365 nm laserstråle till en ROI, etablerad av forskaren med formen verktyget i mjukvaran, för att bilda en rand av 3 &# 181; mx 0,6 um. Konturerna av ROI är lämnade av markören i kärnorna i celler belägna i den omedelbara närheten av korsningen av korset. Justera z fokalplanet att rikta lasers halvvägs in i kärnan. Använd en laser i intervallet 350-370 nm. 405 nm lasrar kan inte framkalla tvärbindningar 19.
OBS: Vi lokalisera ROI i nucleoplasmic områden utanför nukleolerna, som kan särskiljas från nukleoplasman i differentialinterferenskontrast (DIC) avbildning. - Kontrollera fokus och aktiviteten hos lasern genom ökning av effektinställningen till en nivå som är tillräcklig för att utplåna en cell (cellen kommer att mörkna och sedan försvinner). Detta är ett viktigt diagnostiskt för en obehindrad ljusbana för lasern genom mikroskopet och sedan genom täckglas och in i cellerna.
- Sänk effektinställningen till precis tillräckligt för att aktivera psoralen och ICL inducerade DDR (detta måste bestämmas empiriskt för varje laser / mikrofonroscope kombination). Använda en laserintensitetsinställning (1,7% här) som inte aktiverar DDR i frånvaro av psoralen (övervakas genom bildning av γ-H2AX).
OBS: Detta är en viktig bestämning och inställningarna kan behöva justeras, om laserkällan eller en komponent i strålgången ändras. Följa ackumuleringen av GFP-märkt reparationsproteiner såsom XPC eller FAN1, vilka båda är snabbt rekryteras (i sekunder) till laser psoralen ränder, men inte till ROI utsätts för lasern ensam. Vissa proteiner i DDR visas inom några sekunder, medan flera minuter kan behövas för andra. Det är nödvändigt att utföra tidskursbestäm för varje protein av intresse. Vi noterar också att i celler som inte exponerats för laser det inte finns några ränder svara proteiner.
- Sänk effektinställningen till precis tillräckligt för att aktivera psoralen och ICL inducerade DDR (detta måste bestämmas empiriskt för varje laser / mikrofonroscope kombination). Använda en laserintensitetsinställning (1,7% här) som inte aktiverar DDR i frånvaro av psoralen (övervakas genom bildning av γ-H2AX).
- Efter alla celler i ett fält har riktat flytta plattan till ett nytt fält, bor nära korsningen av korset.
- I experiment utformade för att DeTermine fördelningen av inter lesion avstånden exponera cellerna för lasern i 20-25 fält (4-5 celler / fält) runt korsningen. För att analysera replikeringsmönster i närheten av de lokaliserade ICLs inkubera celler med 10 | iM 5-jodo-2-deoxiuridin (IdU) efter laser bränning.
OBS: Tiden för inkubation med IdU är något godtyckligt. Vi har använt så kort som 20 minuter och så länge som 60 min (se nedan). Längre pulser (några timmar) resulterar ofta i multipla replikering skrifter koalescerande, därmed förlora möjligheten att bilden utvecklingen av enkel gafflar. I vissa experiment ces är märkta med CldU för 24 h för att likformigt etikett DNA före exponering för Dig-TMP, följt av pulsmärkning av replikationsvägarna.
3. Skörd av celler och Sträckning av DNA Fibrer
- Avlägsna plattan från scenen, avlägsna mediet och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS-lösningen. Placera en 10 mikroliter droppe av en kommersiell trypsin/ EDTA-lösning på skärningspunkten mellan korset i mitten av glasytan.
- Inkubera under 3-4 min vid rumstemperatur (RT) och sedan dra den trypsinlösning med de lösgjorda cellerna in i pipettspetsen. Det finns ingen anledning att neutralisera trypsin.
- Placera droppen av trypsin / EDTA med cellerna vid en ände av en silaniserad glasmikroskopskiva. Lyserar cellerna och frisätta DNA genom tillsats av 10 mikroliter av 0,5% SDS-lösning och inkubera under 3-4 min vid RT blanda försiktigt med pipettspetsen, vilket gör att periferin av poolen för att torka.
- Luta slide 20º och låta vätskan rinna ner till slutet. DNA-fibrer är förlängda / sträcks av de hydrodynamiska krafterna hos den strömmande vätskan. Låt objektglasen lufttorka (~ 10 min) och fixera i 3: 1 metanol / ättiksyra under 10 min. Ta bort objektglasen från fix-lösning och lufttorka igen. Vid denna punkt kan de lagras på obestämd tid i 70% EtOH vid -20 ° C. Vid avlägsnande från 70% EtOH låt lufttorka innan next steg.
- Tvätta objektglasen i PBS, och sedan denaturera i 2,5 M HCl under 1 h vid RT. Denna behandling depurinates DNA som de inkorporerade halogenerade nukleobaser tillgängliga för antikroppar.
- Neutralisera glasen i 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Tvätta två gånger i PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) under 5 min vardera.
- Blocket glider med 5% bovint serumalbumin (BSA) och 10% getserum i PBS. Täcka glasen försiktigt med en parafilm för att sprida den blockerande lösningen jämnt över sliden och inkubera under 1 h vid RT.
- Pipettera 100 | il av en: 200 spädning i blockeringslösning av rått-anti-bromdeoxiuridin (specifikt detekterar CldU) primär antikropp till varje objektglas. Täcka glasen försiktigt med en parafilm för att sprida utspädningen jämnt över sliden och inkubera i en fuktkammare under 1 h vid RT. Ta bort parafilm och tvätta bilderna tre gånger i PBST i 5 minuter vardera.
- Pipettera 100 | il av utspätt (1: 100) get-anti-rått-Alexa Fluor 647 i blockeringslösning till varje objektglas. Täckglider försiktigt med en parafilm och inkubera i 45 min vid RT. Tvätta bilderna tre gånger i PBST i 5 minuter vardera.
- Pipettera 100 | il av utspätt (1:40) mus-anti-bromdeoxiuridin (detekterar LDU och CldU Denna dubbla specificitet nödvändiggör blockeringen av CldU av rått-anti BrdU i den tidigare inkuberingen.) Primära antikroppen och kanin-anti-DIG-antikropp (1: 200 ) i blockeringslösning till varje objektglas. Täcka glasen försiktigt med en parafilm och inkubera i en fuktkammare under 1 h vid RT. Tvätta bilderna tre gånger i PBST i 5 minuter vardera.
- Pipettera 100 | il av utspädda (1: 100) get-anti-mus-Alexa Fluor 488 andc (1: 5000) get-anti-kanin-sond (t.ex. Qdot 655) i blockeringslösning till varje objektglas. Täck glider försiktigt med parafilm och inkubera under 45 minuter vid RT. Tvätta bilderna tre gånger i PBST i 5 minuter vardera.
- Dränera överskott PBST på en pappershandduk. Tillsätt 50 pl av antifad monteringsmedium på varje objektglas och täck med ett täckglas. Bild eller butik förinte mer än 48 h vid -20 ° C.
4. Fiber Imaging genom fluorescensmikroskopi
- Utföra bildinsamlande genom ett 63x objektiv på ett inverterat mikroskop med en bifogad fullt motoriserade filterhjul med FITC, Cy5 och Q Dot 655 detektering. Den excitationsfilter är 425 nm och emissionsfiltret är 655 nm med 20 nm centrerade vid emissionstoppen 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laser lokaliserade Dig-TMP (Figur 1A) ICLs kan visas genom immunofluorescens mot Dig-tagg kopplad till psoralen. Även om lasern kan riktas att slå i ett område i varje kontur, band inte är "naturliga" former i celler, och legitima signaler kan lätt särskiljas från artefakter på grund av icke-specifik bindning av primära eller sekundära antikroppar. Den här funktionen är användbar när man använder antikroppar som är mindre än perfekt specificitet. Ett exempel på den välkända markör för DDR, γ-H2AX, i en rand av Dig-TMP ICLs visas i figur 1B.
Den immunofluorescens av Dig taggade lesioner i laser ränder inte tillåter några slutsatser om frekvensen och avståndet mellan addukter. För att göra denna bestämning celler inkuberades med CldU för 24 h före införandet av de ICLs. Färgningen mot the CldU medger visualisering av Dig taggade lesioner på långa fibrer och ger tydligare fibermönster än direkta fläckar såsom DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) eller YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetrametyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-metylbenso-1,3-oxazol-2-yl) metyliden] -l, 4-dihydroquinolinium] -tetrajodid}. Efter införande av ICLs genom laserfotoaktivering, var fibrerna sprids från de målsökta cellerna. Analysen av Dig signalerna på fibrerna, såsom de som visas i figur 2 avslöjade att de inter ICL avstånden varierade från mindre än 10 kb till större än 160 kb, såsom beskrivs i vår nyare publikation 21. Det fanns inga bevis för klustrade addukter. Således av remsan av Dig-tagg, och ackumuleringen av de DDR proteiner i band, återspeglade närvaron av väl separerade lesioner, åtminstone mätt längs den förlängda DNA: t. Betraktas i termer av cellulär kromatin om ICLs bildade i nukleosomala arrayer, med en 6faldig kompression av förlängd DNA-längd, skulle de fortfarande vara åtskilda av motsvarande cirka 1,6 kb av DNA.
Experiment terar laserinducerad DNA-skada följer generellt induktionen av DDR. Dessa experiment sällan sysslar med frågor om DNA-replikation. Å andra sidan, är DNA-fiber analyser som typiskt används för studier av replikation. Exponering av celler för korta pulser av halogenerade nukleosidanaloger resulterar i deras införlivande i DNA. Immunofluorescensanalys av DNA fibrer avslöjar områden av inkorporerade analoger representerar nyligen DNA-syntes. Det var av intresse att fråga om DNA-replikation inträffade i lasern lokaliserade ICL ränder, och i så fall vad skulle vara mönstret för replikering i närheten av ICLs? Celler inkuberades under 24 timmar med CldU för att underlätta visning av långa fibrer. Laser lokaliserad ICLs infördes i celler följt av en 1 h puls av IdU. DNA f ibers framställdes från målcellerna och Dig taggade ICLs och replikeringsvägarna som visas. Resultaten visade att laseraktivering av psoralen inte stängs av replikation eller påverka den totala frekvensen av replikeringsmönster. Replikation inträffade på en sida, och även på båda sidor av de ICLs, med de dubbelsidiga mönster i en 4: 1 majoritet som vi nyligen har visat 21.
Figur 1: Generering av Laser Lokaliserade Dig-TMP ICLs. (A) Struktur av Dig-trimetyl psoralen. (B) Ackumulering av γ-H2AX (grön) i ROI-innehållande laser lokaliserade ICLs (DIG, röd). Kärnan är färgade med DAPI (blå). Den bright Bilden visar en cell delvis på märket som gjorts av diamant penna. Notera nukleolerna och placeringen av ROI utanför dem.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DNA-Fibrer med Laser Lokaliserad Dig-TMP Signaler. (A) Celler inkuberades under 24 h med CldU att märka DNA. Sedan laser lokaliserad ICLs infördes och (B) skördades cellerna och fibrerna sprids. (C, D) De Dig signalerna visades med en immunoquantum punkt (röd) och CldU genom immunofluorescens (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laserlokaliseringsteknik kräver användning av fastsittande celler med kärnor som är synliga i starkt fält mikroskopi. Vi har försökt att fästa icke-adherenta celler, såsom primära lymfocyter, eller löst vidhäftande odlade celler, såsom AD293, vid glasytan med cellklisterberedningar såsom polylysin eller kollagen, eller mer komplexa blandningar. Även om dessa behandlingar kan binda cellerna till ytan, finner vi att de i allmänhet hålla rundade vilket gör det mycket svårt att fokusera i kärnorna. Dessutom cellerna misslyckas ofta med att överleva den första tvätt efter avlägsnande av tillväxtmediet. Men inom kravet på fastsittande celler, har vi framgångsrikt använt ett brett sortiment av standard cellinjer liksom primära celler för dessa studier. Det är nyttigt att testa celler för förorening mykoplasma. Vi finner att cellsvar ändras genom dessa infektioner.
Fokalplanet hos lasern är viktig. Målet är attplacera ICLs inom kärnan. För hög och den fotoaktivering kommer att ligga över kärnan; för lågt och det kommer att vara på glaset. Vi tycker att det är lämpligt att skärpa fokus för DIC bilden i skärningspunkten mellan cytoplasman och kärnan.
Fiber analyserna är inte svårt, men kräver lite övning innan tolkningsbara fält återvinns. Det är viktigt att genomföra denna teknik på rätt sätt. Antalet celler utvunna från laser experimenten är låg och varje prov används i sin helhet på en enda bild. Följaktligen är det viktigt att maximera utbytet från varje experiment, som prover inte kan delas, med alikvoter sparas för senare analys. Däremot kan hundratals evenemang återvinnas från ett enda prov. Två funktioner i förfarandet är av central betydelse. En är flödet av cellysatet ner bilden. Om alltför snabbt, kommer en stor del av DNA rinna av bilden. Kvaliteten på objektglas är också kritisk. Vi ibland ReceIve partier som är ineffektiva. Följaktligen varje nytt parti måste testas före användning.
Som är sant för alla laboratorie manipulationer tillförlitligheten kommersiella reagens-antikroppar, immunoquantum prickar, osv, är alltid ett bekymmer. Det är inte alltid stabila och experimentell misslyckande är oftast spåras till problem med ett eller annat reagens. De immunoquantum punkter är särskilt problematiska och mer än en del kan behöva testas för att identifiera en som är acceptabelt. Ineffektiva partier är markerade med höga bakgrundssignaler. Dessa är inte förknippade med fibrer och kommer att ses på områden i bilden som inte har någon DNA.
Användningen av laser för att införa lokal DNA-skador har blivit mycket populär eftersom den infördes av Bonner Grupp 4. I dem, och de flesta efterföljande experiment energiinställningarna laser är inställda för att inducera DDR direkt. Vi har använt en effektinställning tillräckligt låg SUCh att aktiveringen av DDR är beroende av både laser och psoralen. Som diskuterats ovan, avståndet mellan psoralen addukter hävdar att vi tittar på svaret på enskilda händelser. Medan antalet ICLs som är bildade av endogena tvärbindningsmedel inte är känd, noterar vi att lokalisering av psoralen addukter inte dödar cellerna, eftersom de är i stånd att avlägsna de psoralen addukter inom 6-8 h (opublicerade data) och är närvarande och friska 24 timmar senare. detta tillvägagångssätt är således mycket mindre toxiska för celler än protokoll som kräver exponering för medel som inför DNA-skada i hela kärnan och mitokondrier.
Lasern / psoralen kombination införa en helix förvränga struktur som aktiverar DDR. I detta avseende de resultat som erhållits från denna metod kan tillämpas på en rad olika helix snedvrida lesioner, med tanke på den kaskad naturen av DDR, efter aktiveringen av ATM / DNAPK / ATR kinaser 22.I detta avseende skulle kunna utvidgas DNA fiber tillvägagångssätt som beskrivs här till alla DNA-struktur som kan detekteras genom immunologiska eller kemiska eller biokemiska medel som kan visas genom fluorescens. Dessa kan innefatta UV-fotoprodukter 23, skrymmande alkylatorer 24, G quadruplexes 25, och oxidativa lesioner 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av Intramural forskningsprogram NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) och fanconis anemi Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
- Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
- Aguilera, A., Garcia-Muse, T.
- Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).
- Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
- Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
- Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).
- Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
- Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
- Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
- Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
- Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
- Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
- Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).
