Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Published: August 17, 2017 doi: 10.3791/56144
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, 2Department of Diagnostic and Biological Sciences and Institute for Molecular Virology, University of Minnesota

Summary

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Abstract

Boş hücre transkripsiyon-çeviri (TXTL) sistemleri, bir daha fazla çok yönlülük ve modülerlik, temel ve Uygulamalı Bilimler test tüpü tepkileri gerçekleştirmek için yeni yetenekleri sağlamak için tasarlanmış yeni bir nesil. Son on yıl içinde boş hücre TXTL roman çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili nicel ve sentetik Biyoloji geniş bir yelpazesi için güçlü bir teknik haline gelmiştir. Yeni TXTL platformlar oluşturmak ve sentetik veya doğal gen devreleri yürütülmesini biyokimyasal sistemlerde sorgulamak özellikle yararlıdır. Vitro TXTL uygun hızla prototip düzenleyici elemanlarının ve biyolojik ağlara de özetlemek için kendinden montajlı mekanizmaları oturma sistemlerinde bulunan moleküler kanıtlamıştır. Bu makalede, tarif biz nasıl bulaşıcı bacteriophages, gibi MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) ve T7 (dsDNA), tamamen kendi genom kullanarak tüm Escherichia coli, TXTL sistem boş hücre bir pot reaksiyonlarda gelen sentez. Üç coliphages sentezi plak tahlil kullanarak sayılabilir. Gösterdiğimiz nasıl sentezlenmiş fajının verim reaksiyonlar biyokimyasal ayarlarına bağlıdır. Moleküler kalabalık, taklit 8000 PEG, kontrollü bir konsantrasyon büyüklükleri emriyle sentezlenmiş phages miktarını etkiler. Biz de phages yükseltmek ve onların genleri arındırmak anlatan. İletişim kuralları ve sonuçları bu çalışmada sunulan bir dizi boş hücre sentetik Biyoloji ve Biyomühendislikte multidisipliner araştırmacılar dahil ilgi olmalıdır.

Introduction

Son on yıl içinde ifade boş hücre teknolojisi acil çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili sentetik ve nicel Biyolojide adres roman uygulamaları için tasarlanmış. Aslında proteinler yaşayan bir organizma bağımsız ifade etmek için kullanılan, önemli ölçüde bu teknoloji kapsamını genişleterek her iki temel ve Uygulamalı Bilimler1,2, yeni boş hücre TXTL sistemleri geliştirilmiştir. TXTL platformları yeni nesil kullanıcı dostu, olmak için tasarlanmış daha verimli (2 mg/mL toplu iş modu3protein sentezi, daha ulaşan) transkripsiyon4düzeyde çok yönlü ve böylece olarak için modüler kolayca roman doğal entegre veya varolan biyolojik sistemleri5,6yeteneklerini genişletmek sentetik işlevleri. Özellikle, boş hücre TXTL sistemleri tasarım yapı testin azaltarak, düzenleyici elemanlarının veya küçük genetik devreleri7,8,9, gibi genetik programların hızlı prototipleme için kullanışlı hale gelmiştir bir kaç gün için döngüsü. Dikkat çekici, yeni TXTL da coliphages10,11güçlü aktif genomik sulandırma desteklemek için yeterli performans gösteren, tam sentezi gibi büyük DNA programları işleyebilme yeteneği olan sistemlerdir DNA canlı varlıklar kodlanmış.

TXTL sistemleri geleneksel vitro yapıcı biyokimyasal deneyleri için karşılaştırıldığında birçok teknik avantajları mevcut. Boş hücre TXTL gen ekspresyon sürecin nihai ürün yaşam hücrenin karmaşık sitoplazma aksine, azaltılmış ve açık bir ortamda bağlar. TXTL DNA, modern DNA montaj teknikleri ile uygun fiyatlı ve titiz protein saflaştırma adımlar gerektirmeyen yanı sıra hızlı olan biyokimyasal sistemleri vitro, yeniden oluşturmak için kullanır. İfade boş hücre bileşenlerinin biyokimyasal reaksiyonlarda böylece moleküler etkileşimleri12daha derin bir diseksiyon izin doğrudan erişim sağlar. TXTL tepki olarak bir yaşam hücrede neredeyse imkansız olacaktır, biyokimya ve biyofizik ayarlarını değiştirebilirsiniz. Bu avantajları ve son gelişmeleri göz önüne alındığında, TXTL teknoloji sentetik ve nicel Biyoloji için alternatif bir platform olarak daha popüler hale geliyor. TXTL standart bir teknoloji olan Biyomühendislik hale geliyor ve TXTL kullanarak araştırma topluluğu hızla büyüyor olsa da, nasıl TXTL reaksiyonlar ve için icra etmek ile ilgili yeterli yöntemler geliştirmek için böyle platformlar kullanılacağını anlamak önemlidir sonuçların yorumlanması.

Bu makalede, biz nasıl sentez, one-pot tepkiler onların genom11, MS2 gibi bacteriophages için bütün bir E. coli TXTL sistemi kullanılacağını açıklar (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) ve T7 (dsDNA, 40 kb). Biz nasıl phages miktarı ile ilgili olarak bazı reaksiyonlar (magnezyum ve potasyum konsantrasyonu) biyokimyasal ayarları değişiklikleri sentezlenmiş gösterir. Moleküler kalabalık, taklit bir PEG aralığı 8000 konsantrasyonları ile büyüklükte birkaç emir fajının sentezi üzerinde dramatik bir etkisi vardır. Aynı anda transkripsiyon, çeviri, süreçleri özetlemek ve kendinden montajlı Biyoloji ve biyofizik ile ilgili temel sorulara adresleme için ilginç tek tüp reaksiyonlar büyük tür biyokimyasal sistemlerde gerçekleşme 10 (gen düzenlemesi, kendinden montajlı), yanı sıra yeni nanoyapıların13oluşturmak için fajının işlevleri repurposing gibi uygulamalar, geliştirmek gibi. TXTL üzerinde bir pratik ek olarak, biz yöntemleri fajının amplifikasyon, genom çıkarma ve arıtma ve FAJ miktar için plak tahlil tarafından sağlar. Bu el yazması sunulan E. coli dayalı özü boş hücre sistemleri kullanan ve bacteriophages içinde ilgilenen araştırmacılar için uygun yöntemlerdir.

Bu çalışmada sunulan protokolleri takip özetlenebilir: 1) fajının amplifikasyon (gün 1: aşılama hazırlamak hücreleri, 2. gün: tek plak, birden çok fajının büyüme ve konsantrasyon ve 3. gün: FAJ arıtma), 2) çift sarmallı genomu DNA ekstraksiyon (fenol/kloroform çıkarma) ve 3) boş hücre fajının tepki ve titresi deney (gün 1: konak hücreleri plaka ve Ağar Kaplamalar, yapmak 2. gün: öncesi kültür ve gün 3 hücre hücre-Alerjik reaksiyon ve ana bilgisayar: konak hücre kültür ve FAJ titresi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: aşağıdaki yükseltme adımları ve ayıklama yöntemi birçok çift iplikçikli DNA FAJ, Örneğin, bakteriyofaj T7, enterobacteria fajının T4 veya enterobacteria fajının λ (L) için büyük ölçüde genelleştirilebilir. Kimin genom ticari kaynaklardan satın almak için hazır değil bir fajının için ağırlıklı olarak kullanıldıkları.

1. fajının amplifikasyon

Not: tek-plak, çok döngüsü (SPMC) fajının üretim tekniği de T4 fajının Chen, vd., için anlatılan 14 aşağıdaki fajının amplifikasyon ve DNA ekstraksiyon yöntemi olan E. coli çift iplikçikli DNA phages, örneğin, T7, T4 veya L. ile kullanmak için bir genelleme İletişim kuralının nihai başarı ağırlıklı Seçili ana hücre zorlanma bağlıdır ' superinfection koşullara dayanacak şekilde s yeteneği. Konak hücreleri superinfection altında kararsız olan ya da superinfection asla ulaştı ve lizis asla bu kritik aşamada sınırına ulaşılmışsa Konfluent lizis protokolü ile devam etmek en iyisidir. Bu yüksek hızlı Santrifüjü ve ultrasantrifüj hızlarda fajının peletleme hücresel enkaz ayıran içerir. Tüm aşağıdaki koşullar ve parametreleri genel başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Bir yerel ana hücre satırı için en uygun koşulları farklı olabilir; belirlemek ve uygun koşullar uygun.

  1. Aşılama hücreleri hazırlamak
    1. 10 mL Luria-Bertani (LB) medya bir 15 mL kültür tüp E. coli ana bilgisayar hücrelerle aşılamak örneğin, B veya K12.
    2. Yer 250 devir/dakika ve 37 ayarla bir shaker ile doygunluğu büyümeye ° C. bırak gecede.
  2. Tek-plak, çok döngüsü fajının büyüme ve konsantrasyon
    1. yetkili fajının plaklar bir tabak hazırlamak için 1 h için 37 ° C'de birkaç LB-Ağar kaplamalar sıcak, veya bir gece.
    2. Fajının stokunun (Örneğin, T7, T4 veya L) ~ 10 2 -10 3 fajının/mL için amaçlayan LB medyada bilinen konsantrasyonunun birkaç dilutions hazırlanın.
    3. Ekle 100 µL konsantre konak hücre her plaka için gecede büyüme.
    4. Hazırlanan hacimleri Seç fajının dilutions 10-100 fajının/tabaktan bir aralığa karşılık gelen. Her plakasına fajının dilutions gerekli hacmi ekleyin (örneğin, 10 3 fajının/ml; 100 µL bu ~ 100 plaklar üretmek gerekir). Tabak 37 ° C'de kuluçkaya ve başlamak bir sayım-up zamanlayıcı (+ 0 h). 4-5 h için kuluçkaya
    5. 250 mL şişe ve yer döner shaker 250 devir/dakika ve 37 49 mL LB medya hazırlamak ° C.
    6. , + 2,5 h, seyreltik hücreleri 50 x 1 mL doymuş hücre kültürünün gecede büyüme 49 mL LB orta içeren önceden ısıtılmış bir şişesi içine ekleyerek. Hücreleri günlük büyüme (+ 4-5 h) ulaştığınızda, 600 Absorbans ölçmek nm (OD 600). 1.0 = 8 x 10 dönüşüm OD 600 kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek 8 hücre/mL.
    7. Dilute 2 x 10 7 hücre/mL ek LB büyüme ortamını kullanma. Kuluçka makinesi üzerinden fajının plaklar içeren agar plaka kaldırın. Hemen bir steril Pasteur pipet sonu çekirdek ve tek bir plak kaldırmak için kullanın. Plak seyreltilmiş hücrelere darbe ve bir ek 2 h (+ 6-7 h) için 37 ° C'de kuluçkaya.
    8. Test bir 1,5 mL tüp, ekleyerek 10 µL kloroform (CHCL 3), ve hemen vortexing yüksek hızda bir 500 µL örnek alarak tam enfeksiyon için. Çözüm açıklık vardır gözlemlemek. Sonra hücreleri tamamen bulaşmış, kuluçkaya başka bir 2 h (+ 8-9 h için).
      Not: hücreleri tamamen bulaşmışsa, onlar hızla lyse (< 2 dk) ve çözüm açıklamak. Diğer sonuçlar tartışma bölümüne aşağıdaki kabul edilir. Hücreleri superinfected ama şu ana kadar koşullar değil. Lizis başlıyorsa, ayrıca Dnaz ve Santrifüjü tarafından hasat fajının yıkımı önlemek hemen başlamalıdır.
    9. Ekleyin Dnaz 5 µg/mL ve santrifüj 8.000 x g 4 ° C'de cips için de hücreleri. Süpernatant atmak. Pelet 1 x TRIS magnezyum klorür (TM) (50 mM Tris pH 7.8, 10 mM MgCl 2) 10 ml 5 µg/mL ile Dnaz tampon resuspend. CHCL 3 ve girdap 500 µL hücreleri parçalayıcı için yüksek hızda ekleyin. 4 12.000 x g 10 dk de Santrifüjü tarafından açıklık ° C. Decant 15 mL konik tüp ve 4 mağaza içine süpernatant ° C.

2. Feyc arıtma

Not: Sükroz arıtma fajının boyutunu büyük ölçüde bağımlı. Dikkat edilmesi gereken noktalar izole olmak Feyc kitle için yapılması gerekecektir ve degrade koşulları ayarlamalar yapılır. 10 13 fajının/mL son viral titreleri bu yöntemle kolayca ulaşılabilir.

  1. %5 ve % 45 w/v Sükroz 1 TM arabellek x 12 mL hazırlayın.
  2. Hazırla 4 x 5-%45 Sükroz degradeler % 45 Sükroz 4 ultracentrifuge tüpler içine pipetting 2.5 mL tarafından. İle en iyi ~ % 5 sukroz, sıvı 2 mm tüp RIM ulaştığında durur 2.6 mL.
    Not: pipet ucu Sükroz çözüm yüzeyine temas yerleştirin ve yavaş yavaş sıvı dağıtmak. Hafif Sükroz çözüm üstüne daha ağır, ayrı bir sınır oluşturan yüzer olacak. Düzgün katmanlı bir çözüm ~ 1 mm arayüzü arka plan ışığı karşı düzenlenen olacak.
  3. Mix degradeler Degrade aracı 43 için şekillendirme kullanarak tilt-tüp döndürme tarafından s 86° 23 rpm de. Hemen gerekirse kapak ile parafin film ve depolamak saat 4'te ° C.
  4. Her üstünden kaldır 500 µL Sükroz gradyan ile 1 mL pipettor ve denge için ± 0,002 g. içinde hazırlanan
  5. Havuzu fajının süspansiyonlar tüm tüpler (Adım 1.2.9 yükleme) üzerinden. 1 mL pipet kullanarak süspansiyon 500 µL ucunu sıvı yüzeyi ile temas getiren ve çok yavaş hızlı pipetting ile karıştırmak değil dikkatli olmak Sükroz geçişin üst birimi dağıtımı tarafından ekleyin. 4 ° C'de 20 dk için 70.000 x g, santrifüj
    Not: Denge içinde ± 0,002 g. daha küçük phages için degradeleri hazırlanan ilâ 1 h sürebilir
  6. Bir steril enjektör ve künt kanül kullanarak fajının bantları çıkarın.
    Not: yan görüntülendiğinde fajının grup yaklaşık 5 mm içinde yükseklik, çevreye göre kalın ve sütlü olacak ve santrifüj tüpü aşağı yarı yolda yer alan.
    1. Submerge künt kanül ucu kadar çözüm içine fajının grup çok üst kenarında ortalanır. Feyc grup çoğunluğu kaldırılıncaya kadar şırınga pistonu üzerinde çizerek grup kaldırmak.
  7. Askıya alınmış fajının Sükroz birimle 3-4 ultracentrifuge tüpler için ekleyin. En fazla 1,5 mL/tüp ekleyin. ~ 3-4 dolgu soğuk 1 tüp üstünden mm x TM. Parafin film ile kapak ve karıştırmak için tersine çevirin. Bir ultracentrifuge ve 145.000 x g 4 ° C'de 1 h için spin geri yerde cips için. Daha küçük phages 2 h. sürebilir
  8. Hızlı bir şekilde süpernatant dökün ve baş aşağı drenaj tek kullanımlık mendil. Aşırı süpernatant kaldırmak için steril pamuklu çubukla ile tüp içine silin.
  9. Bölmek TM tüm granül ve gecede 4 ° C'de resuspend 200-400 µL soğuk 1 x; sallama yok gereklidir.
    Not: Pelet temiz, değilse membran, Örneğin, kılçıklı parçaları DNA, vb, havuz ve ek Santrifüjü 17.000 x g. adlı bir microcentrifuge gerçekleştirmek
  10. Titreleri, yapmadan önce gün E. coli konak hücreleri 10 mL LB büyüme medya kültürünün hazırlamak ve 250 devir/dakika ve 37 ° C gece ayarla titreyen bir kuluçka makinesine bırakın. Kültür plakaları için en az 1 h 37 ° C'de uygun miktarda titreleri fajının stokunun yapmadan önce kuluçkaya.
    Not: Kuluçkaya plakaların kaplama Feyc stokunun dilutions sayısına bağlıdır: her benzersiz seyreltme fajının stokunun iki kültür tabak gerektirir (örneğin, dört farklı dilutions fajının stok gerektirir sekiz kültür plakaları).
  11. En iyi agar 100 mL 100 mL şişe 2.5 g LB ve 0.6 g bacto-agar ekleyerek hazırlayın. 100 mL ve basınçlı kap hacmi deiyonize suyla halinde katı geçiyoruz. Otoklav sonra yavaş yavaş şişe 6 - 8 kez ters çevir'i çözüm boyunca agar homojenize için. 15-20 dk sıcaklık . equilibrate 45 ° C su banyosunda şişe koyun
  12. LB çözüm ile fajının stoklarının seri seyreltme hazırlayın.
    1. Ekleyin 990 µL LB 10 µL fajının stok 100-fold seyreltme için. Homojenize girdap. İçin bir seyreltme faktörü 10 fajının stokunun 100 µL eklemek için 900 µL LB. girdap lunaparkçı.
    2. Yukarıdaki seyreltme serisi olarak plaklar (10-100 plaklar) sayılabilir bir dizi elde etmek için gerektiği kadar yineleyin.
      Not: Bunu başarmak için 2-3 büyüklük beklenen fajının verim fajının/mL tepki açısından daha az fajının hisse senedi sulandırmak. Belirli fajının hisse senedi 10 11 bulaşıcı fajının/mL içeriyorsa, örneğin, bir 10, fajının hisse senedi plaka 8-kat veya 10 9-seyreltme katlayın.
  13. Bir alan 14 mL kültür tüpler (kültür tüpleri sayısına eşittir kaplama Feyc hisse senedi dilutions sayısı) birleştirerek fajının titreleri için hazırlamak. 2.12. adımdaki seyreltilmiş fajının hisse senedi örnekleri ve ana bilgisayar bakteri hücreleri adım 2.10 buz üzerinde yer
  14. Ana bir karışım hazırlamak 5,25 mL üst agar (Adım 2.11) by pipetting, 220 µL fajının örnekleri (Adım 2.12) seyreltilmiş ve 50 µL ana bilgisayar bakteri hücreleri (Adım 2.10) 14 mL kültürüne tüp. Kültür tüp ve girdap yüksek hızda kap.
    1. 4'te kalan fajının çözüm depolamak ° C.
  15. 37 ° C kuluçka iki kültür tabak (Adım 2.10) almak. 2,5 mL ana karışımı yavaş yavaş ilk plaka (olmadan kabarcıklar) Merkezi ekler. Tüm kültür plaka kapsaması el ile ana karışımı eşit dağıtmak için plaka Yavaşça döndürün. İkinci plaka ile yineleyin. En iyi agar katılaşma sağlamak için 20 dakika bekleyin. Plakalar için 4-7 h. 37 ° C'de kuluçkaya
  16. Plaklar saymak ve her reaksiyon örnek fajının konsantrasyonu belirlemek.
    Not: Plaklar opak halı konak hücre içinde 1-2 mm açık daireler olarak görünür. Temsil edici sonuçlar için bkz. şekil 1. Başarılı fajının üretim son 10 12 -10 13 fajının/mL konsantrasyonlarda sonuçlanır.

3. Çift sarmallı genomu DNA ekstraksiyon

Not: sallayarak, seyreltme ve Santrifüjü adımları kalın, katı protein sınır tabaka fenol ve sulu aşamalar arasında geliştirmek için optimize gerekir. Bu protein kirleticiler ücretsiz yüksek saflık genleri oluşturur. İlk seyreltme son fajının titresi üzerinde bağlıdır. Bir son derece yüksek titresi fajının stok (≥ 10 13 fajının/mL) düşük titresi stokları (~ 10 10 -10 11 fajının/mL) sadece gerekebilir süre emme önce 10-20-kat seyreltme gerekebilir bir logosuna 2 kat veya hiçbiri. Sonraki adımlar bir katı protein katman oluşturmak zordur veya sulu süspansiyon nedeniyle yüksek DNA toplama uygulanabilir olmak çok yapışkan çıkarma devam etmeden önce daha yüksek bir seyreltme fajının stoklarının düşünün. Herhangi bir genom işleme adımı sırasında herhangi pipetting wide-geçişli pipet ipuçları kullanmak önemlidir sulu aşamaları. Birçok fajının genleri oldukça büyük ve kolayca pipet kesme yoluyla parçalanmış. Bu ağır yamultmak genleri Ayrıca, herhangi bir vortexing açıkça kaçınılmalıdır.

  1. TM arabellekte bir taze 1,5 mL tüp x 1 adım 2,9-400 µL fajının stoktan bir kısmını sulandırmak.
  2. Tris:Phenol:Chloroform eşit bir hacmi seyreltme için ekleyin. 5 dk. santrifüj kapasitesi için 5-10 dakika süreyle benchtop santrifüj 17.000 x g de sonuç emülsiyon karışımı yavaşça bir laboratuvar rocker veya elle sallamak
    Not: Bir farklı ve beyaz protein temel fenol faz yüzeyinde mevcut katmanıdır.
  3. Üst sulu faz Interphase sınır bozmamaya dikkat çekici bir yeni tüp için kaldırmak.
  4. Adımları 3.2-3.3 ek 3 fenol çekimi toplam için 2 kere tekrar edin. Sulu faz için taze bir tüp aktarmak ve CHCl 3 eşit bir hacmi ekleyin. Sallamak ve santrifüj (Adım 3.2). Sulu DNA örneği için temiz bir tüp transfer.
  5. Saf DNA hacmi tahmin ediyoruz. 3 M sodyum asetat (CH 3 COONa) 0.4 hacimleri ve % 95 etanol (alkol) 3 cilt ekleyin. -20 ° C-dondurucu gece yağış için yerleştirin. Santrifüj benchtop santrifüj 10-15 dakika süreyle 17.000 x g,
    Not: DNA hemen kurutmak ve süspansiyon tüp içinde bir kitle olarak görünür hale gelir. Beyaz ve tüp alt karşı iyi paketlenmiş uygun elde edilen Pelet.
  6. Kaldırmak ve süpernatant ya decanting ya pipetting atın. 500 µL % 70 eklemek alkol ve Pelet ücretsiz tüp alttan yüzen kadar tüpü yavaşça çalkalanır. Santrifüj kapasitesi 17.000 x g 5 dk. Kaldır ve alkol, pelet bozmamaya dikkat çekici atın.
  7. Tekrarlama adım 3.6. Hava üzerinde benchtop için 30-60 dk. ekle 50 µL GKD 2 O pelet pelet Makinası ve RT, 1 h için kuluçkaya veya bir resuspend için 4 ° C gece. 280 emme ölçüler kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek nm.
    Not: Beklenen konsantrasyonları vardır 0.5-5 µg/µL bu tekniği kullanarak. Toplam genomik moleküler son genom konsantrasyonu belirlemek için ağırlık tarafından bölmek.

4. Fajının tepki ve FAJ titresi deney boş hücre

  1. hazırlamak 25 g LB orta ve 15 g bacto-agar katı, bir 1 L şişe içine dökün ve deiyonize su 1 L. otoklav ekleyin.
  2. Sterilizasyon sonra şişe kabarcıklar oluşumunu önlemek için yavaş yavaş 6 - 8 kez alarak bakım ters çevir. Şişe ters agar katı 1 L çözüm boyunca homojenize. Kültür plakalar dağıtım önce 20 dk 58 ° C su banyosunda şişe yerleştirin.
    3. Bir kez LB-agar çözüm sıcaklığını equilibrated,
  3. bir alev çevrenin açık kültür plakaları yakınındaki sterilize etmek için kültür plakaları yanında hazır olun. 1 L şişe su banyo aliquots yaparken agar katılaşma önlemek için tutmak. 25 mL 100 mm x 15 mm kültür plaka ekleyin. 1 L 40 kültür plaka üretecek.
  4. Bir kültür plaka bir kenara koyun ve en az 1 h RT için kuvvetlendirmek izin; bu plaka konak hücreleri kaplama için kullanılacaktır. 39 kültür tabak 2 gündür RT. dükkanında 4 ° C'de kuvvetlendirmek veya hemen titreleri yapmak için kullanmak olsun.
    5. Uygun bakteriyel zorlanma (Örneğin, ana bilgisayar streaking tarafından konak hücreleri
  5. plaka B T7 için) bu LB-agar kültürü plaka üzerine-80 ° C'de depolandı. Çevre kirlenmesini önlemek için açık alev yanında çizgi. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya Steril bir ortamda çalışmaya önemlidir bu yüzden konak hücreleri yok antibiyotik direnci var.
  6. Hücre-Alerjik reaksiyon
    Not: Ham E. coli ayıklamak (8.9-9,9 mg/mL protein) diğer reaksiyon tamponu ve FAJ genomu oluşan % 67 ile % 33 boş hücre TXTL reaksiyonlar oluşur. Ham özü olarak daha önce açıklanan 15 , 16 hazırlanır. Son reaksiyon koşulları: 8.9-9,9 mg/mL protein (gelen ham ekstresi), 3-6 mM Mg-Glutamat, 40-100 mM K-Glutamat, % 2-4 8000 PEG, 3-4 mM yukarıda açıklanan 17 ve açıklanan bir enerji mix çözüm hazırlanan her amino asitin daha önce 15, 0,33-3,33 ile oluşan mM DTT, 50 mM HEPES, 1.5 mM ATP ve GTP, 0.9 mM CTP ve UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM kampı, 0.068 mM folinic asit, 1 mM spermidine ve 30 mM 3 PGA. DNA tipi phages 0.5-10 nM konsantrasyonları genom çalıştırmaları ve RNA türü phages 50-150 nM bir dizi gerekir. Son tepki konsantrasyonları sentez belirli fajının benzersiz ve yukarıda açıklanan aralıklarda düşecek. İçin optimal oksijenlenme reaksiyonların son tepki birimleri 10-20 µL arasında olmalıdır. Genomik molekül forma bağımlı olan reaksiyon protokolündeki küçük varyasyon vardır. Örneğin, doğrusal genom molekülleri başka bir bileşen tarafından ham hulâsa içinde mevcut recBCD enzim doğrusal DNA parçaları sindirim etkisizleştirmek için tepki gerektirir.
    1. Tam " reaksiyon ayrıntıları " reaksiyonlar toplam sayısı ve tepki son hacim girerek Tablo 1 (PhageTXTL_JOVE) bölümünde.
    2. Reaksiyon değişken bileşenleri ve sürekli bileşenleri belirleyerek deney tasarlayın. Sürekli reaksiyon bileşenleri son tepki birim ve örneklerin sayısını ürün için Toplam hacim oranı ana mix fraksiyonel cilt yüzdesini girin. Girmek belgili tanımlık stok ve reaksiyon reaktifler son konsantrasyonları " Master Mix tepki tarifi " PhageTXTL_JOVE bölümünde. Girmek belgili tanımlık stok ve sınanacak değişken reagent(s) son konsantrasyonları.
      Not: Reaksiyon bileşenleri hacimleri otomatik olarak hesaplanabilir ana mix birim ve son birim her bireysel tepki temel.
    3. Tüpler gerekli miktarda kaldırma (belirtilen " çözülme tüpler " PhageTXTL_JOVE.xlsx bölümünü) ham hücre özü, enerji arabellek mix ve amino asit karışımı-20 ° C veya-80 ° C ve buz üzerinde tezcan
      Not: Bir kez çözdürülen, bileşenler gibi birden çok aliquots (gerekirse) birleştirmek.
    4. Aliquot belirtilen birimin ham özü, son tepki hacminin % 33 microcentrifuge tüpüne.
    5. Tablo 1 göre ana karışımı hazırlayın. Tüm bileşenleri altında homojenize " Master Mix tepki tarifi " tarafından vortexing. Her bileşenin uygun cilt ham özü ekleyin.
    6. Eğer bir Feyc ile doğrusal DNA genom (Örneğin, T7), ile çalışma bakteriyofaj lambda gam protein 1 µM tepki 11 ' e ekleyin. Girdap çözüm homojenize ve 5 min için buzda tepki yerleştirmek için. Bu ham hulâsa içinde endojen sindirim doğrusal DNA parçaları karmaşık, recBCD tarafından inhibe.
    7. Tablo 1 göre son bileşen ekledikten sonra reaksiyon vortexing tarafından lunaparkçı. Ana karışımı n microcentrifuge tüpler içine bölünmüş.
      Not: Her bir Split kesirli ana mix hacmi yüzde ürün ve tepki son hacim birimdir. Örneğin, % 90 kesirli ana mix ses yüzdesi ve 12 µL son tepki hacmi için her bir Split 10.8 µL birimdir.
    8. Ana mix diziye değişken bileşenleri belirtilen birimleri ekleyin (bkz. Tablo 1). Su her tepki istenen son tepki birim ulaşmak için ekleyin. Her reaksiyon vortexing tarafından lunaparkçı. En az 8 saat veya gece boyunca 29 ° C'de microcentrifuge tüpler kuluçkaya.
  7. Konak hücre öncesi kültür
    Not: seyreltilmiş 50: 1 titresi deneme için kullanılan ana hücreleri enfeksiyon verimliliği artırır orta log fazı içinde olduğundan emin olmak için gece öncesi kültürdür. Orta günlük hücre sonra tarafından 10 kat yeniden konsantre ve buz üzerinde depolanır.
    1. Steril pipet ucu kullanarak 5 mL LB 3-5 sağlıklı konak hücre koloniler ile bir kültür tüp aşılamak. İş kirlenmesini önlemek için açık alev yanında.
    2. Kültür tüp 37 ° C ve 250 devir/dakika, titreyen bir kuluçka 16 h veya gece kalmak için kuluçkaya. Hücreleri diğer gün doygunluk faz ulaşabilirsiniz.
  8. Hücre kültür ve örnek hazırlama fajının titresi için ev sahipliği
    1. alüminyum folyo ile 500 mL Erlenmeyer şişesi ve kapak içine 50 mL LB dağıtmak. 20 dk. 37 ° C'de şişeye sıcak
    2. Konak hücre gece öncesi kültürün içine Önceden ısıtılmış LB. kuluçkaya 37 ° C'de 3-4 h ve 250 devir / dakikada sallayarak için aliquot 1 mL.
    3. Santrifüj 50 mL konak hücre kültürü 5000 x g., 10 min için atmak lb
    4. Pelet soğuk (4 ° C) 5 mL LB ile resuspend ve buz üzerinde tutmak
    5. Titresi deney başlamadan önce bir saat kuluçkaya kültür plakaları 37 ° c
      Not: Her benzersiz fajının reaksiyon (ve karşılık gelen seyreltme faktörü) iki tabak kullanacak. Ayrıca, (bkz: şekil 1 temsilcisi pozitif ve negatif denetimlerinde) deneysel denetimler için 4 plakaları kuluçkaya.
    6. Hazırlamak en iyi agar (Adım 2.11) 100 mL.
  9. Boş hücre tepki LB çözüm ile seri bir seyreltme 2.12 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
  10. Fajının titresi
    Not: plakasına kültür yemekleri için en az 1 saat inkübe ve otoklav kaldırılması sonra 15-20 dk 45 ° C su banyosunda üst agar yapıldı sonra başlar.
    1. Titresi son hücre Alerjik reaksiyon-LB çözüm 2, bölümünde açıklanan adımları 2,14-2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz dört temsilcisi sonuçları göster. Şekil 1' de, biz boş hücre TXTL sistemi ve FAJ DNA stokları yaşam ile kontamine değil olduğunu emin olmak için negatif denetimler kümesi mevcut E. coli hücreleri. Boş hücre TXTL sistem sağlam E. coli ücretsiz olduğundan emin olun hücre kirlenme genomik DNA (şekil 1A veB şekil 1) geçersiz bir iki sigara inkübe ve inkübe reaksiyon çözüm kaplama tarafından. Boş hücre TXTL sistem E. coli hücreleri ile kontamine Eğer büyüme plaka üzerinde gözlenen. Ayrıca, biz sigara inkübe ve inkübe tepkiler fajının genom (şekil 1C ve ile kaplama tarafından hücre-Alerjik reaksiyon ve bu nedenle herhangi bir olası kirletici hücreleri, fajının sentezi için sorumlu olduğunu doğrulayın Şekil 1D). Plaka ile inkübe reaksiyon (şekil 1D) plak, boş hücre TXTL sistem fajının için sorumlu olmadığını gösteren gösterirken sıfır plak plaka ile inkübe tepki (şekil 1C) gösterir sentez.

Şekil 2' de, biz bir homojen karşı inhomogeneous plak tahlil karşılaştırın. Resim 2 B Şekil 2Aplaka bir homojen plak yoğunluğuna göre alt-optimal kültür plaka arasında bir degrade plak yoğunluğu gösterilmektedir. Bunun kaynağı sonuç ne zaman bir kültür tabağa deneme fajının titresi bölümü sırasında reçete üst agar, örnek ve ana bilgisayar bakteri hücreleri ana karışımı hızlı soğutma gelen gözlenen. Feyc plaklar inhomogeneous yayılmasını önlemek için kültür plakaları fajının titresi deney başlamadan önce 37 ° C'ye equilibrated emin olun.

Yeterince plaka (şekil 3) başına 50 ve 200 plaklar arasında elde etmek için fajının çözüm sulandırmak için düzgün phages saymak için önemli bir adım olduğunu. Bu Aralık, aşağıda doğru istatistikleri belirlemek zordur ve bu aralığın plaklar üstüne, doğru sayar önlenmesi. TXTL içinde sentezlenen phages sayısı tuzları (potasyum ve magnezyum), moleküler crowders ve genomlar konsantrasyon gibi biyokimyasal ayarlarına bağlıdır. Şekil 4' te, biz testleri T7 ve ΦΧ174 phages için bir kaç örnek göstereceğim. T7 gibi DNA'sının çoğaltır fajının için yüksek verimlilik boş hücre tepki fajının sentezi dikkat: üç bulaşıcı phages sentez tepki genom molekül başına. Bir tepki bir FAJ DNA'sının ΦΧ174 gibi çoğaltmak için daha düşük bir verimlilik bekleyebilirsiniz: 1:5 genom molekül için sentezlenmiş bulaşıcı fajının oranıdır.

Figure 1
Şekil 1: Plak tahlil denetimleri ve bir boş hücre reaksiyonu (CFR) sistemi kullanarak başarılı bulaşıcı fajının üretim. (A)hiçbir genom eklendi ve CFR yok kuluçka (kuluçka süresi olarak 0 dk) gerçekleştirildi. Reaksiyon sonra olmadan ana bilgisayar E. colikaplama. Sonuç geçerli ana bilgisayar CFR hücre kirlenme gösterir. (B) Hayır genom eklendi ve CFR 12 h 29 ° C'de inkübe ve E. coliana bilgisayar kaplama. Sonuçları geçerli ana bilgisayar CFR, hücre kirlenme kuluçka sonra bile gösteriyor. (C) 1 nM genom yok kuluçka CFR (kuluçka süresi olarak 0 dk) ile birlikte ve E. coliev sahibi ile kaplama. Genom çözüm yok fajının kirlenme sonucu gösterir. (D) 1 nM genom dahil ve CFR 12 h 29 ° C'de inkübe ve ana bilgisayar E. coliile. Sonuçlar başarılı bulaşıcı fajının çoğaltma CFR içinde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Homojen fajının reaksiyonu titresi deney sırasında inhomogeneous yayılmasını karşı. 37 ° C sıcaklık için equilibrated değil kültür plakaları fajının titresi gerçekleştirmek mümkün bir etkisi fajının tepki inhomogeneous yayılmasını arasında kültür plakadır. (A), homojen yayılması fajının tepki gösteren iyi bir sonuç gösterilir nerede plaklar eşit olarak dağıtılmış plaka yüzeyi boyunca. (B), bir alt-optimal sonuç gösterilir nerede plaklar kültür plaka sol alt kısmında yoğunlaşmıştır. Bu oluşabilir üst-Ağar ile fajının tepki ve konak hücre ana mix 37 ° c sıcaklığında değil bir kültür plaka üzerine kalmaması sağlanmaktadır Ana mix çoğunluğu sol alt bölgede katılaşır ve homojen formaya mümkün değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Titreleri bir boş hücre fajının tepki için bir uygun seyreltme faktörü ayarı. (A) Bu plaka plaklar makul sayılabilir bir dizi görüntüler. Deneme titresi bölümü için kullanılan seyreltme faktörü fajının yeterince plaklar sayılabilir bir sayısını plaka üzerinde bırakmak için tepki verim seyreltilmiş. Diğer taraftan (B) seyreltme faktörü sentezlenmiş fajının verim açısından çok düşük ve ayarlanması gerekiyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Phages boş hücre sentezi karakterizasyonu ΦΧ174 ve T7. Sentezlenmiş ΦΧ174 ve T7 phages(a)sayısı (PFU/mL: plaquPEG bir fonksiyonu olarak boş hücre reaksiyonu, 8000 konsantrasyon e mililitre başına şekillendirme birim), kuluçka 29 ° C'de 16 h sonra ölçülen Sentezlenmiş ΦΧ174 ve T7 phages (B) sayısı magnezyum-Glutamat konsantrasyonu hücre-Alerjik reaksiyon fonksiyonu olarak ölçülen, kuluçka 29 ° C'de 16 h sonra ΦΧ174 DNA genom konsantrasyon, kuluçka 29 ° C'de 16 h sonra ölçülen hücre-Alerjik reaksiyon fonksiyonu olarak sentezlenmiş ΦΧ174 fajının sayısı (C) (D) sayısı sentezlenmiş T7 fajının T7 DNA genom konsantrasyonu hücre-Alerjik reaksiyon fonksiyonu olarak ölçülen, kuluçka 29 ° C'de 16 h sonra Görüntülenen tüm hata çubukları standart sapmalar üç tekrarlanan denemeler vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: reaksiyon kompozisyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chen, et al. teknikte takip 14 SPMC için önemli bir adım superinfection için uygun koşullar belirlerken ulaşılır. En yakın bir ana yük'ın yeteneği superinfection dayanacak şekilde denetleyen parametre sık ilk bulaşmasını fajının bölgedir. Konak hücreleri Logaritmik büyüme aşamasında ilk enfeksiyon fajının çok küçük bir miktar ile önce olması gerekir. Sonunda, fajının Ayrıca Logaritmik büyüme ulaşacak ve bırakmak fajının her konak hücrede birden çok kopyası için hücre sayısı hızla geçmek üzere fajının numaralarını izin vermek için hedeftir. Bu nerede lizis gerçekleştirilmez yarı kararlı bir duruma hücre zorlar. Bu durum değil eriştiyseniz, hücreleri basamaklı, Konfluent lizis geçmesi ve onların viral yük bırakın. Superinfection yukarıdaki ilk viral konsantrasyonları kullanarak erişilemezse, enfeksiyon ilk çokluğu bir sonraki girişimi yapmadan önce yaklaşık on katına tarafından daha düşük. Konak hücre hasat önce koşullar ve superinfection değil ulaşılır, hemen bir ayrı arıtma yordamı ile devam edin. Dnaz ekleyin ben 5 µg/mL ve tüm hücre lizis sonuçlandırmak için 500 µL CHCl3 . Bir ek 5 min için girdap ve 10.000 x g hücresel enkaz kaldırmak için santrifüj kapasitesi devam. Dikkatle boşaltmak ve süpernatant 75.000 x g 1-2 h fajının cips ve gecede 1 mL toplam 1 x TM arabelleği 4 ° C'de sallayarak olmadan resuspend için de santrifüj kapasitesi. Bir küçük birim hücre için superinfection için test ederken, ne kadar yakın hücre lizis ne kadar hızlı onlar ne zaman koşullar tarafından eklenen kloroform maruz ölçmek mümkündür. Hücreleri parçalayıcı ve neredeyse anında çözüm açıklar, hücre duvarları çok kararsız ve hücreleri hemen büyük ölçekli basamaklı lizis önlemek için hasat. Test 1-3 dakika içinde lyses, daha büyük birimleri için en fazla 2 saat, E. coli yerel suşu kullanılan bağlı olarak superinfect devam edebilirsiniz. Hücreleri 5 dk içinde koşullar değil, fajının büyüme E. coli büyüme yakalar değil ve birincil kuluçka devam etmelidir. Testi tekrar 30-60 dakika içinde gerçekleştirmek.

FAJ hazırlanan Sükroz degrade üzerinde arındırıcı, fajının üçte biri ve tüp aşağı üçte ikisi arasında bir çok kalın, pearlescent grup olarak görünür. Nispeten başarılı lizis ve hücresel kalıntı arınma adım varsayarsak, ama hiçbiri-in benzer yoğunluğu veya boyutu diğer, ışık bantları olabilir. Büyük, opak grup fajının içerir ve bir steril enjektör ve künt kanül ile eriyik--dan kaldırılacak.

Protokol, hücre-Alerjik reaksiyon ve FAJ titresi, üçüncü bölüm başlatma sırasında ana bilgisayar bakteri plaka (Kimden adım 3.5) ve aynı zamanda titresi analizi (Kimden adım 3,21) için kullanılan kültür plakaları için taze kültür tabak (daha az bir hafta eski) kullanmak en iyisidir. Bu konak bakteri hücreleri ve daha yüksek enfeksiyon verimlilik fajının titresi için daha güçlü büyüme teşvik edeceklerdir. Feyc kültür plakalar en az 1 h 37 ° C'de protokol fajının titresi bölümünü başlamadan önce önceden inkübe gerekir. Ön kuluçka fajının kültür plakaların (sentezlenmiş fajının ve konak hücre kültürü içeren) üst-agar çözüm homojen kültür plaka yüzeyi boyunca dağıtmak değil. Bunun yerine, üst-agar çözüm homojen yüzey (Şekil 2b) kuvvetlendirmek. Bu bir hafife fajının verim boş hücre tepki neden olabilir birden fazla phages aynı yerde, yerelleştirme olasılığını artırır.

Her plak konak hücre içinde çoğaltmak ve konak hücre lysing bir konak hücre bulaşmasını bir sentezlenmiş fajının olayını temsil eder. Plaklar hücrelerden döl fajının bulaşmasını komşu ev sahibi ilk enfeksiyon olaydan kuluçka döneminde boyutu büyür. Plak yok gözlenir ise, Bölüm 4,6 iletişim kuralında yapılan seyreltme faktörü çok düşük bir olasılık herhangi bir sentezlenmiş fajının konak hücre bulaşan kaynaklanan yüksek olması mümkün. Bu sorunu gidermek için 3-4 büyüklük (veya gerektiği gibi) seyreltme faktörü azaltmak ve titresi denemeyi tekrarlamak. Diğer taraftan, seyreltme faktörü kültür plaka tüm yüzeyine yayılmış, fajının verim saymak imkansız hale plaklar kaynaklanan çok yüksek olabilir. Bu durumda, seyreltme faktörü 3-4 büyüklük (veya gerektiği gibi) artırın. İyi karakterize fajının için boş hücre tepki verim bilinen ve yalnızca bir seyreltme faktörü her reaksiyon noktası titresi deneme için gerekli olacaktır. Yeni fajının karakterize, bu 2-3 farklı seyreltme faktörler her reaksiyon noktası, dilutions biri sayılabilir bir plak verim sağlamak en iyisidir ( şekil 3 plaklar sayılabilir ve sayılamayan sayısı arasındaki farklar için bakın bir tabak).

Hiçbir plak fajının titresi seyreltme faktörü değiştirdikten sonra gözlem yapılırsa, bu gen ekspresyonu değil aklına geldi ki boş hücre tepki başarısız olduğunu gösteriyor olabilir. Bunun için mantıklı bir açıklama reaktifler/FAJ DNA'sı ile vortexing boş hücre tepki homojenizasyon nedeniyle yapısal hasar olabilir. Bu sorunu gidermek için reaksiyon tekrarlayın ve tepki tüp beş ila yedi kat ile parmağını hafifçe dokunarak veya yavaş yavaş tepki bir pipet ile beş ila yedi kat karıştırma lunaparkçı.

Boş hücre tepki sistemi E. coli kaynaklanan ve endogenously hem E. coli RNA polimeraz ve birincil sigma faktörü, sigma 70, holoenzyme ana organizatörü fikir birliği tanımak gerekli oluşturmak için birleştirmek içerir E. coli gen dizilerinin. Ayrıca, hücre-Alerjik reaksiyon sistemi exogenously sigma 70 organizatörü fikir birliği dizisi altında altı diğer E. coli sigma faktörü genler sağlayarak tüm sigma faktörü transkripsiyon düzeni özetlemek. Bu kimin genleri E. coli' ın transkripsiyon/çeviri makine ile uyumlu olan tüm bacteriophages sentez yeteneği sağlar. Bu eğitimi veya burada kullanılan hücre-Alerjik reaksiyon sistemi ile sentezlenmiş bakteriyofaj alt kümesini bırakır.

Boş hücre transkripsiyon/çeviri Platformu etkileyici bir denetim düzeyini ve çalışmanın içinde vivo yöntemlerine göre reaksiyon koşulları esnekliğini sağlar. Biz bir fajının tepki biyokimyasal ve genetik bileşenlerinin çoğunun ince ayar ve doğrudan etkileri daha az 24 h, moleküler kalabalık için şekil 4 ' te gösterildiği gibi gözlemlemek. Moleküler crowders, öyle aynı derecede PEG, üzerinde etkileri kendinden montajlı makromoleküllerin kompleksleri teorik olarak açıklanan ve gösterdiği vitro18,19,20olmuştur. Moleküler kalabalık bir entropi büyük biyomoleküler yapıların Birliği sürekli artırır mekanizması tahrik olduğunu. Boş hücre yaklaşım araştırmacı biyofizik bacteriophages, içsel sınırlama vivo içinde çalışma gibi model sistemleri ile kendinden montajlı gibi karmaşık biyolojik süreçlerin soruşturma izin verir.

Bu platform da phages uygulanan alanlarda yardımcı programı incelenmesi için izin verir. Bileşenleri fajının genleri repurposed ve hızlı bir şekilde roman nanoyapıların sonuçlarını birleştiren bir hücre-Alerjik reaksiyon sistem hedefi ile test. Bacteriophages fajının terapisi yarar antibiyotik dirençli bakteri için bir alternatif olarak tanıtmak ana hücre enfeksiyon selectivity artırmak için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar aşağıdaki rakip mali interest(s) ilan: Noireaux laboratuvar MYcroarray, MYtxtl protein boş hücre sağma seti distribütörü araştırma fonları alır.

Acknowledgments

Bu malzeme Office deniz Araştırma Ödülü sayıya N00014-13-1-0074 (V.N.) tarafından desteklenen çalışma dayanır, insan Sınır Bilim Programı hibe numarası RGP0037/2015 (V.N. için) ve iki uluslu Bilim Vakfı (V.N.) 2014400 verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Tags

Biyomühendislik sayı: 126 boş hücre transkripsiyon-çeviri (TXTL) bakteriyofaj E. coli plak tahlil fajının amplifikasyon fajının genom arıtma sentetik Biyoloji
Bir <em>E. coli -</em>bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall,… More

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter