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Artículo de método

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

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DOI:

10.3791/56441

⸱

12 de abril de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

En este artículo

Resumen

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Resumen

Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.

Introducción

Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años1y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un "misterio abominable" por Charles Darwin2. El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores3,4,5,6 . La alta variación en forma floral y estructura, así como los modos de reproducción sexual y asexual, confiando en ellos, hacer la flor una estructura altamente compleja. Esto ha llevado a diversos esfuerzos por caracterizar las anatomía y características estructurales de los órganos florales, técnicas de luz y electrónica microscópica que podría combinarse con la investigación genética y molecular7. Además, como fuente de frutos y semillas, las flores son de suma importancia para la nutrición humana y animal. Por lo tanto, la caracterización del desarrollo de la flor y la fruta tiene muchas implicaciones para la investigación aplicada, incluyendo la seguridad alimentaria de una población humana creciente y las estrategias de conservación ecológica en un cambiante ambiente8 , 9 , 10.

Desarrollo de la flor en Arabidopsis comienza con la inducción floral y la transformación de lo meristemo vegetativo a un meristemo de la inflorescencia (grupo de flores). Primordios de flores se inician lateralmente en el flanco de la inflorescencia meristem11. Los primordios de órganos florales forman progresivamente en verticilos concéntricos desde el exterior al centro de la flor y eventualmente convierten en sépalos, pétalos, estambres y carpelos7. Estos órganos florales cumplen protección nutritiva, distinta y funcional (por ejemplo, atracción de polinizadores) papeles en diferentes especies de plantas, con los órganos sexuales, sostener el desarrollo de los gametofitos masculinos y femeninos, respectivamente12 , 13. los gametofitos, a su vez, cada uno distinguen un par de hombre (espermatozoides) y los gametos femeninos (óvulo y célula central), que se unen con doble fertilización para formar la próxima generación, el zigoto y el endosperma primario, un soporte de tejido terminal la desarrollo del embrión14,15. Apoyo al desarrollo de frutos y semillas el crecimiento, maduración y conservación del embrión y, eventualmente, su dispersión. Se ha realizado una amplia investigación para caracterizar el desarrollo flor y embriones de diversas especies, especialmente en la especie modelo Arabidopsis7,16,17.

Primeros análisis microscópicos del desarrollo de la flor se basaron en la observación técnicas tal como parafina o incrustación de resina y seccionamiento, combinación con la luz o la microscopía electrónica y procesamiento de las muestras requiere mucho tiempo. Estas técnicas microscópicas tradicionales fueron utilizadas a menudo en combinación con las investigaciones genéticas moleculares, como el análisis microscópicos de mutantes, la localización del ARN mediante hibridación en situ o la inmuno detección de proteínas. Recientes avances en microscopía de fluorescencia confocal y de amplio campo, en análisis de imagen asistido por ordenador 3D de estado de la técnica y el refinamiento continuo de los métodos moleculares que pueden utilizarse en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a la necesidad de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo que son preferentemente susceptibles de análisis cuantitativos. En los últimos años ha realizado progresos significativos en el desarrollo de técnicas claro espécimen animal montaje en conjunto. Procesar la muestra transparente mediante reactivos de urea o azúcar-base acuosa (p. ej., escala, SeeDB, cúbico)18,19,20, o eliminando selectivamente lípidos (usando el detergente SDS) después de inclusión de muestras en hidrogeles estables; la eliminación de lípidos puede lograr ya sea por difusión pasiva (p. ej., modificado claridad protocolo21, pacto-PARS-llantas22) o activamente por electroforesis (original claridad protocolo23 y24de la ley-PRESTO). Alentado por este progreso rápido, algunas técnicas derivadas también están surgiendo para su uso en las plantas.

En este trabajo métodos centrado en el modelo de Arabidopsis, describimos el procedimiento para la adecuada disección de capullos, flores y jóvenes silicuas y claro de todo Monte muestras para coloración diversa y procedimientos de observación mediante clásico o un método reciente de compensación basada en la SDS. Se dan ejemplos para almidón, Callosa y la coloración de la cromatina. Aunque estos procedimientos pueden necesitar más mejoras y adaptaciones cuando se utiliza con otras especies, esperamos se fijaron la etapa para la investigación adicional sobre estos métodos simples pero fundamentales que son el punto de partida de muchos proyectos de investigación.

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Protocolo

1. flor y fijación de silicua

  1. Flores de la cosecha y silicuas de plantas sincronizan en la inauguración de la primera flor.
    Nota: Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí, plantas Inicio floración aproximadamente 21 días después del trasplante de las placas de Murashige y Skoog (MS) al suelo. Semillas estratificadas durante 3 – 4 días a 4 ° C y germinado/cultivadas en placas de MS de 22 ° C/16 h luz y 18 ° C/8 h oscurezca durante 8 a 10 días, antes de transplantar las plántulas en suelo rico en nutrientes en macetas bajo las mismas condiciones (figura 1). El número de repeticiones depende del objetivo específico de investigación, pero se recomienda un mínimo de 5 inflorescencias (a partir de 5 plantas individuales) para cada tratamiento. Si las flores son la unidad experimental, se recomienda un mínimo de 10 flores por repetición.
  2. Cortar las inflorescencias o flores (Figura 1E-H) con unas tijeras pequeñas (por ejemplo, tijeras) y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (para fijación de flor inflorescencia única) o en un tubo cónico (para fijaciones colectivas) que contiene recién hecho de Carnoy metanol/ácido acético y fijadores FPA50 (dependiendo de la aplicación, vea abajo) en el hielo.
    Nota: Las muestras deben estar completamente sumergidas en el fijador.
  3. Dejar el tejido en el fijador durante 4 horas hasta toda la noche a 4 ° C.
    Nota: Infiltración de vacío puede utilizarse para acelerar la penetración del fijador en el tejido, pero esto puede ser perjudicial a la preservación de la estructura del tejido. Los autores no implementan infiltración vacío.
  4. Retirar el fijador, agregar suficiente etanol 70% para cubrir las muestras y volver a 4 ° C durante al menos 24 h; las muestras pueden permanecer indefinidamente en esta solución. Después de extraer el etanol, proceder de inmediato al siguiente paso; disección, o claro de SDS.

2. disección bajo el estereomicroscopio

  1. Puesto recién hecho etanol al 70% en vidrio de relojero a una placa Petri pequeña de apoyo.
  2. La inflorescencia, flor/silicua en este recién hechas fijador y disecar bajo el estereomicroscopio con fórceps y una jeringa con una aguja.
    1. Use vidrio o dispositivo similar que permite que las muestras de estar totalmente cubierto con etanol (recomendado) para la disección de las inflorescencias y desgarrando órganos florales de las flores maduras (sépalos, pétalos y estambres puede ser diseccionado en esta etapa un relojero ) para evitar el riesgo de secar muestras.
  3. Diseccionar silicuas y pequeños capullos en una diapositiva como se describe a continuación.
    1. Dejar a un lado vidrio de relojero con muestras previamente procesadas y utilice una diapositiva normal para la disección final.
    2. La muestra de interés hacia la diapositiva y agregar 10 μl de etanol al 70% fresco. Trabajar con rapidez en la disección final y añadir 10 μl de etanol, si es necesario, para mantener la muestra húmeda sin el líquido excesivo.
    3. Para soltar los granos de polen de los estambres, consulte el paso 5.1. Para la disección de los carpelos y los óvulos, siga el procedimiento descrito en la figura 2. Este procedimiento se aplica a todas las etapas de desarrollo del carpelo, incluyendo la etapa de desarrollo de silicuas verdes.
      Nota: No agregue etanol si hay suficiente remanente de etanol de mover las muestras; disección de muestras muy pequeñas es mucho más fácil en una cantidad mínima de líquido. Mantenga sólo los órganos de interés (sépalos, pétalos, estambres, carpelos, óvulos, semillas o granos de polen) en la diapositiva. Este procedimiento asegurará un espesor uniforme entre el portaobjetos y cubreobjetos, correspondiente al espesor del órgano objeto de examen, resultando en una mayor homogeneidad y así eficacia para exámenes microscópicos (mayor número de ejemplares de blanco en el mismo plano focal).
  4. Use un pequeño trozo de papel secante para absorber y eliminar tanto etanol como sea posible. Proceder rápidamente al siguiente paso (sección 3, 4 o 6) antes de la muestra se seca a cabo.

3. a base de hidrato de cloral claro y tinción combinada de claro

Nota: Se obtienen mejores resultados de limpieza base de hidrato de cloral con FPA50 fijada material.

  1. Lugar 20 μl de solución de limpieza (hidrato de cloral/glicerol, modificado medio de Hoyer, 4½ de Herr o soluciones de IKI-4½ de Herr) en la diapositiva del rodamiento de la muestra. Con un par de jeringas con agujas hypodermal, coloque los especímenes reduciendo el espacio entre ellos, y los bancos donde el órgano de interés se enfrenta hacia abajo. Eliminar cualquier burbuja de aire restante usando la aguja.
  2. Bajar lateralmente un cubreobjetos y colocarlo, presionando muy suavemente suavemente y espere hasta que la solución claro llena el espacio entre. Añadir solución de compensación mínima, si es necesario, para llenar todo el espacio bajo el cubreobjetos.
  3. Coloque el portaobjetos sobre un soporte deslizante y dejarlo bajo la campana. Proceder a observaciones microscópicas después de al menos 4 h y durante los siguientes días 4 – 5.

4. combinado Alexander tinción y claro 4½ de Herr de anteras

Nota: El protocolo original de Alexander se basa en la liberación de los granos de polen en la diapositiva antes de la tinción. Un eficiente y más informativo, modificado Alexander coloración y procedimiento de despejo son la tinción de granos de polen maduros dentro de las anteras maduras pero no dehiscente.

  1. Elegir capullos recién cosechados que se van a abrir con anteras no dehiscente.
    Nota: No tome más jóvenes capullos porque Alexander manchas está diseñado para los granos de polen maduros y no mancha eficientemente los granos de polen inmaduros. Se recomienda un mínimo de 5 flores por tratamiento de inflorescencias y diversas plantas.
  2. Preparar una placa de 96 pocillos con solución de suficiente Alexander sumergir un brote de flor. Exponer las anteras quitando los sépalos y pétalos y sumergirlos en solución de Alexander. Mantener las muestras bajo la campana para 1-3 h.
  3. Reemplazar la solución de Alejandro con la solución 4½ de Herr y coloque la placa multi-bien debajo de la campana para una incubación durante la noche.
  4. Con unas pinzas, mueva suavemente los botones florales despejados hacia una nueva diapositiva. Puesto que puede ocurrir algún remanente de la solución de Alejandro, utilice un papel secante para quitar tanta solución claro como sea posible.
  5. Diseccionar los estambres y quitar todos los otros tejidos. Siga los pasos en la sección 3 con solución 4½ de Herr.

5. eliminación de la exina de los granos de polen

Nota: Recomendamos usar fijador de Carnoy para tinción DAPI.

  1. Siga los procedimientos de disección y fijación que se describe en las secciones 1 y 2. Por ahora, uno debe tener de uno a muchos estambres en la diapositiva dentro de una mínima cantidad de etanol al 70%.
  2. Utilice un papel secante para quitar exceso etanol y añadir 5-10 μl de la solución DAPI. Utilizando un par de jeringas con agujas, liberar los granos de polen dentro de esa pequeña cantidad de solución (por ejemplo, uso una jeringa para inmovilizar el estambre y el otro para liberar los granos de polen). Si la solución se seca, agregue otro 5 μl de DAPI.
  3. Quitar toda la suciedad del estambre es un paso crítico, que sólo los granos de polen quedan entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
  4. Coloque un cubreobjetos sobre la diapositiva del rodamiento de la muestra bajando hacia los lados y añadir la mínima cantidad de solución DAPI que llenan el espacio. Coloque el dedo índice sobre el cubreobjetos, y sin aplastamiento muy mucho hacer un rápido y firme y corto movimiento de deslizamiento.
    Nota: Para medir la fuerza necesaria y la amplitud del movimiento deslizante, este paso debe realizarse varias veces, comprobar los resultados cada vez que bajo el microscopio.
  5. Agregar solución DAPI si es necesario y mejorar el portaobjetos en una caja húmeda en la oscuridad a 4 ° C por 15 min a 1 h. proceder a observar las muestras con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h. tratar de combinar este procedimiento con el SDS claro para comprobar si otro lugar momentos pueden obtenerse.

6. sodio dodecil sulfato (SDS) de claro

Nota: Según el órgano floral a analizar y habilidades del investigador para disecar los especímenes muy suaves y pequeño, el tratamiento de SDS puede realizarse ya sea antes (para investigadores experimentados) o después de la disección paso (por menos los investigadores) en ácido acético en metanol fijada material.

  1. Usar vidrio de relojero, un portaobjetos cóncavo o un tubo de microcentrífuga para incubar muestras disecadas o no disecado en 0.2 N NaOH solución durante la noche a temperatura ambiente y 1% SDS.
  2. Manejar con cuidado porque la muestra es muy suave y tiene un aspecto transparente. Enjuague varias veces con agua.
    Nota: Remanente de la solución de SDS podrían conducir a la precipitación al añadir la solución de tinción, por ejemplo, azul de anilina.
  3. Para muestras no disecados, siga el procedimiento de disección que se describe en la sección 2, utilizar agua en lugar de etanol al 70%. Después de disecar el tejido deseado, retire cualquier restos y residuos y cualquier exceso de agua con un papel secante, luego añadir 20-40 μl de solución de tinción y continúe con el paso 6.5.
  4. Para las muestras disecadas, cuidadosamente mover la muestra de la solución de lavado y colóquela en un portaobjetos limpio y añadir 20-40 μl de solución de tinción.
  5. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos bajando hacia los lados. Tenga cuidado de no para aplastar la preparación. Si el tejido es muy suave, lugar cualquiera delgada separador entre el portaobjetos y el cubreobjetos en sus esquinas(por ejemplo, cinta o un cubreobjetos roto), dejando un espacio de cámara como entre portaobjetos y cubreobjetos, tal que el cubreobjetos no triturar a la muestra.
  6. Coloque todas las diapositivas dentro de una caja húmeda, cubrir con papel de aluminio y coloque en 4 ° C durante por lo menos 1 h. proceder a observar a la muestra con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h.

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Resultados

Arabidopsis pertenece a la familia Brassicacea, teniendo las inflorescencias con flores bisexuales dispuestas en un corimbo (figura 1). Cada flor tiene 4 sépalos, cuatro pétalos, seis estambres (cuatro largos y dos cortos) y un Gineceo sincárpico de dos congénitamente carpelos (Figura 1F-H) dispuestos en cuatro verticilos concéntricos25,26. A...

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Discusión

La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se si...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zurich, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 a A.H.), una beca avanzada del Consejo Europeo de investigación (no de la concesión. Medea-250358 a U.G.) y un proyecto de investigación y desarrollo tecnológico (grant MecanX a U.G.) de SystemsX.ch, la iniciativa Suiza en biología de sistemas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos y materiales
EtanolScharlauET00102500
Ácido AcéticoApplichemA3686,2500100% Grado de biología molecular
Ácido acético glacialSigma-Aldrich 320099Grado de biología molecular
MetanolScharlauME03062500
Solución de formaldehídoSigma-AldrichF1635
Ácido propiónicoSigma-Aldrich81910-250 ml
Hidrato de cloralSigma-Aldrich15307
GlicerolRoth3783.1
Goma arábigaFluka51198
Ácido lácticoFluka69773
FenolSigma-Aldrich77607-250MLUtilizamos fenol líquido (use la densidad para encontrar el volumen requerido para su solución)
Aceite de clavoSigma-AldrichC8392-100ML
XilenoRoth4436.1
YodoFluka57665
Yoduro de potasioMerck5043
MalaquitaVerde Fluka63160
Ácido fucsinaFluka84600
Naranja GSigma7252
Dodecil Sulfato de SodioSigma-AldrichL3771Grado de Biología Molecular
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich71690
Di-Hidrógeno Fosfato de SodioApplichemA1047,1000
Fosfato de Sodio DibásicoSigma-AldrichS9763-1KG
Fosfato de potasioSigma-Aldrich04347
EDTAApplichemA2937,1000
CalcofluorSigmaF6259Abrillantador fluorescente 28
AuramineChroma10120
DAPISigmaD9542tóxico
Triton-X-100SigmaT8787
Azul anilinaMerck1275
MS mediumCarolina19-57030
Sustrato rico en nutrientesEinheitserdeED73
VidrioSin marca específica
Tubos de centrífuga falcon de 15 ml VWR62406-200
Pinzas DumondActimed0208-5SPSF-PS
PinzaDUMONT BIOLOGY0108-5
JeringaBDBD Plastipak 3000131 ml
Aguja de preparaciónBDBD Microlance 304000
Portaobjetos de microscopioThermo Scientific10143562CEcortados
CubreobjetosThermo ScientificDV40008
CajaUna caja de plástico con toalla de papel húmeda y soportes deslizantes en el interior
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Solutions>
Fijadores
de Carnoy (Farmer)Etanol absoluto : ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml)
Metanol/ácido50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) ácido acético glacial en agua desionizada
FijadorFormalina, ácido propiónico, etanol al 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Soluciones de aclarado
Hidrato de cloral/glicerolHidrato de cloral : glicerol : agua, 8:1:2 (g:ml:ml). Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es la goma arábiga a base de formalina FPA50
Modified Hoyer7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, agua 30 ml. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es el fluido
Herr's 4½ácido láctico, hidrato de cloral, cristales de fenol, aceite de clavo, xileno; 2:2:2:2:1, en peso. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores (especialmente para el desarrollo de los estambres) y para el desarrollo de la silícula con microscopía DIC. El mejor fijador es la
SDS/NaOH: Mezclar-diluir la SDS y la solución madre de NaOH a 1% SDS / 0,2 N NaOH (dilución 10x). Para todas las etapas de desarrollo de la flor y la silicona. El mejor fijador es el fijador de ácido metano/acético; También se pueden utilizar los otros dos fijadores. Se puede combinar con calcofluor, auramina, DAPI y solución de tinción con azul de anilina.
madre SDS10 % (p/v) de dodecil sulfato de sodio. Disuelva 10 g de dodecil sulfato de sodio en 80 ml de agua desionizada y haga hasta 100 ml con agua desionizada.
madre de NaOH2 N Solución de NaOH: disolver 4 g de NaOH en 40 ml de agua desionizada y enrasar hasta 100 ml con agua desionizada
Soluciones combinadas de limpieza y tinción
Herr's IKI-4½A un estándar 4½ (9 g en total) añadir: 100 mg de yodo, 500 mg de yoduro de potasio. Esta solución de limpieza se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de la silicona, ya sea para aumentar el contraste o para caracterizar la dinámica del almidón. Utilice FPA50 para el análisis estructural y el fijador de Carnoy para el análisis cuantitativo del almidón.
Etanol de tinción95% 10 ml, verde de malaquita (1 % en EtOH al 95 %) 1 ml, ácido fucsina (1 % en ddH2O) 5 ml, naranja G (1% en ddH2O) 0,5 ml, fenol 5 g, hidrato de cloral 5 g, ácido acético glacial 2 ml, glicerol 25 ml . Este aclarado/tinción solo o en combinación con el 4½ de Herr; La solución se puede utilizar para evaluar el aborto del polen en flores con granos de polen maduros y tricelulares. Se utiliza en material no fijo recién cortado.
tinción fuertes
calcofluorfuerte Calcofluor 0,007% en agua (g:ml). Originalmente se utilizaba como blanqueador óptico. Se puede utilizar para teñir celulosa, polisacáridos carboxilados y calosa en las paredes celulares. Se utiliza con frecuencia para teñir la tina del grano de polen. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución.
Solución deauramina Auramina 0,01% en agua (g:ml). Este tinte fluorescente lipofílico se puede utilizar para teñir cutículas, cutina y exina, entre otros. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución
de calcofluor y auraminaSolución de auramina : Solución de calcofluor, 3:1. Se puede utilizar para una tinción combinada con ambas soluciones. Se pueden ensayar otras proporciones manteniendo una menor proporción de calcofluor con respecto a la auramina.
SoluciónDAPI DAPI 0,4 ug/ml, tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 al 0,1%, EDTA al 1 mM. Esta solución se puede utilizar para teñir las diseminaciones de los cromosomas durante la meiosis masculina y femenina, y los núcleos celulares de cualquier tejido. Se utiliza con frecuencia para estudiar el desarrollo del grano de polen. El Carnoy y el metanol/ácido acético son los mejores fijadores para esta solución. Los fijadores a base de formaldehído, como FPA50, pueden interferir con la tinción. Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 461 nm.
Tampón de fosfato de sodio (0,1 M)Receptor de protones: 0,2 M Na2HPO4, donante de protones: 0,2 M NaH2PO4, relación donante de protones / receptor de protones: 1,364 ( para un pH 7)
azul de anilina0,1% (p/v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerol. Esta solución se puede utilizar para teñir calosa y celulosa de muchas etapas de desarrollo (por ejemplo, deposición de calosa en teradas macho y hembra, tapones de calosa en tubos polínicos). Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 455. También se puede excitar a 514 nm con emisión en rojo para la tinción del contenido celular.
de relojero bordes húmeda Fijador acético FPA50 limpiador a base de formalina FPA50solución FPA50 a base de formalinaSolución Solución Alexander Mezcla Solución de

Referencias

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