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Bioengineering

एक ई. कोलाईआधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण

Published: August 17, 2017 doi: 10.3791/56144
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, 2Department of Diagnostic and Biological Sciences and Institute for Molecular Virology, University of Minnesota

Summary

सेल की एक नई पीढ़ी के मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्लेटफार्मों के लिए जीन सर्किट के निष्पादन के माध्यम से इन विट्रो में जैव रासायनिक प्रणालियों के निर्माण के लिए इंजीनियर किया गया है । इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे bacteriophages, जैसे MS2, φχ १७४, और T7, उनके जीनोम से एक सभी ई. कोलाई सेल मुक्त TXTL प्रणाली का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं ।

Abstract

सेल की एक नई पीढ़ी-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TXTL) सिस्टम, एक अधिक बहुमुखी प्रतिभा और मॉड्यूलरता है इंजीनियर, उपंयास क्षमताओं को प्रदान करने के लिए परीक्षण ट्यूब प्रतिक्रियाओं में बुनियादी और एप्लाइड विज्ञान प्रदर्शन । पिछले एक दशक से अधिक, सेल मुक्त TXTL उपंयास multidisciplinary अनुसंधान मात्रात्मक और सिंथेटिक जीव विज्ञान से संबंधित क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन गया है । नए TXTL प्लेटफार्मों विशेष रूप से सिंथेटिक या प्राकृतिक जीन सर्किट के निष्पादन के माध्यम से जैव रासायनिक प्रणालियों का निर्माण और पूछताछ के लिए उपयोगी होते हैं । इन विट्रो TXTL तेजी से प्रोटोटाइप विनियामक तत्वों और जैविक नेटवर्क के रूप में अच्छी तरह के रूप में दोहराऊंगा आणविक स्वयं विधानसभा तंत्र रहने में पाया प्रणाली को सुविधाजनक साबित कर दिया है । इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे संक्रामक bacteriophages, जैसे MS2 (आरएनए), φχ १७४ (ssDNA), और T7 (dsDNA), पूरी तरह से एक पॉट प्रतिक्रियाओं में अपने जीनोम से एक सभी ई कोलाई, सेल मुक्त TXTL प्रणाली का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं । तीन coliphages के संश्लेषण पट्टिका परख का उपयोग मात्रा है । हम बताते है कि कैसे संश्लेषित फेज की उपज प्रतिक्रियाओं की जैव रासायनिक सेटिंग्स पर निर्भर करता है । आणविक भीड़, ८००० खूंटी के एक नियंत्रित एकाग्रता के माध्यम से नकल की, परिमाण के आदेश द्वारा संश्लेषित phages की मात्रा को प्रभावित करता है । हम यह भी वर्णन कैसे phages को बढ़ाना और कैसे उनके जीनोम शुद्ध करने के लिए । प्रोटोकॉल और इस काम में प्रस्तुत परिणामों का सेट ब्याज की सेल मुक्त सिंथेटिक जीवविज्ञान और जैव इंजीनियरिंग में शामिल multidisciplinary शोधकर्ताओं के लिए होना चाहिए ।

Introduction

पिछले एक दशक से अधिक, सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी आपात multidisciplinary अनुसंधान सिंथेटिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान से संबंधित क्षेत्रों में उपंयास अनुप्रयोगों के पते पर इंजीनियर किया गया है । मूल रूप से एक जीवित जीव से स्वतंत्र प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया, नए सेल मुक्त TXTL सिस्टम दोनों बुनियादी और एप्लाइड साइंसेज के लिए विकसित किया गया है1,2, इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में काफी विस्तार । TXTL प्लेटफार्मों की नई पीढ़ी के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल हो डिजाइन किया गया है, और अधिक कुशल (2 मिलीग्राम/एमएल के बैच मोड में प्रोटीन संश्लेषण की3), अधिक प्रतिलेखन के स्तर पर बहुमुखी4, और मॉड्यूलर इतनी के रूप में आसानी से एकीकृत उपंयास प्राकृतिक या सिंथेटिक कार्य है कि मौजूदा जैविक प्रणालियों की क्षमताओं का विस्तार5,6। विशेष रूप से, सेल मुक्त TXTL प्रणालियों आनुवंशिक कार्यक्रमों की तेजी से प्रोटोटाइप जैसे विनियामक तत्वों या छोटे आनुवंशिक सर्किट के लिए काम हो गया है7,8,9, डिजाइन को कम करने से-निर्माण-परीक्षण कुछ दिनों के लिए साइकिल । उल्लेखनीय है, नए TXTL प्रणालियों भी इस तरह के पूर्ण संश्लेषण के रूप में बड़े डीएनए कार्यक्रमों के प्रसंस्करण के लिए सक्षम हैं coliphages10,11, मजबूत पर्याप्त प्रदर्शन का प्रदर्शन करने के लिए सक्रिय जीनोमिक के पुनर्गठन का समर्थन डीएनए में रहने वाले संस्थाओं इनकोडिंग ।

TXTL प्रणालियों पारंपरिक इन विट्रो रचनात्मक जैव रासायनिक परख की तुलना में कई तकनीकी लाभ मौजूद । सेल मुक्त TXTL एक कम और खुले वातावरण में अंतिम उत्पाद के लिए जीन अभिव्यक्ति की प्रक्रिया से लिंक, के रूप में एक जीवित कोशिका के परिसर कोशिका का विरोध किया । TXTL डीएनए का उपयोग करता है इन विट्रो मेंजैव रासायनिक प्रणालियों को फिर से संगठित करना, जो आधुनिक डीएनए विधानसभा तकनीकों के साथ, दुराराध्य प्रोटीन शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता नहीं के अलावा सस्ती और तेजी से है । सेल मुक्त अभिव्यक्ति जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं में घटकों के अधिकांश के लिए सीधी पहुंच प्रदान करता है, इस प्रकार आणविक बातचीत12के एक गहरे विच्छेदन की अनुमति । एक TXTL प्रतिक्रिया में, एक जैव रासायनिक और होगा, जो एक जीवित कोशिका में लगभग असंभव है पर भौतिक सेटिंग्स बदल सकते हैं । इन फायदों और हाल ही में सुधार को देखते हुए, TXTL प्रौद्योगिकी सिंथेटिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान के लिए एक वैकल्पिक मंच के रूप में अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है । जबकि अनुसंधान समुदाय TXTL का उपयोग तेजी से बढ़ रहा है और TXTL इंजीनियरिंग में एक मानक प्रौद्योगिकी होता जा रहा है, यह समझने के लिए कैसे ऐसे प्लेटफार्मों का उपयोग करने के लिए इतना के रूप में TXTL प्रतिक्रियाओं के निष्पादन से संबंधित पर्याप्त प्रथाओं को विकसित करने के लिए आवश्यक है और परिणामों की व्याख्या ।

इस आलेख में, हम इस तरह के MS2 (आरएनए, ३.४ केबी), φχ १७४ (ssDNA, ५.४ केबी), और T7 (dsDNA, ४० केबी) के रूप में अपने जीनोम11से bacteriophages, एक पॉट प्रतिक्रियाओं में, एक सभी ई. कोलाई TXTL प्रणाली का उपयोग करने के लिए कैसे का वर्णन । हम कैसे प्रतिक्रियाओं (मैग्नीशियम और पोटेशियम सांद्रता) के जैव रासायनिक सेटिंग्स में से कुछ के संबंध में phages संश्लेषित परिवर्तन की राशि दिखा । आणविक भीड़, खूंटी ८००० सांद्रता की एक श्रृंखला के माध्यम से नकल की, परिमाण के कई आदेशों पर फेज संश्लेषण पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है । एक परीक्षण ट्यूब प्रतिक्रियाओं में इस तरह के बड़े जैव रासायनिक प्रणालियों की प्राप्ति कि दोहराऊंगा समवर्ती प्रतिलेखन की प्रक्रियाओं, अनुवाद, और स्वयं विधानसभा, बुनियादी जीव विज्ञान और जैव भौतिकी से संबंधित सवालों को संबोधित करने के लिए दिलचस्प है 10 (जीन विनियमन, स्वयं विधानसभा), के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुप्रयोगों के विकास के लिए, जैसे repurposing फेज कार्यों के लिए नए nanostructures13का निर्माण । TXTL पर एक व्यावहारिक के अलावा, हम फेज प्रवर्धन, जीनोम निष्कर्षण और शुद्धि के लिए तरीके प्रदान करते हैं, और फेज ठहराव पट्टिका परख द्वारा । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तरीकों शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो ई. कोलाई निकालने आधारित सेल मुक्त प्रणाली का उपयोग करें और bacteriophages में रुचि रखते हैं ।

इस काम में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन के रूप में संक्षेप किया जा सकता है: 1) फेज प्रवर्धन (दिन 1: टीका कोशिकाओं को तैयार, दिन 2: एकल पट्टिका, एकाधिक फेज वृद्धि, और एकाग्रता, और 3 दिवस: फेज का शुद्धि), 2) डबल-कतरा जीनोम डीएनए निष्कर्षण (phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण), और 3) सेल मुक्त फेज प्रतिक्रिया और titer प्रयोग (दिन 1: प्लेट मेजबान कोशिकाओं और आगार प्लेटें बनाने के लिए, दिन 2: सेल मुक्त प्रतिक्रिया और मेजबान सेल पूर्व संस्कृति, और दिन 3: मेजबान सेल संस्कृति और फेज titer) ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: निम्नलिखित प्रवर्धन चरणों और निष्कर्षण विधि कई दोहरे-असहाय डीएनए फेज, जैसे, भोजी T7, enterobacteria फेज टी-4, या enterobacteria फेज & #955; (एल) के लिए काफी हद तक सामांयीकरण कर रहे हैं । वे मुख्य रूप से एक फेज जिसका जीनोम वाणिज्यिक स्रोतों से खरीद के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।

< p class = "jove_title" > 1. फेज वर्धन

< p class = "jove_content" > नोट: एकल पट्टिका, बहु चक्र (SPMC) फेज उत्पादन तकनीक अच्छी तरह से चेन में टी-4 फेज के लिए वर्णित है, एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > १४ म् फेज प्रवर्धन और डीएनए निष्कर्षण विधि ई. कोलाई डबल असहाय डीएनए phages, जैसे , T7, टी-4, या एल के साथ प्रयोग के लिए एक सामांयीकरण है । भारी प्रोटोकॉल की अंतिम सफलता चयनित मेजबान सेल तनाव & #39 पर निर्भर करता है, superinfection शर्तों का सामना करने की क्षमता एस । यदि होस्ट कक्ष superinfection के तहत अस्थिर हैं, या superinfection कभी नहीं पहुंच है, और lysis इस महत्वपूर्ण चरण के दौरान कभी नहीं पहुंच है, तो यह एक धाराप्रवाह lysis प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना करने के लिए सबसे अच्छा है । यह उच्च गति केंद्रापसारक के माध्यम से सेलुलर मलबे अलग शामिल है, और फेज ultracentrifugation गति पर गोली । सभी निम्न स्थितियाँ और पैरामीटर्स एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु के रूप में अभिप्रेत हैं । एक स्थानीय होस्ट सेल लाइन के लिए इष्टतम शर्तों अलग हो सकता है; निर्धारित करें और उपयुक्त शर्तों का पालन करें ।

  1. तैयार टीका कोशिकाओं
    1. लगाना 10 मिलीलीटर Luria-Bertani (पौंड) मीडिया में एक 15 मिलीलीटर ई. कोलाई मेजबान कोशिकाओं के साथ संस्कृति ट्यूब, जैसे , बी या K12.
      2. एक शेखर में
    2. जगह २५० आरपीएम पर सेट और ३७ & #176; C. संतृप्ति को विकसित करने के लिए रात भर छोड़ दें.
  2. एकल-पट्टिका, बहु-चक्र फेज वृद्धि और एकाग्रता
    1. सक्षम फेज सजीले टुकड़े की एक प्लेट तैयार करने के लिए, गर्म कई पौंड-आगर प्लेटों पर ३७ & #176; C 1 ज, या रात भर के लिए.
    2. फेज स्टॉक ( जैसे, T7, टी-4, या एल) के पौंड मीडिया में ज्ञात एकाग्रता के कई कमजोर पड़ने तैयार है, के लिए लक्ष्य ~ 10 2 -10 3 फेज/एमएल.
    3. Add १०० & #181; प्रत्येक प्लेट के लिए केंद्रित मेजबान कोशिकाओं की रात वृद्धि के एल.
    4. 10-100 फेज/प्लेट से एक रेंज के लिए इसी तैयार फेज कमजोर पड़ने की मात्रा चुनें । प्रत्येक प्लेट को फेज कमजोर पड़ने की आवश्यक मात्रा जोड़ें ( उदा. , १०० & #181; L of 10 3 फेज/एमएल; यह उत्पादन करना चाहिए ~ १०० सजीले टुकड़े) । मशीन ३७ & #176 पर प्लेटें; सी और एक गिनती-अप टाइमर शुरू (+ 0 एच) । 4-5 एच
      5. के लिए मशीन
    5. तैयार ४९ मिलीलीटर पौंड मीडिया में एक २५० मिलीलीटर की कुप्पी और जगह में रोटरी शेखर सेट में २५० आरपीएम और ३७ & #176; C.
    6. पर + २.५ एच, एक पूर्व में रात के विकास से संतृप्त कोशिका संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़कर 50x कोशिकाओं पतला ४९ मिलीलीटर पौंड मध्यम से युक्त कुप्पी । एक बार कोशिकाओं लॉग वृद्धि (+ 4-5 ज) तक पहुंचने, उपाय अवशोषक पर ६०० एनएम (आयुध डिपो ६०० ) । रूपांतरण आयुध डिपो का उपयोग कर कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण ६०० of १.० = 8 x 10 8 cell/एमएल.
    7. 2 x 10 7 सेल/एमएल अतिरिक्त पौंड वृद्धि मीडिया का उपयोग करने के लिए पतला । आगर मशीन से फेज सजीले टुकड़े युक्त प्लेट निकालें । तुरंत एक बाँझ पाश्चर पिपेट के अंत का उपयोग करने के लिए कोर और एक पट्टिका हटाने. पतला कोशिकाओं में पट्टिका झटका और ३७ पर मशीन & #176; C के लिए एक अतिरिक्त 2 h (+ 6-7 h).
      8. एक ५०० & #181 लेने से पूर्ण संक्रमण के लिए
    8. परीक्षण; l नमूना एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जोड़कर, 10 & #181 जोड़ना; l क्लोरोफॉर्म (CHCL 3 ), और तुरंत उच्च गति पर भंवरा. निरीक्षण अगर समाधान स्पष्ट किया है । एक बार कोशिकाओं को पूरी तरह से संक्रमित हैं, एक और 2 एच के लिए मशीन (+ 8-9 ज) ।
      नोट: यदि कोशिकाएं पूरी तरह संक्रमित हैं, तो वे तेजी से लाइसे (& #60; 2 min) करेंगे और समाधान स्पष्ट कर देंगे । अंय परिणामों चर्चा अनुभाग नीचे में माना जाता है । कोशिकाएँ superinfected होंगी लेकिन इस बात को लाइसे नहीं जाएगा. यदि lysis शुरू होता है, DNase के अलावा और केंद्रापसारक द्वारा कटाई फेज क्षरण को रोकने के लिए तुरंत शुरू करना चाहिए ।
    9. जोड़ DNase को 5 & #181; जी/एमएल और ८,००० पर कोशिकाओं केंद्रापसारक पर 4 & #176; सी को गोली । supernatant को त्यागें । 1x TRIS मैग्नीशियम क्लोराइड (TM) के 10 मिलीलीटर (पीएच ७.८, 10 मिमी MgCl 2 पर ५० mM TRIS) बफर 5 & #181; g/एमएल DNase के साथ में गोली reसस्पेंड । Add ५०० & #181; CHCL 3 और भंवर की कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए उच्च गति पर । १२,००० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176 पर केंद्रापसारक द्वारा स्पष्ट; c. supernatant को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब और स्टोर में 4 & #176; c.
< p class = "jove_title" > 2. फेज की शुद्धि

< p class = "jove_content" > नोट: सुक्रोज शुद्धि काफी हद तक फेज के आकार पर निर्भर है. फेज के द्रव्यमान के लिए विचार करने के लिए अलग किया जा करने के लिए किया है और ढाल स्थितियों के लिए समायोजन किया जाएगा । 10 13 फेज/एमएल के अंतिम वायरल titers इस विधि के साथ आसानी से प्राप्त कर रहे हैं ।

  1. 5% और ४५% w/v सुक्रोज 1x TM बफर में 12 मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
  2. 4 ultracentrifuge ट्यूबों में ४५% सुक्रोज की pipetting २.५ मिलीलीटर द्वारा 4x 5-45% सुक्रोज ढाल तैयार करते हैं । साथ शीर्ष ~ २.६ 5% सुक्रोज की मिलीलीटर, रोक जब तरल ट्यूब के रिम से 2 मिमी तक पहुंचता है ।
    नोट: सुक्रोज समाधान की सतह के साथ संपर्क में पिपेट टिप प्लेस और बहुत धीरे तरल वितरण । हल्का सुक्रोज समाधान भारी के शीर्ष पर फ्लोट, एक अलग सीमा के गठन होगा । एक ठीक से स्तरित समाधान ~ 1 मिमी अंतरफलक अगर पृष्ठभूमि प्रकाश के खिलाफ आयोजित किया जाएगा ।
  3. ४३ के लिए एक ढाल बनाने के साधन का उपयोग कर झुकाव ट्यूब रोटेशन द्वारा ढाल मिश्रण ८६ & #176 पर; 23 rpm पर । अगर तुरंत जरूरत नहीं है, आयल फिल्म और स्टोर के साथ कवर पर 4 & #176; C.
  4. निकाल ५०० & #181; L प्रत्येक तैयार सुक्रोज ग्रैडिएंट के ऊपर से 1 मिलि pipettor और शेष के भीतर & #177; ०.००२ g.
    5. सभी ट्यूबों से
  5. पूल फेज सस्पेंशन (step 1.2.9) । एक 1 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, जोड़ ५०० & #181; एल तरल सतह के साथ संपर्क में टिप लाकर और बहुत धीरे सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर मात्रा वितरण, तेजी से pipetting के माध्यम से मिश्रण नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा द्वारा निलंबन की L. ७०,००० पर 20 मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक 4 & #176; C.
    नोट: तैयार ग्रैडिएंट को शेष के भीतर & #177; ०.००२ g. छोटे phages 1 h तक लग सकते हैं ।
  6. एक बाँझ सिरिंज और कुंद प्रवेशनी का उपयोग कर फेज बैंड को हटा दें.
    नोट: जब पक्ष से देखा, फेज बैंड मोटी हो जाएगा और दूधिया वातावरण की तुलना में, ऊंचाई में लगभग 5 मिमी, और केंद्रापसारक ट्यूब नीचे आधा रास्ता स्थित ।
    1. समाधान में एक कुंद प्रवेशनी जलमग्न जब तक टिप फेज बैंड के बहुत ऊपरी छोर पर केंद्रित है । फेज बैंड के बहुमत को हटा दिया गया है जब तक सिरिंज सवार पर ड्राइंग द्वारा बैंड निकालें.
  7. 3-4 फेज ट्यूबों के लिए निलंबित ultracentrifuge के साथ सुक्रोज मात्रा जोड़ें । कोई अधिक से अधिक १.५ मिलीलीटर जोड़ें/ ठंडा 1x TM के साथ ट्यूब के ऊपर से ~ 3-4 mm को भरें । आयल फिल्म के साथ कवर और मिश्रण करने के लिए पलटना । एक ultracentrifuge में वापस प्लेस और स्पिन १४५,००० x g पर 1 ज के लिए 4 & #176; ग गोली के लिए । छोटे phages 2 h तक लग सकता है
  8. जल्दी से supernatant बंद डालो और प्रयोज्य पोंछे पर उल्टा नाली । अतिरिक्त supernatant को दूर करने के लिए बाँझ कपास झाड़ू के साथ ट्यूब के अंदर पोंछ ।
  9. डिवाइड 200-400 & #181; एल कोल्ड 1x TM सभी छर्रों भर में और 4 पर रातोंरात reसस्पेंड & #176; ग; न मिलाना आवश्यक है ।
    नोट: अगर गोली साफ नहीं है, उदाहरण के लिए, झिल्ली के रेशेदार बिट्स, डीएनए, आदि , पूल और १७,००० x g. microcentrifuge में एक
    10. में अतिरिक्त केंद्रापसारक प्रदर्शन titers बनाने से पहले दिन
  10. , 10 मिलीलीटर पौंड विकास मीडिया में ई. कोलाई मेजबान कोशिकाओं की एक संस्कृति तैयार करने और एक मिलाते हुए मशीन में छोड़ २५० rpm और ३७ & #176 के लिए सेट; सी रातोंरात । ३७ & #176 पर उचित मात्रा में कल्चर प्लेट्स की मशीन, फेज स्टॉक के titers बनाने से पहले कम से 1 ज के लिए सी.
    नोट: प्लेटों की संख्या फेज स्टॉक के कमजोर पड़ने की संख्या पर निर्भर करता है चढ़ाया जा करने के लिए: फेज स्टॉक के प्रत्येक अद्वितीय कमजोर पड़ने दो संस्कृति प्लेट की आवश्यकता है ( जैसे , चार फेज शेयर की अलग कमजोरियां आठ संस्कृति प्लेट की आवश्यकता है).
  11. २.५ ग्राम पौंड और ०.६ ग्राम bacto-आगर को १०० मिलीलीटर की बोतल में जोड़कर शीर्ष आगार की १०० मिलीलीटर तैयार करें । १०० मिलीलीटर और आटोक्लेव की मात्रा में पानी में विसर्जित ठोस । आटोक्लेव के बाद धीरे से बोतल पलटना 6-8 बार समाधान भर में आगर homogenize के लिए । बोतल में जगह ४५ & #176; ग जल स्नान के लिए 15-20 मिनट तक equilibrate तापमान .
  12. पौंड समाधान के साथ फेज शेयरों के धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार ।
    1. Add ९९० & #181; l £ ते 10 & #181; l फेज १००-गुना कमजोर पड़ने के लिए शेयर । भंवर को homogenize । 10 के एक कमजोर कारक के लिए, add १०० & #181; फेज स्टॉक के लिए ९०० & #181; l LB. भंवर को homogenize.
    2. के रूप में कई बार के रूप में इसके बाद के संस्करण कमजोर पड़ने श्रृंखला दोहराने सजीले टुकड़े की एक संख्या (10-100 सजीले टुकड़े) प्राप्त करने की जरूरत है ।
      नोट: इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, फेज/एमएल रिएक्शन के मामले में अपेक्षित फेज उपज से कम परिमाण के फेज स्टॉक 2-3 आदेश पतला । उदाहरण के लिए, यदि किसी विशेष फेज स्टॉक में 10 11 संक्रामक फेज/एमएल, प्लेट फेज स्टॉक एक 10 8 -गुना या 10 9 -गुना कमजोर पड़ने पर शामिल हैं ।
  13. 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूबों कोडांतरण द्वारा फेज titers के लिए एक क्षेत्र तैयार (संस्कृति ट्यूबों की संख्या फेज स्टॉक कमजोर पड़ने की संख्या के बराबर है चढ़ाया जा करने के लिए) । २.१२ कदम से पतला फेज स्टॉक नमूनों प्लेस और बर्फ पर २.१० कदम से मेजबान बैक्टीरियल कोशिकाओं ।
  14. एक मास्टर मिश्रण तैयार करके pipetting ५.२५ मिलीलीटर शीर्ष आगर (चरण २.११), २२० & #181; l पतला फेज नमूने (चरण २.१२), और ५० & #181; l मेजबान बैक्टीरियल कोशिकाएं (चरण २.१०) एक 14 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब करने के लिए । उच्च गति पर संस्कृति ट्यूब और भंवर टोपी ।
    1. Store को शेष फेज हल 4 & #176; ग.
  15. दो कल्चरल प्लेट्स (स्टेप २.१०) को ३७ & #176; सी मशीनर से पुनर्प्राप्त करें । पहले थाली के केंद्र के लिए मास्टर मिश्रण की २.५ मिलीलीटर धीरे जोड़ें (बुलबुले के बिना). धीरे से हाथ से थाली घुमाएँ मास्टर मिश्रण समान रूप से वितरित करने के लिए इतना है कि यह पूरी संस्कृति प्लेट spans. दूसरी थाली के साथ दोहराएं । शीर्ष आगर की solidification सुनिश्चित करने के लिए 20 मिनट तक प्रतीक्षा करें । ३७ पर मशीन प्लेटें & #176; C for 4-7 h.
  16. सजीले टुकड़े गिनती और प्रत्येक प्रतिक्रिया नमूना के लिए फेज एकाग्रता का निर्धारण.
    नोट: पट्टिकाओं मेजबान कोशिकाओं के अपारदर्शी कालीन में 1-2 mm स्पष्ट हलकों के रूप में दिखाई देगा । प्रतिनिधि परिणामों के लिए < सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 1 देखें. एक सफल फेज उत्पादन के अंतिम सांद्रता में परिणाम होगा 10 12 -10 13 फेज/एमएल.
< p class = "jove_title" > 3. डबल-कतरा जीनोम डीएनए निष्कर्षण

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: कमजोर पड़ने, झटकों, और केंद्रापसारक कदम phenol और जलीय चरणों के बीच एक मोटी, ठोस प्रोटीन सीमा परत को विकसित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । यह सबसे अधिक शुद्धता जीनोम है कि प्रोटीन संदूषणों से मुक्त कर रहे है उत्पंन करता है । प्रारंभिक कमजोर पड़ने अंतिम फेज titer पर निर्भर है । एक अत्यंत उच्च titer फेज शेयर (& #8805; 10 13 फेज/एमएल) निष्कर्षण से पहले एक 10-20-गुना कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है, जबकि कम titer स्टॉक्स (~ 10 10 -10 11 फेज/एमएल) केवल एक 2-गुना या कोई भी जरूरत हो सकती है । यदि यह बाद के चरणों में एक ठोस प्रोटीन परत बनाने के लिए मुश्किल है या जलीय निलंबन भी उच्च डीएनए एकाग्रता के कारण व्यावहारिक होना चिपचिपा है, फेज शेयरों की एक उच्च कमजोर पड़ने से पहले जारी निष्कर्षण पर विचार करें । किसी भी जीनोम-हैंडलिंग कदम के दौरान, यह महत्वपूर्ण है के लिए व्यापक बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करें जब किसी भी जलीय चरणों pipetting । कई फेज जीनोम काफी बड़े और आसानी से पिपेट कतरनी के माध्यम से खंडित कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, किसी भी भंवर स्पष्ट रूप से बचा जाना चाहिए के रूप में यह गंभीर रूप से जीनोम कतरनी होगा ।

  1. चरण २.९ से फेज शेयर के एक भाग को पतला करने के लिए ४०० & #181; एक ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 1x टीएम बफर के साथ एल.
  2. Tris के बराबर मात्रा में जोड़ें: Phenol: क्लोरोफॉर्म कमजोर पड़ने के लिए । एक प्रयोगशाला झूली कुरसी पर धीरे मिश्रण हिला, या हाथ से, के लिए 5 min. १७,००० x g पर परिणामी पायस एक benchtop में 5-10 min.
    के लिए केंद्रापसारक नोट: अंतर्निहित phenol चरण की सतह पर एक अलग, सफेद प्रोटीन परत मौजूद है ।
  3. ऊपरी जलीय चरण एक नई ट्यूब करने के लिए चरण सीमा परेशान नहीं देखभाल लेने के लिए निकालें ।
  4. दोहराएं चरण 3.2-3.3 3 phenol निकालने की कुल के लिए एक अतिरिक्त 2 बार । एक ताजा ट्यूब के लिए जलीय चरण स्थानांतरण और CHCl 3 के एक बराबर मात्रा में जोड़ें । शेक और केंद्रापसारक (३.२ कदम) । एक साफ ट्यूब के लिए जलीय डीएनए नमूना हस्तांतरण.
  5. शुद्ध डीएनए की मात्रा का अनुमान है । 3 एम सोडियम एसीटेट (CH 3 COONa) और ९५% इथेनॉल (ेतोः) के 3 संस्करणों के ०.४ संस्करणों को जोड़ें । में जगह-20 & #176; सी रात के वर्ष के लिए फ्रीजर । 10-15 min.
    के लिए एक benchtop केंद्रापसारक में १७,००० x g पर केंद्रापसारक नोट: डीएनए तुरंत निर्जलीकरण और ट्यूब में निलंबन में एक जन के रूप में दिखाई बन जाएगा । उचित परिणामस्वरूप गोली सफेद और अच्छी तरह से ट्यूब के नीचे के खिलाफ पैक है ।
  6. को हटाने और supernatant को या तो त्याग कर या pipetting से हटा दें । Add ५०० & #181; L ७०% ेतोः और धीरे ट्यूब हिला जब तक गोली ट्यूब के नीचे से मुक्त मंगाई । 5 मिनट के लिए १७,००० x g पर केंद्रापसारक । निकालें और ेतोः त्यागें, देखभाल करने के लिए गोली परेशान नहीं ले ।
  7. चरण ३.६ दोहराएँ । एयर benchtop पर गोली 30-60 मिनट के लिए सूखी । Add ५० & #181; L ddH 2 ओ को गोली और 1 ज पर आरटी या रात भर में 4 & #176; C को पुनर्स्थगित करने के लिए । निर्धारित डीएनए २८० एनएम पर अवशोषण माप का उपयोग एकाग्रता ।
    नोट: अपेक्षित सांद्रता 0.5-5 & #181; g/& #181; L इस तकनीक का उपयोग कर रहे हैं । कुल जीनोमिक आणविक वजन से विभाजित करने के लिए अंतिम जीनोम एकाग्रता निर्धारित करते हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. सेल-फ्री फेज रिएक्शन और फेज Titer प्रयोग

  1. 25 ग्राम पौंड मध्यम और 15 ग्राम bacto-आगर ठोस, 1 एल बोतल में डालो, और 1 एल आटोक्लेव.
    2. करने के लिए पानी जोड़ने के लिए तैयार । नसबंदी के बाद
  2. , बोतल पलटना धीरे से 6-8 बार ध्यान लेने के लिए बुलबुले के गठन से बचने के । बोतल उलटा 1 L समाधान भर में ठोस आगर homogenize होगा । बोतल को एक ५८ & #176 में रखें; सी संस्कृति प्लेटों पर वितरण से पहले 20 मिनट के लिए सी जल स्नान ।
  3. एक बार पौंड का तापमान-आगर समाधान equilibrated है, एक लौ संस्कृति प्लेटों के बगल में खुले संस्कृति प्लेटों के पास पर्यावरण निष्फल करने के लिए तैयार करते हैं । aliquots बनाते समय आगर के solidification से बचने के लिए 1 एल बॉटल को पानी में नहाने के लिए रखें । एक १०० मिमी x 15 मिमी संस्कृति प्लेट में 25 मिलीलीटर जोड़ें । 1 एल ४० संस्कृति प्लेटों का उत्पादन होगा.
  4. एक संस्कृति थाली अलग सेट और जाने के लिए आर टी में कम से 1 ज के लिए जमना; इस प्लेट मेजबान कोशिकाओं चढ़ाना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । अंय ३९ संस्कृति प्लेटें 2 दिन के लिए RT. Store पर 4 & #176; C या titers.
    5. बनाने के लिए तुरंत उपयोग के लिए जमना
  5. प्लेट उपयुक्त जीवाणु तनाव लकीर द्वारा मेजबान कोशिकाओं ( जैसे, मेजबान B for T7) जो-८० & #176; C पर संग्रहित किया गया था, पौंड-आगर कल्चर प्लेट पर । पर्यावरण संदूषण से बचने के लिए एक खुली लौ के बगल में लकीर । ३७ पर रात भर मशीन & #176; C. मेजबान कोशिकाओं कोई एंटीबायोटिक प्रतिरोध तो एक बाँझ वातावरण में काम कर रहा है आवश्यक है ।
  6. सेल-फ्री रिएक्शन
    नोट: सेल मुक्त TXTL प्रतिक्रियाओं ३३% क्रूड ई. कोलाई निकालने (8.9-9.9 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन) अंय ६७% की प्रतिक्रिया बफर और फेज जीनोम के शामिल के साथ बना रहे हैं । क्रूड निकालने के पहले वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है < सुप class = "xref" > 15 , < सुप class = "xref" > 16 . अंतिम प्रतिक्रिया की शर्तें हैं: 8.9-9.9 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन (कच्चे तेल निकालने से), 3-6 मिमी मिलीग्राम-ग्लूटामेट, 40-100 मिमी K-ग्लूटामेट, 2-4% खूंटी ८०००, 3-4 मिमी प्रत्येक एमिनो एसिड, पहले वर्णित के रूप में तैयार < सुप वर्ग = "xref" > 17 , और एक ऊर्जा मिश्रण समाधान, वर्णित पहले < सुप वर्ग = "xref" > 15 , 0.33-3.33 मिमी डीटीटी, ५० मिमी HEPES, १.५ मिमी एटीपी और GTP, ०.९ मिमी CTP और UTP, ०.२ मिलीग्राम/एमएल tRNA, ०.२६ मिमी CoA, ०.३३ मिमी णड, ०.७५ मिमी शिविर, ०.०६८ मिमी folinic एसिड, 1 मिमी spermidine, और 30 मिमी 3-पीजीए से बना । डीएनए-प्रकार phages 0.5-10 एनएम के जीनोम सांद्रता की आवश्यकता होती है और आरएनए-प्रकार phages 50-150 एनएम की एक सीमा की आवश्यकता होती है । अंतिम प्रतिक्रिया सांद्रता संश्लेषित विशेष फेज के लिए अद्वितीय है और ऊपर वर्णित पर्वतमाला के भीतर गिर जाएगी । प्रतिक्रियाओं के इष्टतम ऑक्सीजन के लिए, अंतिम प्रतिक्रिया संस्करणों के बीच होना चाहिए 10-20 & #181; L प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल है, जो जीनोमिक अणु के रूप पर निर्भर में छोटे बदलाव कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, रैखिक जीनोम अणुओं की प्रतिक्रिया में एक अतिरिक्त घटक की आवश्यकता के लिए कच्चे तेल निकालने में मौजूद recBCD एंजाइम द्वारा रैखिक डीएनए टुकड़े के पाचन को बाधित ।
    1. पूरा द & #34; अभिक्रिया विवरण & #34; तालिका 1 (PhageTXTL_JOVE) में अनुभाग प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या और प्रतिक्रिया के अंतिम खंड दर्ज करके.
    2. लगातार घटकों और प्रतिक्रिया के चर घटकों का निर्धारण करके प्रयोग डिजाइन । मास्टर मिश्रण है, जो अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा और नमूनों की संख्या के उत्पाद के लिए निरंतर प्रतिक्रिया घटकों की कुल मात्रा का अनुपात है की आंशिक मात्रा प्रतिशत दर्ज करें । रिएक्शन रिएजेंट के शेयर और अंतिम सांद्रता में दर्ज करें & #34; मास्टर मिक्स रिएक्शन रेसिपी & #34; सेक्शन इन PhageTXTL_JOVE. परीक्षण किया जा करने के लिए स्टॉक और चर एजेंट (ओं) के अंतिम सांद्रता दर्ज करें.
      नोट: प्रतिक्रिया घटकों की मात्रा मास्टर मिश्रण मात्रा और प्रत्येक व्यक्ति की प्रतिक्रिया के अंतिम खंड के आधार पर स्वचालित रूप से गणना की जाएगी.
    3. आवश्यक मात्रा में नलियों को निकालें (& #34 में दर्शाया गया है; ट्यूबों to गल & #34; PhageTXTL_JOVE. xlsx) की धारा क्रूड सेल निकालने, ऊर्जा बफर मिक्स, और एमिनो एसिड मिक्स से-20 & #176; c या-८० & #176; सी और गल पर बर्फ.
      नोट: एक बार गल, जैसे घटकों के कई aliquots गठबंधन (यदि आवश्यक हो तो) ।
    4. Aliquot क्रूड निकालने की संकेत मात्रा, अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का ३३%, एक microcentrifuge ट्यूब में ।
    5. टेबल 1 के अनुसार मास्टर मिक्स तैयार करें । Homogenize सभी अवयव & #34; मास्टर मिक्स रिएक्शन रेसिपी & #34; भंवरा करके । कच्चे तेल निकालने के लिए प्रत्येक घटक के उपयुक्त मात्रा में जोड़ें ।
    6. अगर रैखिक डीएनए जीनोम ( eg, T7) के साथ एक फेज के साथ काम कर रहे हैं, जोड़ें 1 & #181; गैम प्रोटीन के भोजी लैंब्डा की प्रतिक्रिया < सुप वर्ग = "xref" > ११ . भंवर homogenize समाधान के लिए, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया जगह है । यह recBCD परिसर, जो कच्चे तेल निकालने में अंतर्जात है द्वारा रैखिक डीएनए टुकड़े के पाचन को रोकता है ।
    7. तालिका 1 के अनुसार अंतिम घटक जोड़ने के बाद, homogenize प्रतिक्रिया भंवर द्वारा । n microcentrifuge ट्यूबों में मास्टर मिश्रण भाजित.
      नोट: प्रत्येक विभाजन की मात्रा आंशिक मास्टर मिश्रण मात्रा प्रतिशत और प्रतिक्रिया के अंतिम मात्रा के उत्पाद है. उदाहरण के लिए, ९०% की एक आंशिक मास्टर मिश्रण मात्रा प्रतिशत और 12 & #181 के अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए; l, प्रत्येक विभाजन की मात्रा १०.८ & #181 है; l.
    8. चर घटकों के इंगित खंड मास्टर मिश्रण सरणी के लिए जोड़ें ( तालिका 1 देखें) । वांछित अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पानी जोड़ें । Homogenize प्रत्येक प्रतिक्रिया भंवर द्वारा । पर microcentrifuge ट्यूबों की मशीन 29 & #176; C के लिए कम से 8 h या रात भर.
  7. होस् सेल प्री-कल्चर
    नोट: रात भर पूर्व संस्कृति पतला 50:1 यह सुनिश्चित करने के लिए कि मेजबान कोशिकाओं titer प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया मध्य लॉग चरण में हैं, जो संक्रमण दक्षता बढ़ जाती है । मध्य लॉग कोशिकाओं तो फिर से 10 गुना और बर्फ पर संग्रहित द्वारा केंद्रित कर रहे हैं ।
    1. एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर, लगाना 3-5 स्वस्थ मेजबान सेल कालोनियों के साथ 5 मिलीलीटर पौंड की एक संस्कृति ट्यूब । संक्रमण से बचने के लिए एक खुली लौ के बगल में काम करें ।
    2. ३७ & #176 पर एक मिलाते हुए मशीन में संस्कृति ट्यूब, सी और 16 ज या रात भर के लिए २५० rpm की मशीन । कोशिकाओं अगले दिन से संतृप्ति चरण तक पहुँच सकते हैं.
  8. मेजबान सेल संस्कृति और नमूना तैयारी के लिए फेज titer
    1. औषधालय एक ५०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी और एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर में ५० मिलीलीटर पौंड । गर्म कुप्पी पर ३७ & #176; ग के लिए 20 min.
    2. Aliquot पूर्व में मेजबान सेल रातोंरात पूर्व संस्कृति के 1 मिलीलीटर-गरम पौंड. 3-4 ज के लिए ३७ & #176 पर मशीन; सी और मिलाते हुए २५० rpm पर ।
    3. ५० मिलीलीटर मेजबान सेल संस्कृति 10 मिनट के लिए ५,००० x g पर छोड़ें LB.
    4. ठंड के साथ गोली reसस्पेंड (4 & #176; C) 5 मिलीलीटर पौंड और बर्फ पर रखें.
      5. titer प्रयोग शुरू करने से पहले एक घंटे
    5. , ३७ & #176 पर कल्चर प्लेट्स की मशीन; C.
      नोट: प्रत्येक अद्वितीय फेज प्रतिक्रिया (और इसी कमजोर पड़ने कारक) दो प्लेटों का उपयोग करेगा । इसके अतिरिक्त, प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए 4 प्लेटें (< मजबूत वर्ग देखें = "xfig" > चित्रा 1 प्रतिनिधि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए).
    6. शीर्ष आगर (चरण २.११) की १०० मिलीलीटर तैयार करें.
  9. धारा २.१२ में वर्णित के रूप में पौंड समाधान के साथ सेल मुक्त प्रतिक्रिया के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार ।
  10. फेज titer
    नोट: करने के लिए थाली शुरू संस्कृति व्यंजन के बाद से कम 1 ज के लिए मशीन है और शीर्ष आगार ४५ & #176 में था, आटोक्लेव से हटाने के बाद 15-20 मिनट के लिए सी जल स्नान ।
    1. Titer अंतिम सेल मुक्त प्रतिक्रिया पौंड समाधान के रूप में खंड 2 में वर्णित है, 2.14 कदम-2.16.

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Representative Results

हम चार प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं । चित्रा 1में, हम नकारात्मक नियंत्रण का एक सेट वर्तमान सुनिश्चित करने के लिए कि सेल मुक्त TXTL प्रणाली और फेज डीएनए स्टॉक ई. कोलाई कोशिकाओं के रहने के साथ प्रदूषित नहीं कर रहे हैं । हम सत्यापित करें कि सेल मुक्त TXTL प्रणाली बरकरार ई. कोलाई सेल संदूषण से मुक्त है दोनों एक गैर-गर्मी और जीनोमिक डीएनए के मशीन की प्रतिक्रिया समाधान शूंय (चित्रा 1एक और चित्रा 1बी) चढ़ाना द्वारा । यदि सेल मुक्त TXTL प्रणाली ई. कोलाई कोशिकाओं के साथ दूषित हो गया था, विकास थाली पर मनाया जाएगा । इसके अलावा, हम सेल मुक्त प्रतिक्रिया, और इसलिए नहीं किसी भी संभव contaminant कोशिकाओं, फेज जीनोम के साथ गैर-मशीनी और मशीन प्रतिक्रियाओं चढ़ाना द्वारा फेज के संश्लेषण के लिए जिंमेदार है कि पुष्टि (चित्रा 1सी और चित्रा 1डी) । गैर-मशीन प्रतिक्रिया के साथ प्लेट (चित्रा 1ग) शून्य पट्टिका से पता चलता है, जबकि मशीन की प्रतिक्रिया के साथ प्लेट (चित्रा 1घ) पट्टिका से पता चलता है, सेल मुक्त TXTL प्रणाली का संकेत फेज के लिए जिंमेदार था संश्लेषण.

चित्रा 2में, हम सजातीय पट्टिका परख बनाम एक सजातीय तुलना । चित्र 2 बी संस्कृति की थाली है, जो उप में थाली के एक सजातीय पट्टिका घनत्व 2एमें की तुलना में इष्टतम है भर में पट्टिका घनत्व के एक ढाल दिखाता है । इस मनाया परिणाम के स्रोत के प्रयोग के फेज titer भाग के दौरान एक संस्कृति की थाली पर तिरस्कृत जब शीर्ष आगार, नमूना और मेजबान बैक्टीरियल कोशिकाओं के मास्टर मिश्रण के तेजी से ठंडा करने से है । फेज सजीले टुकड़े के एक सजातीय प्रसार से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि फेज titer प्रयोग शुरू करने से पहले संस्कृति प्लेटें ३७ ° c करने के लिए equilibrated हैं ।

एक महत्वपूर्ण कदम ठीक से phages गिनती करने के लिए फेज समाधान पर्याप्त प्लेट प्रति ५० और २०० सजीले टुकड़े के बीच प्राप्त करने के लिए है (चित्रा 3) । इस रेंज के नीचे, यह सच आँकड़े निर्धारित करने के लिए मुश्किल है, और इस रेंज के ऊपर, पट्टिकाओं ओवरलैप, सटीक गिनती को रोकने. TXTL में संश्लेषित phages की संख्या जैव रासायनिक सेटिंग्स पर निर्भर करता है, जैसे लवण की एकाग्रता (पोटेशियम और मैग्नीशियम), आणविक भीड़ की, और जीनोम के. चित्रा 4में, हम phages T7 और φχ १७४ के लिए परीक्षणों के कुछ उदाहरण दिखाते हैं । T7 के रूप में अपने डीएनए, प्रतिकृति करता है कि एक फेज के लिए, हम कोशिका मुक्त प्रतिक्रिया में फेज संश्लेषण की एक उच्च दक्षता का पालन: तीन संक्रामक phages प्रतिक्रिया में जीनोम अणु प्रति संश्लेषित कर रहे हैं. एक फेज के लिए प्रतिक्रिया की एक कम दक्षता की उंमीद कर सकते है कि इसके डीएनए, इस तरह के φχ १७४ के रूप में नहीं दोहराने: जीनोम अणु को संश्लेषित संक्रामक फेज के अनुपात 1:5 है ।

Figure 1
चित्र 1: पट्टिका परख नियंत्रण और सफल संक्रामक फेज एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया (CFR) प्रणाली का उपयोग कर उत्पादन । (A) कोई जीनोम जोड़ा गया था और कोई मशीन (मशीन समय के रूप में 0 मिनट) CFR का प्रदर्शन किया गया था । प्रतिक्रिया तो मेजबान ई. कोलाईबिना चढ़ाया गया था । परिणाम CFR के कोई व्यवहार्य होस्ट सेल प्रदूषित दिखाता है । (B) कोई जीनोम नहीं जोड़ा गया था और CFR 29 ° c में 12 ज की मशीन की गई थी और होस्ट ई. कोलाईके बिना चढ़ाया गया था । परिणाम भी मशीन के बाद, CFR के कोई व्यवहार्य मेजबान सेल प्रदूषित दिखा । (ग) 1 एनएम जीनोम CFR (मशीन समय के रूप में 0 मिनट) की कोई मशीन के साथ शामिल है और मेजबान ई. कोलाईके साथ चढ़ाया । परिणाम जीनोम समाधान के कोई फेज संदूषण से पता चलता है । (D) 1 एनएम जीनोम शामिल किया गया और CFR 29 ° c में 12 घंटे की मशीन । और मेजबान ई. कोलाईके साथ चढ़ाया । परिणाम में सफल संक्रामक फेज प्रतिकृति CFR दिखाएँ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : titer प्रयोग के दौरान फेज रिएक्शन के सजातीय बनाम सजातीय प्रसार । संस्कृति प्लेट के पार फेज प्रतिक्रिया के सजातीय प्रसार ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान के लिए नहीं equilibrated कल्चर प्लेट्स पर एक फेज titer प्रदर्शन का एक संभव प्रभाव है । एक अच्छा परिणाम फेज प्रतिक्रिया का एक सजातीय प्रसार प्रदर्शित (ए) में दिखाया गया है, जहां पट्टिकाएं समान रूप से थाली की सतह भर में वितरित कर रहे हैं । एक उप-इष्टतम परिणाम (B) में दिखाया गया है, जहां पट्टिकाओं को संस्कृति की थाली के निचले-बाएं भाग में केंद्रित कर दिया जाता है । यह शीर्ष-आगार के साथ हो सकता है, फेज प्रतिक्रिया, और मेजबान सेल मास्टर मिक्स एक संस्कृति की थाली है कि ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान पर नहीं है पर तिरस्कृत कर रहे हैं । अधिकांश मास्टर मिक्स निचले-बाएँ क्षेत्र में जम जाते हैं, और एक सजातीय प्रसार संभव नहीं है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एक सेल मुक्त फेज प्रतिक्रिया के titers के लिए एक उपयुक्त कमजोर पड़ने कारक की स्थापना । (A) यह प्लेट सजीले टुकड़े की एक यथोचित संख्या गिनती प्रदर्शित करता है । प्रयोग के titer भाग के लिए इस्तेमाल की कमजोर पड़ने कारक पर्याप्त फेज प्रतिक्रिया की उपज पतला करने के लिए थाली पर सजीले टुकड़े की एक संख्या गिनती छोड़ । इसके विपरीत में (ख) कमजोर पड़ने का पहलू भी संश्लेषित फेज की उपज के संबंध में कम था, और समायोजित करने की जरूरत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : phages के सेल मुक्त संश्लेषण का लक्षण वर्णन φχ १७४ व T7 । (क) संश्लेषित φχ की संख्या १७४ और T7 phages (PFU/एमएल: plaquई milliliter प्रति इकाइयों के गठन) सेल में ८००० एकाग्रता खूंटी के एक समारोह के रूप में मुक्त प्रतिक्रिया, 29 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 16 ज के बाद मापा । (ख) कोशिका-मुक्त प्रतिक्रिया में मैग्नीशियम-ग्लूटामेट एकाग्रता के एक समारोह के रूप में संश्लेषित φχ १७४ और T7 phages की संख्या 29 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 16 घंटे के बाद मापा जाता है । (C) कक्ष-मुक्त प्रतिक्रिया में φχ १७४ डीएनए जीनोम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में संश्लेषित φχ १७४ फेज की संख्या 29 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 16 ज के बाद मापा । (D) कोशिका-मुक्त प्रतिक्रिया में T7 डीएनए जीनोम एकाग्रता के एक समारोह के रूप में संश्लेषित T7 फेज की संख्या 29 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 16 ज के बाद मापा । प्रदर्शित सभी त्रुटि सलाखों के तीन दोहराया परीक्षणों के मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: प्रतिक्रिया संरचना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चेन में तकनीक के बाद, एट अल. 14 SPMC के लिए, superinfection के लिए उचित शर्तों का निर्धारण करते समय एक महत्वपूर्ण कदम पहुंच जाता है । पैरामीटर है कि सबसे निकट से एक मेजबान है तनाव superinfection को झेलने की क्षमता को नियंत्रित अक्सर संक्रमण फेज की प्रारंभिक एकाग्रता है । मेजबान कोशिकाओं फेज की एक बहुत छोटी राशि के साथ प्रारंभिक संक्रमण से पहले लघुगणक विकास चरण में होना चाहिए । अंततः, फेज भी लघुगणकीय वृद्धि तक पहुंच जाएगा और लक्ष्य फेज संख्या तेजी से सेल गिनती आगे बढ़ना, प्रत्येक मेजबान सेल में फेज की एकाधिक प्रतियां के लिए अनुमति देने के लिए है । यह एक अर्ध स्थिर राज्य में सेल बलों जहां यह lysis से गुजरना नहीं होगा । यदि इस राज्य तक पहुंच नहीं है, कोशिकाओं को व्यापक, धाराप्रवाह lysis से गुजरना होगा, और उनके वायरल लोड जारी । यदि superinfection ऊपर प्रारंभिक वायरल सांद्रता का उपयोग कर नहीं पहुंचा जा सकता है, एक बाद में प्रयास करने से पहले दस के एक पहलू से संक्रमण के प्रारंभिक गुणा कम । फसल और superinfection तक पहुँच नहीं है से पहले होस्ट कक्षों लाइसे करते हैं, तो एक अलग शुद्धि प्रक्रिया के साथ तुरंत आगे बढ़ें । सभी सेलुलर lysis को अंतिम रूप देने के लिए DNase I को 5 µ g/mL और ५०० µ l CHCl3 जोड़ें । एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए घूमता है और फिर १०,००० x जी पर केंद्रापसारक को सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए जारी रखें । खिचड़ी भाषा और 1-2 एच के लिए ७५,००० x जी में supernatant केंद्रापसारक फेज गोली और मिलाते हुए बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर कुल 1x TM बफर में रातोंरात reसस्पेंड । जब कोशिकाओं की एक छोटी सी मात्रा का उपयोग कर superinfection के लिए परीक्षण, यह गेज कैसे करीब कोशिकाओं से lysis करने के लिए कर रहे हैं संभव है कैसे जल्दी से वे लाइसे जब जोड़ा क्लोरोफॉर्म के संपर्क में. यदि कोशिकाओं लाइसे और समाधान लगभग तुरंत स्पष्ट है, सेल दीवारों बहुत अस्थिर कर रहे है और कोशिकाओं को तुरंत काटा जाना चाहिए बड़े पैमाने पर झरना lysis को रोकने के लिए । यदि परीक्षण lyses 1-3 मिनट के भीतर, बड़ी मात्रा के लिए 2 ज तक के लिए superinfect के लिए जारी रख सकते हैं, उपयोग में ई. कोलाई के स्थानीय तनाव पर निर्भर करता है । यदि 5 मिनट के भीतर कोशिकाओं लाइसे नहीं है, फेज विकास ई. कोलाई विकास और प्राथमिक मशीन के लिए नहीं पकड़ा है जारी रखना चाहिए । 30-60 मिनट में फिर से परीक्षण करते हैं ।

जब एक तैयार सुक्रोज ढाल पर फेज शुद्ध, फेज एक बहुत मोटी के रूप में दिखाई देगा, pearlescent बैंड एक तिहाई और ट्यूब नीचे रास्ते से दो तिहाई के बीच । एक अपेक्षाकृत सफल lysis और सेलुलर अवशेष शुद्धिकरण कदम मानते हुए, वहां अंय, प्रकाश बैंड लेकिन समान घनत्व या आकार के कोई भी हो सकता है । बड़े, अपारदर्शी बैंड फेज शामिल है और एक बाँझ सिरिंज और कुंद प्रवेशनी के साथ समाधान से हटाया जा करने के लिए है.

जब प्रोटोकॉल के तीसरे खंड शुरू, सेल मुक्त प्रतिक्रिया और फेज titer, यह सबसे अच्छा है ताजा संस्कृति प्लेट (एक सप्ताह से कम पुराने) का उपयोग मेजबान बैक्टीरिया की थाली (३.५ कदम से) के लिए और भी संस्कृति titer विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया प्लेट (३.२१ कदम से) । यह फेज titer के लिए मेजबान बैक्टीरिया कोशिकाओं और उच्च संक्रमण क्षमता के मजबूत विकास को बढ़ावा देगा । फेज संस्कृति प्लेटें पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच की एक ंयूनतम के लिए प्रोटोकॉल के फेज titer भाग शुरू करने से पहले मशीन होना चाहिए । पूर्व फेज संस्कृति प्लेटों की मशीन के बिना, शीर्ष-आगर समाधान (संश्लेषित फेज और मेजबान सेल संस्कृति युक्त) संस्कृति की थाली की सतह भर में वितरित homogeneously नहीं होगा । इसके बजाय, शीर्ष-आगर समाधान homogeneously सतह (चित्रा 2बी) पर जमना होगा । यह एक ही स्थान में एकाधिक phages स्थानीयकरण की संभावना बढ़ जाती है, जो सेल मुक्त प्रतिक्रिया में फेज उपज का एक मूल्यवान समझना पैदा कर सकता है ।

प्रत्येक पट्टिका एक संश्लेषित फेज की घटना का प्रतिनिधित्व करता है एक मेजबान सेल संक्रमण, मेजबान सेल के भीतर नकल, और मेजबान सेल lysing । सजीले टुकड़े प्रारंभिक संक्रमण घटना से पड़ोसी मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित संतति फेज से गर्मी की अवधि के दौरान आकार में वृद्धि । यदि कोई पट्टिकाओं मनाया जाता है, यह संभव है कि कमजोर पड़ने का कारक प्रोटोकॉल ४.६ अनुभाग में बनाया बहुत अधिक है जिसके परिणामस्वरूप एक कम संभावना है कि किसी भी संश्लेषित फेज एक मेजबान सेल संक्रमित । यह उपाय करने के लिए, परिमाण के 3-4 आदेश द्वारा कमजोर पड़ने कारक कमी (या के रूप में आवश्यक) और titer प्रयोग दोहराएं । इसके विपरीत, कमजोर पड़ने का कारक भी संस्कृति की थाली की पूरी सतह फैले सजीले टुकड़े में जिसके परिणामस्वरूप उच्च हो सकता है, यह असंभव फेज उपज गिनती करने के लिए बना । इस मामले में, कमजोर पड़ने फैक्टर के परिमाण के 3-4 आदेश (या के रूप में आवश्यक) वृद्धि हुई है । एक अच्छी तरह से विशेषता फेज के लिए, कोशिका की उपज मुक्त प्रतिक्रिया ज्ञात हो जाएगा और केवल एक कमजोर पड़ने कारक प्रतिक्रिया बिंदु प्रति titer प्रयोग के लिए आवश्यक हो जाएगा । जब निस्र्पक एक नया फेज, यह प्रतिक्रिया बिंदु प्रति 2-3 विभिंन कमजोर पड़ने वाले कारकों को शामिल करने के लिए सबसे अच्छा है, यह सुनिश्चित करना है कि कमजोर पड़ने वालों में से एक एक गणना पट्टिका निकलेगा ( चित्रा 3 देखें पर पट्टिकाओं की एक गिनती और बेशुमार संख्या के बीच मतभेदों के लिए एक थाली) ।

यदि कोई पट्टिका फेज titer के कमजोर पड़ने कारक संशोधित करने के बाद मनाया जाता है, यह संकेत सकता है कि कोशिका मुक्त प्रतिक्रिया है कि जीन अभिव्यक्ति में असफल नहीं हुआ था । इस के लिए एक संभव विवरण रिएजेंट के संरचनात्मक क्षति हो सकता है/फेज डीएनए की वजह से सेल के homogenization को भंवर द्वारा मुक्त प्रतिक्रिया । इस मुद्दे को उपाय करने के लिए, धीरे-धीरे एक उंगली के साथ पांच से सात बार रिएक्शन ट्यूब दोहन द्वारा प्रतिक्रिया और homogenize दोहराएं, या एक पिपेट पांच से सात बार के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण से ।

सेल मुक्त प्रतिक्रिया प्रणाली ई. कोलाई और endogenously से शुरू होता है दोनों ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ और प्राथमिक सिग्मा कारक, सिग्मा ७०, जो मुख्य प्रवर्तक आम सहमति पहचान करने के लिए आवश्यक holoenzyme के रूप में गठबंधन शामिल ई. कोलाई जीन का जुगाड़ । इसके अतिरिक्त, सेल मुक्त प्रतिक्रिया प्रणाली सिग्मा ७० के प्रवर्तक आम सहमति अनुक्रम के तहत छह अन्य ई. कोलाई सिग्मा कारक जीन की आपूर्ति exogenously द्वारा पूरे सिग्मा कारक प्रतिलेखन योजना दोहराऊंगा कर सकते हैं. यह क्षमता सभी bacteriophages जिनके जीनोम के साथ संगत कर रहे है संश्लेषित करने की अनुमति देता है ई. कोलाईप्रतिलेखन/ यह बाहर भोजी का एक सबसेट है कि अध्ययन नहीं किया जा सकता है या सेल मुक्त प्रतिक्रिया यहां उपयोग प्रणाली के साथ संश्लेषित छोड़ देता है ।

सेल मुक्त प्रतिलेखन/अनुवाद मंच नियंत्रण और प्रतिक्रिया की स्थिति के लचीलेपन के एक प्रभावशाली स्तर के लिए vivo में अध्ययन के तरीकों की तुलना में अनुमति देता है । हम पतले एक फेज प्रतिक्रिया के कई जैव रासायनिक और आनुवंशिक घटकों धुन कर सकते है और सीधे से कम 24 घंटे में प्रभाव का निरीक्षण, के रूप में आणविक भीड़ के लिए चित्रा 4 में दिखाया गया है । macromolecular परिसरों की आत्म-सभा पर खूंटी जैसे आणविक भीड़ के प्रभाव को सैद्धांतिक रूप से वर्णित किया गया है और इन विट्रो में18,19,20का प्रदर्शन हुआ । आणविक भीड़ एक एन्ट्रापी संचालित तंत्र है कि बड़े पैमाने पर आणविक संरचनाओं के संघ लगातार बढ़ जाती है । सेल मुक्त दृष्टिकोण शोधकर्ता स्वयं के जैव भौतिकी की तरह जटिल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है मॉडल सिस्टम के साथ विधानसभा, bacteriophages की तरह, vivo काम में की आंतरिक सीमाओं के बिना ।

यह प्लेटफार्म एप्लाइड फिल्ड में phages की उपयोगिता की जांच के लिए भी अनुमति देता है । फेज जीनोम के घटकों को पुनः निर्धारित किया जा सकता है और जल्दी से एक सेल में परीक्षण nanostructures उपंयास के लिए परिणामों को शामिल करने के लक्ष्य के साथ मुक्त प्रतिक्रिया प्रणाली । Bacteriophages को होस्ट सेल संक्रमण के selectivity को बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जो एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए एक विकल्प के रूप में फेज थेरेपी की उपयोगिता को बढ़ावा देगा ।

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Disclosures

लेखक निंनलिखित प्रतिस्पर्धा वित्तीय ब्याज (ओं) की घोषणा: Noireaux प्रयोगशाला MYcroarray, MYtxtl सेल के एक वितरक से मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति किट अनुसंधान कोष प्राप्त करता है ।

Acknowledgments

इस सामग्री के कार्यालय द्वारा समर्थित काम पर आधारित है नौसेना अनुसंधान पुरस्कार संख्या N00014-13-1-0074 (to एन), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान संख्या RGP0037/2015 (to एन), और Binational विज्ञान फाउंडेशन अनुदान २०१४४०० (to एन) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक १२६ सेल मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TXTL) भोजी ई. कोलाई पट्टिका परख फेज प्रवर्धन फेज जीनोम शोधन सिंथेटिक जीवविज्ञान
एक <em>ई. कोलाई</em>आधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण
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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall,… More

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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