Summary
Çapraz bağlantılı fare iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için filtrasyon tabanlı bir protokol sunuyoruz ki, ultra-santrifüj ihtiyacını ortadan kaldırdık ve kolay uygulanabilir hale getirdik. Çekirdeklerden hazırlanan kromatin, kromatin immünopresipitasyonu ve muhtemelen kromatin immünopresipitasyon sıralama çalışmaları için uygun olduğunu göstermektedir.
Abstract
Kromatin immüno çökeltme (ChIP), kromatin DNA'ya bağlanan proteini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Bununla birlikte, fibreden zengin iskelet kası, yüksek kaliteli çekirdeklerin miyofibrillerin en az kirletilmesiyle izole edilmesindeki teknik zorluk nedeniyle ChIP için bir zorluk olmuştur. Önceki protokoller, çekirdeği çapraz bağlamadan önce arıtmaya çalışmış ve bu da uzun çekirdek hazırlama işlemi sırasında değişmiş DNA-protein etkileşimi riskini doğurmuştur. Mevcut protokolde, önce farelerden toplanan iskelet kas dokusunu çapraz bağladık ve dokular kıyılmış ve sonike edildi. Çoğaltılmış kas dokusu kullanarak çekirdekleri miyofibrillerden ayıramadığını buldukumuzdan, önemli miyofibril kontaminasyonu olmayan yüksek kaliteli çekirdekler elde etmek için ardışık bir filtrasyon prosedürü geliştirdik. Daha sonra bir ultrasonatör kullanarak kromatin hazırladık ve anti-BMAL1 antikoru ile yapılan ChIP analizleri, sirkadiyen bağlanmayı sağlamıştırBMAL1 modelinin gen promoterlerini hedeflemesi. Bu filtreleme protokolü, yüksek kaliteli çekirdekleri çapraz bağlı iskelet kası dokusundan izole etmek için kolayca uygulanabilir bir yöntem oluşturur ve sirkadiyen ve zamana duyarlı diğer çalışmalar için tutarlı örnek işlenmesine izin verir. Yeni nesil sıralama (NGS) ile birlikte, yöntemimiz iskelet kası fonksiyonuna odaklanan çeşitli mekanik ve genomik çalışmalar için kullanılabilir.
Introduction
İskelet kası fizyolojide ve davranışta önemli rol oynamaktadır. Çok çekirdekli kas lifi, aktin ve miyozinin kasılma kuvveti oluşturmak için sarkomerler denilen işlevsel birimleri oluşturduğu miyofibrillerden oluşur. İskelet kası aynı zamanda vücudun en büyük metabolizma organıdır, postprandial glikoz alımının>% 80'ini ve insülin tepkisini ve metabolik homeostazı düzenleyen 1 , 2'yi hesaplar. Kas fizyolojisi ve metabolizması sirkadiyen saat, 3 , 4 , 5 , 6 nispi biyolojik zamanlayıcı tarafından yakından düzenlenir. Örneğin, çekirdeğin sirkadiyen saat bileşenlerinden biri olan Bmal1'in iskelet kasına özgü silinmesi, iskelet kasında insülin direnci ve glukoz alımını azalttı ve hayvanlarda tip 2 diyabet 7 geliştiği bulundu. benAyrıca, iskelet kası, sistemik metabolizma ve fizyolojiyi düzenlemek için mokinleri salgılayan bir endokrin organ 8 olarak giderek daha fazla takdir edilmektedir. İskelet kasında bu düzenleyici işlevleri tam olarak anlamak için mekanik çalışmalara ihtiyaç vardır.
ChIP, DNA bağlayıcı proteinlerin hızlandırıcı alımını tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. ChIP başlangıçta kromatin DNA 9 , 10'daki nükleozom organizasyonunu tanımlamak için geliştirildi. O zamandan beri çeşitli yöntemlerin, formaldehit, dimetil sülfat veya mor ötesi ışınlama (UV) 11 , 12 kullanarak proteinleri ve kromatin DNA'yı çapraz bağladığı bildirildi. Formaldehit çapraz bağlanma, kromatin yapısını koruyan ve DNA-protein etkileşimlerini koruyan en yaygın yöntemdir ( 9 , 13 , 14) . Çapraz bağlı kromatografiSonication tarafından parçalanmış ve ilgilenilen belirli DNA bağlama proteinine karşı antikor ile immüno-çökeltilmiş 15 , 16 . Son yıllarda, genom çapında transkripsiyon faktörü bağlama 17'yi sorgulamak için ChIP'i NGS ile birleştiren bir yöntem olan ChIP sıralama (ChIP-sequ) geliştirildi ve bazı durumlarda bir süre içerisinde dinamik değişiklikleri izlemek için 18 , 19 , 20 . Örneğin, sirkadiyen ChIP-seq çalışmaları, sirkadiyen saat bileşenlerinin ve histone belirteçlerinin genomik olarak bağlanmasını düzenleyen, ~ 24 saatlik döngüsel döngü 18 boyunca geçici gen ifadesini sürükleyen, oldukça düzenlenmiş bir dizi ortaya koymuştur.
Çoğu mevcut ChIP protokolleri yumuşak dokular ( örneğin karaciğer, beyin vb. ) Için tasarlanmıştır ve skele dahil olmak üzere sert dokular için çok az yayınlanmıştırKas kas. Fiberle zengin iskelet kasını homojenize etmek ve özellikle çapraz bağlanmayı gerektiren ChIP deneyleri için yüksek kaliteli çekirdekleri 21 izole etmek teknik açıdan zorlayıcı bir işlemdir. Yeni bir kas ChIP çalışmasında22, uydu hücreleri miyofiberlerden ayrılmış ve çekirdekler, doku sindirimini içeren uzun bir prosedür aracılığıyla her iki hücre tipinden hazırlanmıştır. İzole edilmiş çekirdekler üzerinde formaldehit çapraz bağlanmadan önce tüm işlemin tamamlanması yaklaşık üç saat sürdü. Bu prosedür kas dokusunu etkin homojenizasyon için daha da dirençli hale getiren ve yüksek kaliteli çekirdekler üretebilen kas lifini çapraz bağlamayı önlerken doku toplanmasından çekirdek çapraz bağlanmaya kadar olan önemli zaman gecikmesi, değişmiş DNA riskini doğurur -protein etkileşimi. Buna karşın, çoğu çalışma deneysel muamele ya da doku toplanması sonrasında gerçek zamanda DNA-proteinin korunması için çapraz bağlama gerçekleştirmiştirN bağlayıcı 12 . Çapraz bağlantıdan önce çekirdek izolasyonunun ikinci bir dezavantajı, tipik olarak 3-4 saat aralıklarla ortaya çıkan sirkadiyal örnek toplama gibi zamana duyarlı uygulamaların engellenmesidir. Çekirdeklerin çapraz bağlanması olmaksızın, izolasyonun kesilme işleminden hemen sonra ilerlemesi gerekirken çapraz bağlı numuneler, tüm zaman çizelgesi tamamlandıktan sonra birlikte işlenebilir ve böylece daha fazla deney tutarlılığı sağlanır.
Çapraz bağlanmamış iskelet kasında çekirdek izolasyonu için diğer protokoller de bildirilmiştir. İki çalışma, çekirdekleri kalan miyofibriller ve hücre öpleri 23,24'ten ayırmak için gradyan ultra-santrifüj kullandığını açıkladı. Sükroz veya koloidal gradyent ultra-santrifüj, çapraz bağlanmamış kas dokuları ile etkili olsa da, deneylerimiz, çapraz bağlamadan sonra gradyan ultra-santrifüj işlemi ile çekirdeklerin hücre d'den ayrımında başarısız olduğunu ortaya koymuşturDegrade üzerinde ebris.
Bu nedenle, çapraz bağlı fare iskelet kas dokuları kullanarak yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir prosedür geliştirdik. Degrade ultra-santrifüjden ziyade, çekirdeği enkaztan etkili bir şekilde ayırmak için seri bir filtreleme yöntemi geliştirdik. Ultrasonication işlemini takiben, kromatin örnekleri, hedef geliştiricilere bağlanan BMAL1 proteininin sirkadiyen bir modeli gösteren ChIP çalışmaları için başarılı bir şekilde uygulanmıştır. Metodumuz, kas dokularının çeşitli mekanik çalışmalarına genel olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergeleri kapsamında gerçekleştirildi ve işlemler Houston'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından onaylanmış bir hayvan protokolüne göre gerçekleştirildi.
1. Çapraz bağlı İskelet Kası'ndan Çekirdek İzolasyonu
- Yaklaşık 20 haftalık C57BL / 6 erkek farelerden izole edilen arka bacak iskeleti kasını, daha önce 22'de detaylı olarak tarif edildiği gibi buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tartın ve kıymalayın.
NOT: Genellikle bir fare ile 1.0 - 1.5 g iskelet kası alırız.- Öğütülmüş iskelet kası dokusunu, buz üzerinde 10 mL PBS içeren 50 mL'lik bir konik tüp içine yerleştirin.
- 4 dakika 300 xg'de santrifüj 0 ° C'de 5 dakika.
- Aspirasyonla PBS süpernatantını dikkatlice çıkarın.
- 1, 2, 3 ve 4 mL su bulunan referans tüpleri kullanarak her 50 mL'lik tüpteki pelet hacmini tahmin edin.
- 7 cilt ekleyin.Buz soğukluğundaki% 1 formaldehit ile PBS'de karıştırın ve bir prob dokusu homojenizatörü kullanarak buz üzerinde numuneleri homojenize edin (bkz . Malzeme Tablosu ).
NOT: İsteğe bağlı: Homojenleştirme prosedürü soğuk bir odada yapılabilir. - 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ederek numuneyi çapraz bağlayın.
- 0.125 M'lik bir nihai konsantrasyona kadar 1 M glisin ilavesiyle çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Numuneleri 4 ° C'de 5 dakika süreyle 3.000 xg'de santrifüjleyin. Yüzey aspirasyon yoluyla alın.
- Yeni eklenen proteaz inhibitörleri (0.2 mM fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) içeren 10 mL buz soğukluğunda baz tampon çözeltisi (pH 7.3'de 10 mM HEPES-KOH, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT) , Ve 10 ug / mL leupeptin). 4 ° C'de 5 dakika süreyle 3000 g'de santrifüjleyin ve süpernatanı özenle aspire edin.
- Pelet 6 mL liziz tamponu (10 mM HEPES-KOH, pTaze olarak ilave edilen proteaz inhibitörleri (0.2 mM PMSF ve 10 ug / mL leupeptin) ihtiva eden% 0.1 Tris-H 7.3, 10 mM EDTA, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT,% 1 Triton X-
- Numuneyi önceden soğutulmuş bir 15 mL Dounce homojenizöre aktarın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı havaneli 15 vuruş takiben gevşek havyar kullanarak 15 yavaş vuruş ile buz üzerinde her örneği homojen hale getirin.
- Homojenat (6 mL), hücre süzgeci (gözenek boyutu: 100 μm) boyunca filtre edin ve 4 mL liziz tamponuyla durulayın. Örnekleri 1,000 xg'de 10 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. 5 mL buz soğukluğunda baz tamponuna tekrar süspansiyon haline getirin ve çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı havan ile 10 kez atın.
- Spektrofotometre (OD260 / OD280) ile DNA konsantrasyonu ölçümü için 20 μL'lik bir kısım ve gerekirse trypan mavisi ile mikroskopik gözlem çıkarın (aşağıya bakın) ( Şekil 1 A ).
- Süspansiyonu filtrelemeBir hücre süzgeci (Gözenek büyüklüğü: 70 μm) tüpü durulayın ve tekrar yukarıdaki gibi 2 mL baz tamponu ile filtreleyin.
- Adım 1.13'te olduğu gibi filtrelemeyi yavaş yavaş azaltılmış gözenek boyutundaki (40 μm, 30 μm, 20 μm ve 10 μm) hücre süzücü ile tekrarlayın.
NOT: Toplam olarak, 6 gözenek boyutundaki süzgeçler 1.12-1.14 adımlarında kullanılmıştır. - 10 dakika boyunca 4 ° C'de 1000 g'de santrifüjleyin. Süpernatantı kaldırın ve 500 μL baz tampon pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- Yukarıdaki gibi DNA konsantrasyonunu ölçün.
NOT: Yaklaşık 200 ug nükleik DNA, her iki arka ekstremanın bir hayvandan birleştirilmesiyle elde edilmiştir. İsteğe bağlı olarak, trypan mavi boyama ile mikroskopik gözlem için 20 μL'den tasarruf edin (stok konsantrasyonu% 0.4, 1: 5 seyreltme); Çekirdekler maviye boyar ( Şekil 1 B ). - 1000 g'de 4 ° C'de 10 dakika süreyle santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Pelleti -80 ° C'de saklayın.
2. Sonication
<ol>NOT: Sonikasyon etkinliğini değerlendirmek için bir örnek Şekil 2'de gösterilmektedir.
3. Sonikasyon ve Niceleşmenin Değerlendirilmesi
- 1.0 ekle50 μL sonike edilmiş örneklere RNase A (500 U / mL RNase A: 20,000 U / mL RNase T1) ile 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 8 μL proteaz K (10 mg / mL) ilave edin ve 55 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak DNA hasat.
- 5 cilt bağlama tamponu ilave edin, spin sütununa uygulayın ve 4,000 xg, 10 dakikada santrifüjleyin.
- Pass'u aynı kolona uygulayın ve tekrar santrifüjleyin.
- Yıkama tamponuyla iki kez 13.000 xg, 1 dakika yıkayın.
- Kolonu kurutmak için tekrar 13.000 xg'de 1 dakika santrifüjleyin.
- 50 uL H 2 O ekleyin ve DNA'yı elüe etmesi için 13.000 xg'de 1 dakika santrifüjleyin.
- Pass'u aynı kolona uygulayın ve tekrar santrifüjleyin.
- Bir spektrofotometre (OD260 / OD280) ile DNA miktarını ölçün. Sonikli ürünlerin boyut ve miktarını (1 μg) değerlendirmek için% 0.8 jel üzerinde numuneler çalıştırın ( Şekil 2 ).
NOT: Ortalama kromatin verimi yaklaşık% 20'dir.
4. Çip
- Daha önce kaydedilen kromatin'i -80 ° C'de çözdürün ve kromatin miktarını tüp başına ~ 100 - 120 μg'a bölün. 1: 10'u radyoimünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x Proteaz inhibitör kokteyl (PIC),% 0.1 Na-deoksikolat W / v),% 1 Triton X-100).
- Her grupta birden fazla numune varsa, ~ 100-120 μg / numunenin son miktarına eşit miktarda kromatin DNA'sı birleştirin. Girdi olarak% 10 tasarruf edin.
- BSA ön bloke edilmiş (~ 2 saat, 4 ° C) Protein A / G agarozu (tavuk olmayan antikor) veya IgY boncuklarını (Tavuk antikoru) 40 μL (RIPA tamponunda% 50 v / v bulamaç) ilave edin ve 4 ° C'de 3 saat rotator.
- 1,000 xg'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni tüplere dikkatle aktarın.
- 1 μg antikor başına antikor ekleyin25 - 100 μg kromatin DNA.
- Yaklaşık 15 rpm'de gece boyunca 4 ° C'de nazikçe döndürün.
- 10 μL BSA ön bloke edilmiş (~ 2 saat, 4 ° C) Protein A / G agarozu (tavuk olmayan antikor) veya IgY boncuklarını (Tavuk antikoru) karıştırın ve 2 saat boyunca soğuk odada döndürün.
- Boncukları aşağıdaki gibi yıkayın. 1 mL RIPA tamponu ile 3 kez yıkayın, 1 mL yüksek tuzlu tampon (20 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF,% 1 Triton X-100) ile 3 kez iki kez yıkayın , 1 mL LiCl tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF,% 1 Na-deoksikolat,% 0.5 NP40) ile 3 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- 1 mL Tris-EDTA (TE) tamponu (10 mM Tris-HC1 (pH 7.4), 1 mM EDTA) ile 3 dakika bir kez yıkayın. Sonra elüsyon tamponu (20 mM Tris-HC1, 5 mM EDTA ve% 0.5 SDS) ile DNA'yı elute edin.
- 1000 g, 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Boncuğu 50 uL elüsyon tamponu ile tekrar süspanse edin.
- 10 için kuluçkaya yatırınMin, 65 ° C'de.
- 5 dakika süreyle 12.000 g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın, 5 mL daha 12,000 g'de bir kez daha 50 μL ekleyin ve santrifüjleyin. Nihai elüsyon hacmi 100 uL olacaktır.
- Ters çevrilen çapraz bağlama ve DNA elüsyonu.
- Eriyen kromatin gece boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
- 1.0 uL RNase A ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 8 μL proteaz K (10 mg / mL) ilave edin ve 55 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Üreticinin protokolüne göre 50 μL'de elüsyon hacmi olan bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı hasat edin.
- Profilleri daha önce 25 , 26 açıklandığı gibi Gerçek Zamanlı qPCR ile analiz edin.
NOT: Primer dizileri Şekil 3 Efsane'de listelenmiştir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur ( Şekil 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gerçek zamanlı DNA-protein etkileşimini korumak için doku toplanmasının hemen ardından formaldehit çapraz bağlandı. Bununla birlikte, çekirdek izolasyonu 23 , 24 için yaygın olarak kullanılan sükroz veya koloidal gradyan, çekirdeklerin miyofibrillerden ayrılmasında etkili olmadığını bulmuştur (veriler gösterilmemiştir). Bunun nedeni, çekirdek ve miyofibriller için çapraz bağlantının benzer ağırlık çekimine neden olabileceğidir. Bu nedenle, çekirdek fraksiyonundan büyük miyofibriller ve diğer pislikleri etkili bir şekilde gidermek için bir seri filtreleme işlemi geliştirdik. 100 μm filtrasyondan sonra hala büyük doku kalıntıları ve miyofibriller vardı ( Şekil 1A). Buna kıyasla, sıralı filtrasyonun sonunda, büyük doku kalıntılarının, sağlam hücrelerin ve büyük miyofibriller çoğunluğu başarılı bir şekilde çıkarıldı ( Şekil 1 B ).
27 veya fare embriyonik fibroblast (MEF) 28 gibi bazı dokular için sonikasyonu iyileştirirse de, tecrübelerimize göre iskelet kas çekirdeğinin sonikasyonuna müdahale ederek geniş bulaşmaya neden olduğunu belirtti Etkisiz sonication. SDS liziz tamponunda süspansiyon haline getirildikten sonra mevcut protokolü hemen sonikasyon ile kullanarak, kromatin ile etkili sonikasyonun yavaş yavaş döngüye bağımlı bir şekilde parçalandığını ve nihayetinde ~ 500 bp'lik DNA fragmanları ürettiğini gördük ( Şekil 2 ). Liziz tamponunda ön inkübasyon, sonikasyon verimliliğini belirgin şekilde tehlikeye attı.
KonuşmakChIP için kromatin hazırlama kalitesini sağlamış olarak, sırasıyla 18 , 29 Zeitgeber zamanı (ZT) 6 ve ZT18'de bağlanma zirvesi ve çukurluğu gösteren sirkadiyen transkripsiyon faktörü BMAL1'in DNA bağlanmasını inceledik. C57B / 6J farelerinden gelen iskelet kası örnekleri ZT6 ve ZT18'de toplandı ve kromatin numuneleri yukarıdaki gibi hazırlandı. Kısaca, sonikasyondan sonra rendelenmiş kromatin numuneleri, BSA ile önceden bloke edilmiş olan IgY boncukları ile önceden temizlenmiş ve ardından anti-BMAL1 antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilmiştir. Kromatin çıkartıldıktan ve saflaştırıldıktan sonra, iki hedef gen olan Nr1d1 ve Dbp 30'un E-Box elementleri üzerindeki BMAL1 bağlanmasını tespit etmek için RT-qPCR uyguladık . BMAL1'in ZT6'daki E-kutu elemanlarına ve ZT18'de minimal bağlanma ( Nr1d1 : 0.452 ± 0.022'ye karşı 0.039 ± 0.002, Dbp -0.4: 0.627 ± 0.013 ve 0.062 ± 0.009, Dbp'ye sağlam bir şekilde bağlandığını saptadık+0.8: 0.176 ± 0.013, 0.008 ± 0.001, Dbp +2.4: 0.466 ± 0.010 ve 0.122 ± 0.014; Tüm değerler ortalama ± SEM'dir ( Şekil 3 ), iskelet kasında zamana duyarlı transkripsiyon faktörü bağlanma analizi için protokol geçerliliğini taşır.
Şekil 1 : Sıradan Filtrasyon Etkili Olarak Çıkarılan Doku Döküntüsü. (A) 100 μm filtreden sonra örnekleri gösteren temsili resimler. Büyük doku ve lif döküntüleri görülür. (B) Seri filtrasyondan sonra örnekleri gösteren temsili resimler. Büyük lif kalıntıları temizlendi. Yalnızca izole edilmiş çekirdekler ve küçük miyofibril parçaları izlenir. Resimler 10X, 20X ve 40X büyütmede hafif bir mikroskop kullanılarak çekildi. Ölçek çubukları sağ taraftaki panellerde gösterilir.Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Sonasyonun 10 Döngüsüyle Aşamalı Kromatin Parçalama. Sindirilmiş kromatin DNA'lı 10 döngü,% 0.8 agaroz jelinde görüldüğü gibi, ~ 500 bp'ye kadar olan sonikasyon devri, 150 V'de 60 dakika süreyle çalıştırılır. Sağ panel, buz soğukluğundaki SDS liziz tamponunda ön kuluçka işleminden sonra 1 saat daha düşük bir sonikasyon verimliliğini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
FiGure 3 : BMAL1 ChIP için Temsilci qPCR Sonuçları, ZT6 ve ZT18'de Toplanan Fare İskeleti Kas Örnekleri ile. Veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu. Dbp -0.4, +0.8 ve +2.4, Dbp genindeki E-Box elemanlarının yerlerini gösterir. NC: IgY ile negatif kontrol. BMAL1 bağlanmasının zamansal paterni, ZT618 civarında BMAL1 bağlanma pikini gösteren önceki sonuçlarla tutarlıdır. İleri ve geri primerler aşağıdaki gibidir. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG ve 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0.4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC ve 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0.8: 5'-ATGCTCACACGGTGCAGACA ve 5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2.4: 5'-TGGGACGCCTGGGTACAC ve 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için çapraz bağlı iskelet kas dokularının kullanıldığı sağlam bir yöntemi açıkladık. Çekirdekleri enkazdan etkili bir şekilde ayırmak için sıralı filtreleme yapıldı ve çanak şeklinde dönüştürücüden gelen ultrasonik akustik enerji, ChIP analizi için kromatı kesti. Sonuçlar BMAL1'in hedef promoterlere sirkadiyen zamana özel bağlanmasını gösterdi.
ChIP, çapraz bağlanma gerçekleştiğinde genomik DNA üzerinde gerçek zamanlı protein dolaşımı elde etmek için kullanılabilir. Bu potansiyelden yararlanmak için, doku diseksiyonu esnasında iskelet kasının çapraz bağlanmasına ve degrade ultra-santrifüj kullanılmadan çekirdek izolasyonunun düzene sokulmasına izin veren bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Karaciğer gibi yumuşak dokulara kıyasla lif bakımından zengin iskelet kasının homojenleştirilmesinin zor olması nedeniyle, buz gibi soğuk PBS'de kas dokusunu küçülttik ve ardından numuneyi bir formaldehit tamponunda homojenleştirdik. Sustuktan sonra, doku süspansiyonu waSantrifüj edildi ve kalan formaldehidi durulamak için buz gibi soğuk bazlı tamponla durulandı. Çekirdekler, Dounce homojenizasyonu ile serbest bırakıldı ve homojenatlar sırayla hücre öplerini ve miyofibrilleri uzaklaştırmak üzere filtrelendi. Filtrenin tıkanmasını en aza indirgeyerek verimliliği olumsuz etkileyebilecek filtrasyon dizisi tasarladık. Sıralı filtrasyon tamamlandığında çok kısa miyofibriller kaldı.
Sonication ve ChIP prosedürleri sonikasyon zamanlaması ve SDS tampon miktarı gibi değişikliklerle önceki bir rapordan 12 uyarlandı. Çanak şeklinde sonikatör, soğuk su banyosu içindeki cam şişelerde bulunan numuneler için merkezi ultrasonik dalgaya maruz kalma olanağı sağlar. Sonikatör sonda ile karşılaştırıldığında, bu sonikatör aşırı ısınmayı önlemek için numune sıcaklığını kontrol eder ve aynı zamanda numunelerin çapraz kontaminasyonunu önler. Prob sonikatörler kullanılırsa, optimal sonikasyon koşullarının ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Ayrıca,T SDS tamponu olduğundan kas kromatin verimi karaciğer 12'den daha düşüktür. Birkaç protokol 28 , 31 , 32 , sonikasyondan önce buz üzerinde veya oda sıcaklığında inkübasyonu içerir. Bununla birlikte, tecrübelerimize göre, buzla karıştırma öncesi inkübasyon sonikasyon verimliliğini artırmadı. Aslında bazı durumlarda sonikasyon tehlikeye girer. Artık myofibriller, inkübasyon ve zayıflatılmış sonikasyon etkinliği sırasında kromatin DNA'sına dolaşmış olabilir. SDS liziz tamponunda çekirdek süspansiyonundan hemen sonikasyon ile artan sonikasyon döngüleri ile aşamalı kromatin parçalanması elde etmeyi başarabildik ( Şekil 2 ).
Chip qPCR ile kromatin kalitesini doğruladık. Şekil 3'te gösterildiği gibi, BMAL1 hızlandırıcısı doluluk ZT6'da sağlamdı ve ZT18'de minimaldi, daha önce gösterilen BMAL1 circa ile tutarlıydıDian promotör bağlanması 18 . Bu fonksiyonel tahlil, çekirdek ve kromatin kalitesini doğruladı. Son yıllarda NGS'deki hızlı gelişme, ChIP-seq'in genomik bağlanmayı yüksek hassasiyetle nicel olarak sorgulayabileceği yeni bir ufuk açtı. Özellikle ChIP-seq için yüksek kalitede çekirdekler ve kromatin, protein-DNA etkileşimini tutarlı şekilde yakalamak için gereklidir. Burada açıklanan prosedür, iskelet kası kullanılarak yapılan ChIP-seq çalışmalarında değerli bir kaynak oluşturabilir. Not, ChIP-seq kütüphane hazırlık sinyal çözünürlüğünü artırmak için PAGE tabanlı boyut seçimi 18 gibi ek önlemler gerektirir.
Sonuç olarak, çapraz bağlı iskelet kasında yüksek kaliteli çekirdekler hazırlamak için filtrasyon tabanlı bir protokol geliştirdik. Kolayca uygulanabilir hale getirmek için ultra-santrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldırırız. İlgili genler için ChIP'e ek olarak, çekirdekler ve kromatin plTarif edildiği gibi, ChIP-seq çalışmalarına genel olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Karyn Esser, Nobuya Koike ve Noheon Park'a faydalı tavsiyeler için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen S.-HY'ye NIH / NIGMS (R01GM114424) ve Robert A. Welch Vakfı (AU-1731) ve NIH / NIA (R01AG045828) tarafından ZC'ye destek verildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
