Summary
我々は、超遠心分離の必要性を排除した、架橋マウス骨格筋から高品質の核を単離するための濾過ベースのプロトコールを提示し、容易に適用することができる。本発明者らは、核から調製されたクロマチンが、クロマチン免疫沈降およびクロマチン免疫沈降配列決定研究に適していることを示す。
Abstract
クロマチン免疫沈降（ChIP）は、クロマチンDNAへのタンパク質結合を決定する強力な方法です。しかしながら、繊維が豊富な骨格筋は、筋原繊維の汚染を最小限に抑えた高品質の核の単離における技術的困難のために、ChIPの課題であった。以前のプロトコールでは、架橋前に核を精製しようと試みたが、これは核形成の延長過程でDNA-タンパク質相互作用の変化のリスクを招く。現在のプロトコールでは、まずマウスから採取した骨格筋組織を架橋し、組織を細かく砕いて超音波処理した。我々は超遠心分離が架橋筋肉組織を用いて筋原線維から核を分離することができないことを発見したので、重要な筋線維汚染のない高品質の核を得るために逐次濾過手順を考案した。その後、超音波装置を用いてクロマチンを調製し、抗BMAL1抗体を用いたChIPアッセイにより、遺伝子プロモーターを標的とするBMAL1のパターン。この濾過プロトコールは、架橋骨格筋組織から高品質核を単離するための簡単に適用可能な方法を構成し、概日および他の時間に敏感な研究のための一貫した試料処理を可能にする。次世代シークエンシング（NGS）と組み合わせて、本発明者らの方法は、骨格筋機能に焦点を当てた様々な機構およびゲノム研究のために配置することができる。
Introduction
骨格筋は生理および行動において重要な役割を果たす。多核筋繊維は、アクチンとミオシンが収縮力を発生させる筋節と呼ばれる機能単位を形成する筋原繊維からなる。骨格筋は体内で最大の代謝臓器でもあり、食後のグルコース摂取量が80％を超え、インスリン応答と代謝ホメオスタシスを調節します1,2 。筋肉の生理および代謝は、内在的な時計である内在的な生物学的タイマー3,4,5,6によって厳密に規制されている。例えば、概日の主要な時計成分の1つであるBmal1の骨格筋特異的欠損は、インスリン抵抗性をもたらし、骨格筋におけるグルコース取り込みを減少させ、動物は2型糖尿病を発症することが判明した7 。私さらに、骨格筋も内分泌臓器8として評価され、全身の代謝および生理機能を調節するためにミオシンを分泌する。骨格筋におけるこれらの調節機能を完全に理解するためには、機構的研究が必要である。
ChIPは、DNA結合タンパク質のプロモーター補充を描写するための強力なアプローチである。 ChIPは、最初にクロマチンDNA 9,10上のヌクレオソーム構成を同定するために開発された。ホルムアルデヒド、硫酸ジメチルまたは紫外線照射（UV） 11,12を使用してタンパク質およびクロマチンDNAを架橋する様々な方法が報告されている。ホルムアルデヒド架橋は、最も一般的に使用され、クロマチン構造およびDNA-タンパク質相互作用を保存している9,13,14。架橋クロマトグラフィーinを音波処理により細断し、目的の特定のDNA結合タンパク質15,16に対する抗体で免疫沈降させる。近年、ChIPとNGSを組み合わせたChIP配列決定法（ChIP-seq）は、ゲノム全体の転写因子結合を調べるために開発されており、場合によっては時間経過に伴う動的変化をモニターするために開発されている18,19,20 。例えば、概日ChIP-seq研究は、24時間の概日周期18にわたって時間的に正確な遺伝子発現を駆動する概日クロック成分およびヒストンマーカーのゲノム結合の高度に調整された配列を明らかにした。
最も入手可能なChIPプロトコルは、軟組織（ 例えば、肝臓、脳など ）用に設計されており、骨格タルマシン。繊維が豊富な骨格筋を均質化し、高品質の核21を分離することは技術的に困難であり、特に架橋を必要とするChIP実験の場合には困難である。最近の筋肉ChIP研究22では、衛星細胞を筋繊維から分離し、核を両方の細胞型から、組織消化を含む長期の手順によって調製した。ホルムアルデヒド架橋が単離された核の上で行われる前に、全工程が完了するまでに約3時間を要した。この手順は、筋肉組織をより効率的な均質化に対して不応性にし、高品質の核を生成することができた筋繊維の架橋を回避したが、組織の収集から核の架橋への有意なタイムラグは、 - タンパク質相互作用。対照的に、ほとんどの研究は、リアルタイムDNA-プロテイムを保存するために、実験的処置または組織回収の直後に架橋を行ったn結合12 。架橋前の核単離の第2の欠点は、典型的には3〜4時間間隔で生じる概日検体採取のような時間依存性の適用を排除することである。核を架橋させることなく、解離の直後に単離を進行させる必要があるのに対し、架橋した試料は時間経過全体が完了した後に一緒に処理することができ、実験の一貫性を保証する。
未架橋骨格筋からの核の単離のための他のプロトコールも報告されている。 2つの研究では、勾配超遠心分離を使用して残りの筋原線維および細胞破片から核を分離することが記載されている23,24 。スクロースまたはコロイド勾配超遠心分離が未架橋筋肉組織に有効である一方で、本発明者らの実験は、架橋後、勾配超遠心分離が細胞dから核を分離することができないことを明らかにしたエブリスはグラデーションに乗っています。
したがって、我々は、架橋マウス骨格筋組織を用いて高品質の核を単離するための手順を開発した。グラジエント超遠心分離ではなく、連続したろ過法を考案し、核を残骸から効果的に分離しました。超音波処理後、クロマチンサンプルは、標的プロモーターに結合するBMAL1タンパク質の概日パターンを示すChIP研究に首尾よく適用された。我々の方法は、筋肉組織の様々な機械的研究に広く適用することができる。
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Protocol
動物のケアは、施設の動物のケアおよび使用委員会（IACUC）ガイドラインの下で実施され、手順はヒューストンのテキサス大学健康科学センターによって承認された動物のプロトコルに従って行われた。
1.架橋骨格筋からの核の単離
- 前に詳述したように、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、約20週齢のC57BL / 6雄マウスから単離した後肢骨格筋を秤量して切り刻む。
注：我々は通常、1つのマウスから1.0〜1.5 gの骨格筋を得る。- 氷上で10mLのPBSを含む50mLコニカルチューブに細かい骨格筋組織を置く。
- 4℃で300xgで5分間遠心分離する。
- 慎重に吸引によりPBS上清を除去する。
- 1、2、3、および4 mLの水を含む参照チューブを使用して、各50 mLチューブのペレット容量を見積もります。
- 7巻追加PBS中の氷冷した1％ホルムアルデヒドで洗浄し、プローブ組織ホモジナイザー（ 表を参照）を用いて氷上でサンプルをホモジナイズする。
注：オプション：ホモジナイゼーション手順は、低温室で行うことができます。 - 室温で10分間インキュベートすることによって試料を架橋させる。
- 1Mグリシンを添加して架橋反応を停止させ、0.125Mの最終濃度とし、室温で5分間インキュベートする。
- サンプルを3,000 xgで5分間4℃で遠心分離する。吸引により上清を除去する。
- 新たに加えたプロテアーゼインヒビター（0.2mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF））を含有する10mLの氷冷塩基緩衝液（pH7.3,10mM EDTA、10mM KCl、5mM MgCl 2、0.5mM DTTの10mM HEPES-KOH） 、及び10μg/ mLのロイペプチン）を含む。 3,000 gで5分間4℃で遠心分離し、上清を慎重に吸引除去する。
- ペレットを6mLの溶解緩衝液（10mM HEPES-KOH、p（0.2mMのPMSF、および10μg/ mLのロイペプチン）を含有する10mMのHEPES緩衝液（pH7.5,10mM EDTA、10mM KCl、5mM MgCl 2、0.5mM DTT、1％Triton X-
- 試料を予め冷却した15mL Dounceホモジナイザーに移し、氷上で10分間インキュベートする。ゆるやかな乳棒を用いて15回のゆっくりとしたストロークで各試料を氷上でホモジナイズし、密栓した15ストロークで核を放出させる。
- ホモジネート（6mL）を細胞ストレーナー（孔径：100μm）で濾過し、4mLの溶解緩衝液ですすぐ。 4℃で1,000 xgで10分間遠心します。 5mLの氷冷した塩基緩衝液に再懸濁し、密な乳棒で10回叩いて核を放出させる。
- 分光光度計（OD260 / OD280）でDNA濃度を測定するために20μLのアリコートを取り出し、必要に応じてトリパンブルーで顕微鏡で観察します（下図参照）（ 図 1A ）。
- サスペンションをフィルタリングする細胞ストレーナ（細孔サイズ：70μm）を用いて、チューブをすすぎ、上記のように2mLの塩基緩衝液で再度濾過する。
- 徐々に細孔サイズ（40μm、30μm、20μmおよび10μm）が減少した細胞ストレーナーで、ステップ1.13と同様にろ過を繰り返します。
注：合計で、6つの孔サイズのストレーナーがステップ1.12-1.14で使用された。 - 4℃、1,000gで10分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを500μLの塩基緩衝液に再懸濁する。
- 上記のようにDNA濃度を測定する。
注：約200μgの核酸DNAが1匹の動物からの両方の後肢を組み合わせて得られた。必要に応じて、トリパンブルー染色（ストック濃度0.4％、1：5希釈）による顕微鏡観察のために20μLを保存する。核が青く染色される（ 図 1B ）。 - 4℃、1000gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを-80℃で保存する。
2.超音波
<ol>注：音波処理の有効性を評価するための例を図2に示します 。
3.超音波と定量の評価
- 1.0を追加保存した50μLの超音波処理されたサンプルに、RNase A（500U / mL RNase A：20,000U / mL RNase T1）を加え、37℃で30分間インキュベートする。
- 8μLのプロテアーゼK（10mg / mL）を添加し、55℃で30分間インキュベートする。
- DNA抽出キットを使用してDNAを収穫する。
- 5倍量の結合緩衝液を添加し、スピンカラムにかけ、4,000xg、10分間遠心する。
- パススルーを同じカラムにかけ、再度遠心します。
- 洗浄バッファーで13,000 xg、1分間で2回洗浄する。
- カラムを乾燥させるために13,000 xgで1分間遠心分離します。
- 50μLのH 2 Oを加え、13,000×g、1分間遠心分離してDNAを溶出する。
- パススルーを同じカラムにかけ、再度遠心します。
- 分光光度計（OD260 / OD280）でDNAの量を定量する。 0.8％ゲルでサンプルを実行して超音波処理された製品のサイズおよび量（1μg）を評価する（ 図2 ）。
注：平均クロマチン収率は約20％です。
4.チップ
- 以前保存したクロマチンを-80°Cで解凍し、クロマチンをチューブあたり約100〜120μgに等分します。放射免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM NaF、1mM Na 3 VO 4、1mM PMSF、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）、0.1％ w / v）、1％トリトン（Triton）X-100）。
- 各グループに複数のサンプルがある場合は、同量のクロマチンDNAを最終量約100〜120μg/サンプルに合わせます。入力として10％を保存します。
- BSAプレブロック（〜2時間、4℃）プロテインA / Gアガロース（非鶏抗体）またはIgYビーズ（鶏抗体）の40μL（RIPAバッファー中50％v / vスラリー）を添加し、 4℃で3時間回転させた。
- 1,000 xgで10分間遠心分離し、上清を注意深く新しいチューブに移す。
- 抗体を1μg/25〜100μgのクロマチンDNA。
- 約15 rpmで一晩4℃で静かに回転させます。
- 10μLのBSAプレブロック（〜2時間、4℃）プロテインA / Gアガロース（非鶏抗体）またはIgYビーズ（鶏抗体）を加え、冷室で2時間回転させます。
- ビーズを以下のように洗浄する。 RIPA緩衝液1mLで3分間2回洗浄し、1mLの高塩緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、500mM NaCl、2mM EDTA、1mM PMSF、1％Triton X-100）で3分間2回洗浄する。 1mLのLiCl緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、250mM LiCl、2mM EDTA、1mM PMSF、1％Na-デオキシコール酸塩、0.5％NP40）で3分間2回洗浄する。
- 1mLのTris-EDTA（TE）緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.4）、1mM EDTA）で3分間1回洗浄する。次いで、溶出緩衝液（20mM Tris-HCl、5mM EDTAおよび0.5％SDS）でDNAを溶出する。
- 1,000gで1分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。
- 溶出バッファー50μLでビーズを再懸濁する。
- 10日間インキュベートする分で65℃で保存した。
- 12,000 gで5分間遠心分離する。
- 上清を新しいチューブに移し、さらに50μLを加え、12,000gで5分間遠心分離する。最終溶出量は100μLになります。
- 逆架橋およびDNA溶出。
- 溶出したクロマチンを一晩65℃でインキュベートする。
- 1.0μLのRNase Aを添加し、37℃で30分間インキュベートする。
- 8μLのプロテアーゼK（10mg / mL）を添加し、55℃で30分間インキュベートする。
- 製造者のプロトコールに従って、50μLの溶出容量を有するPCRクリーンアップキットを用いてDNAを収穫する。
- 先に説明したようにリアルタイムqPCRによるプロファイルを分析する（ 25,26） 。
注：プライマー配列は図3の 凡例にリストされています 。データは、平均±SEMとして示す （ 図3 ）。
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Representative Results
ここでは、リアルタイムDNA-タンパク質相互作用を保存するために、組織回収直後にホルムアルデヒド架橋を行った。しかし、我々は、核分離23,24に一般的に使用されるスクロースまたはコロイド勾配は、筋原線維から核を分離するのに有効でないことを見出した（データ示さず）。その理由は、架橋が核および筋原繊維に同様の重力を与えたためであろう。したがって、我々は、核の画分から大きな筋原線維および他の破片を効果的に除去するための連続濾過プロセスを開発した。 100μmの濾過後、依然として大きな組織破片および筋原繊維が存在した（ 図 1A ）。これと比較して、逐次ろ過の終了時に、大部分の組織破片、インタクトな細胞および大きな筋原線維が首尾よく除去された（ 図 1B ）。
27またはマウス胚線維芽細胞（MEF） 28などのいくつかの組織の超音波処理を改善し得るが、我々の経験では、骨格筋の超音波処理を妨害し、効果のない超音波。 SDS溶解緩衝液中での懸濁後に即時音波処理を用いて現在のプロトコールを用いて、我々はサイクル依存的に徐々に細断し、最終的に約500bpのDNA断片を産生するクロマチンによる効率的な超音波処理を観察した（ 図2 ）。溶解緩衝液中のプレインキュベーションは、超音波処理効率を検出可能に損なう。
コンシューマにChIPのためのクロマチン調製物の品質を確かめるために、Zeitgeber時間（ZT）6およびZT18（それぞれ18,29）で結合ピークおよびトラフを示した概日転写因子BMAL1のDNA結合を調べた。 C57B / 6Jマウス由来の骨格筋サンプルをZT6およびZT18で収集し、上記のようにしてクロマチンサンプルを調製した。簡単に述べると、超音波処理後、細断されたクロマチンサンプルを、BSAで予めブロックしたIgYビーズで予備洗浄し、続いて抗BMAL1抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。クロマチンの溶出および精製の後、2つの標的遺伝子Nr1d1およびDbp30の E-Boxエレメント上のBMAL1結合を検出するためにRT-qPCRを行った。本発明者らは、ZT6におけるEボックスエレメントへのBMAL1の強固な結合およびZT18での最小結合を検出した（ Nr1d1 ：0.452±0.022対0.039±0.002、 Dbp -0.4：0.627±0.013対0.062±0.009、 Dbp+0.8：0.176±0.013対0.008±0.001、 Dbp +2.4：0.466±0.010対0.122±0.014;すべての値は平均±SEMである）（ 図3 ）、骨格筋における時間感受性転写因子結合分析のプロトコルを検証した。
図1 ：逐次ろ過は効果的に除去された組織破片。 （A） 100μmの濾過後のサンプルを示す代表的な画像。大きな組織および繊維の破片が観察される。 （B）連続濾過後の試料を示す代表的な画像。大きな繊維の破片が除去された。単離された核および小さな筋原線維断片のみが観察される。 10倍、20倍および40倍の倍率で光学顕微鏡を用いて写真を撮影した。スケールバーは右側のパネルに表示されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図 2：10サイクルの超音波処理によるプログレッシブクロマチンシュレッダー。 0.8％アガロースゲルで明らかにされるように、消化されたクロマチンDNAによる約500bpへの10回の音波処理は、150Vで60分間実行される。右のパネルは、氷冷SDS溶解緩衝液中で1時間プレインキュベートした後のより低い超音波処理効率を示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Fi図3 ：ZT6およびZT18で採取したマウス骨格筋サンプルを用いたBMAL1チップの代表的なqPCR結果。データは平均±SEMとして示す。 Dbp -0.4、+ 0.8および+2.4は、 Dbp遺伝子上のE-Box要素の位置を示す。 NC：IgYを用いた陰性対照。 BMAL1結合の時間的パターンは、ZT6 18周りのBMAL1結合ピークを示す以前の結果と一致する。フォワードプライマーとリバースプライマーは以下の通りです。 Rev-erba：5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTGおよび5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp-0.4：5'-ACACCCGCATCCGATAGCおよび5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp + 0.8：5'-ATGCTCACACGGTGCAGACAおよび5'-CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2.4：5'-TGGGACGCCTGGGTACACおよび5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、架橋された骨格筋組織を用いて高品質の核を単離する堅牢な方法について説明します。塵から核を効果的に分離するために逐次濾過を行い、皿状トランスデューサからの超音波エネルギーがChIP分析のためにクロマチンを剪断した。この結果は、標的プロモーターにBMAL1の概日特異的結合を示した。
ChIPは、架橋が起こるときにゲノムDNA上のリアルタイムタンパク質占有を捕捉するために使用することができる。この可能性を利用するために、我々は、組織切開時に骨格筋の架橋を可能にし、勾配超遠心分離を行わずに核分裂を合理化する方法を開発することを目的とした。肝臓のような柔らかい組織と比較して繊維が豊富な骨格筋を均質化することの困難さのために、我々は氷冷PBS中で筋肉組織を細かく刻んだ後、試料をホルムアルデヒド緩衝液中で均質化した。クエンチング後、組織懸濁液WA遠心分離し、氷冷した塩基緩衝液ですすいで残りのホルムアルデヒドをすすいだ。 Dounceホモジナイゼーションによって核を放出させ、ホモジネートを順次ろ過して細胞破片および筋原線維を徐々に除去した。我々は収率に悪影響を及ぼす可能性のあるフィルターの目詰まりを最小限に抑えるために一連のフィルターを考案しました。逐次ろ過が完了したとき、非常に短い筋原繊維のみが残った。
超音波処理およびChIP手順は、超音波処理タイミングおよびSDS緩衝液量を含む前の報告書12から修正された。皿状超音波処理器は、冷水浴中のガラスバイアル中のサンプルのための集中型超音波に曝露することを可能にする。プローブソニケーターと比較して、このソニケーターは過熱を避けるためにサンプル温度をコントロールし、またサンプルのクロスコンタミネーションを防止します。プローブソニケーターが使用される場合、最適な超音波処理条件は経験的に決定される必要がある。私たちはまた、筋肉クロマチンの収量は肝臓12の収量よりも低いため、SDS緩衝液を使用した。いくつかのプロトコール28,31,32には、氷上でのインキュベーションまたは室温での超音波処理が含まれる。しかしながら、我々の経験では、氷上でのプレインキュベーションは音波処理効率を改善しなかった。実際、場合によっては超音波処理が損なわれていました。インキュベーション中に残留筋原繊維がクロマチンDNAをもつれ、音波処理の有効性を弱める可能性があります。 SDS溶解緩衝液中での核懸濁後の即時音波処理により、我々は、超音波処理サイクルを増加させながら進行性クロマチン断片化を得ることに成功した（ 図2 ）。
ChIP qPCRを用いてクロマチンの品質を検証しました。 図3に示すように、BMAL1プロモーター占有率はZT6では堅調であり、ZT18では最小であり、以前に示されたBMAL1前後と一致するジーンプロモーター結合18 。この機能的アッセイにより、核およびクロマチンの質が確認された。近年、NGSの急速な発展は、ChIP-seqが高感度でゲノム結合を定量的に調べることができるChIPアプリケーションの新たな地平を開いた17 。特にChIP-seqの場合、高品質の核およびクロマチンは、タンパク質-DNA相互作用を一貫して捕捉する必要があります。本明細書に記載の手順は、骨格筋を用いたChIP-seq研究のための貴重なリソースを構成し得る。注目すべきことに、ChIP-seqライブラリーの調製には、PAGEベースのサイズ選択18など、信号分解能を向上させるための追加の手段が必要です。
結論として、我々は、架橋骨格筋から高品質の核を調製するための濾過ベースのプロトコールを開発した。超遠心分離の必要性がなくなり、容易に適用できます。関心のある遺伝子のためのChIPに加えて、核およびクロマチンprChIP-seq研究に広く適用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私たちはKaryn Esser、Koike Nobuya、Park Noheon Parkに助けになることに感謝します。この研究は、NIH / NIGMS（R01GM114424）がS.-HYに、またRobert A. Welch Foundation（AU-1731）とNIH / NIA（R01AG045828）がZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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