Summary
여기는 선 유도의 기술에 설명합니다. 이 프로토콜도 선 차동 세포 수를 수행 하 고 표면에 뜨는 래를 수집 처리 및 추가 분석에 대 한 셀을 설명 합니다.
Abstract
선 유도 및 처리의 기술 수집 및 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 같은 다양 한 호흡기 질환에 흥미 롭 기도에서 세포의 분석을 수 있도록 인식된 비-침략 적 방법입니다. 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증입니다. 이 기술은 잘 용납 하 고, 안전 하 고 비-침략 적, 하지만 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 임상 연습에서 기술적으로 까다로운, 소모, 그리고 숙련 된 직원을 필요로 하기 때문에. 선 유도 및 분석의 성공률은 약 80%.
여기, 우리는 래 샘플의 유도 및 실험실 처리를 설명합니다. 가 래는 salbutamol와 마 또는 isotonic 식 염 수의 흡입에 의해 유발 됩니다. 처리를 위해 전체 선 기술을 사용 하 고. Dithiothreitol (DTT)는가 래 샘플의 mucolysis를 허용 하는 데 사용 됩니다. 가 래 처리의 기본 목적은 기도 루멘에 셀 유형을 공부 하 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 추가 분석은 또한 표면에 뜨는 래과가 래 세포, 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘에 대 한 조사를 더 수 수행할 수 있습니다. 예로 표면에 뜨는 래에 중재자를 공부 하 고 cytometry, genomics, proteomics 등가 래 세포에 분석의 큰 스펙트럼을 수행 있습니다.
마지막으로, 건강 한 컨트롤, 천식, COPD 환자에 선 분석의 대표적인 결과 표시 됩니다.
Introduction
여러 가지 방법을 조사 기도 염증에 사용 됩니다: 직접 측정 (예: 기관지 생 검 또는 bronchoalveolar lavages)와 간접 방법 (증상 평가, 같은 혈액 샘플 분석 및 폐 기능 검사)1. 직접 기술을 안정적으로 평가 하는 기도 염증의 이점이 있다 하지만 그들은 침략과 가능 하지에 대규모 환자 불편 때문에 고 위험 발생1. 간접적인 방법에 관해서는 그들은 제대로 기도 염증1의 직접 평가와 연관.
가 래 컬렉션 기도에서 샘플 셀에 다른 방법 이며, 기도 염증의 직접적인 평가 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 자발적으로 래를 생산 품질의 샘플을 이어질 수 있습니다 그리고 모든 환자2불가능. 가 래 생산2유도 하 초음파 nebulized 마 식 염 수를 사용 하 여이 문제를 극복 되었습니다 했다. 이 메서드와 Pneumocystis carinii 폐 렴3 의 진단을 위한 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 환자에서 처음 사용 되었다 건강 한 과목과 19924천식에 대 한 적응 했다. 가 래 유도 또한 isotonic 식 염 수5를 사용 하 여 더 심한 환자에서 가능 합니다. 비록 일반적으로 잘 용납 하 고, 염 분의 흡입 hyperresponsive 항공5환자의 bronchospasm을 발생할 수 있습니다. 따라서, 절차1전에 짧은 행동 beta 주 작동 근을 관리 하는 것이 좋습니다. 또한, 우리는 이전 것이 위험6감소 더 salbutamol 초음파 분무기에 소금물을 추가 보여주었다. 선 유도의 장점 그것은 비 침략 적2 5촬영 때 적절 한 안전 예방 조치 이다.
가 래 샘플 처리에 대 한 두 가지 방법에서에서 현재 사용 문학: 전체 선 기술과 플러그 선택7. 우리의 실험실에서 전체 선 기술 수행 됩니다. 선 처리의 기본 목적은 염증 기도 루멘에의 종류 공부 차동 세포 수를 얻을 것입니다. 그러나, 많은 추가 분석 추가 선 표면에 뜨는8 에서 중재자를 공부 하거나가 래 셀에 자세한 조사를 수행 하 여 염증 성 프로세스와 면역 메커니즘을 조사 수 있습니다 (예: , flow cytometry9, 셀 문화10, 유전체학10, proteomics10, immunocytochemistry7, 제자리 교 잡7, 등)
선 유도 및 분석의 기법 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 훈련된 직원1필요 서비스 및 임상 연습에서 전문화 된 센터를 현재 제한 됩니다. 기도 염증과 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 만성 기침, 또는 특 발성 폐 섬유 증11같은 다양 한 호흡기 질환에 대 한이 방법으로 조사 될 수 있습니다.
Protocol
이 섹션에 설명 된 모든 방법을 리 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되 고 모든 건강 한 과목 참여에 대 한 서 면된 동의 주었다.
1. 선 유도
- 사전 및 사후 bronchodilator spirometry
- spirometry 수행 (강제로 내쉬는 숨의 볼륨 1 초 [FEV1] 및 강제 중요 한 용량 [FVC] 책략) 미국 흉부 학회 (ATS)에 따르면 / 유럽 호흡기 학회 (ERS) 표준 기준12.
- 스페이서 장치를 통해 흡입된 salbutamol의 400 µ g metered 복용량 흡입기 (MDI)에서 관리 합니다.
참고: 성인에서 salbutamol 흡입된의 부작용 떨림 및 심 박 급진13포함. - 반복 spirometry (FEV1 과 FVC 책략) 15 분 후,12의 ATS/ERS 표준 기준 따라 합니다.
- 초음파 분무기의 준비
참고:는 분무기 해야 합니다 철저 하 게 청소 되며, 제조업체의 지침에 따라 각 사용 하기 전에 소독.- 권장된 수준까지 증류수로 분무기 챔버를 채우십시오.
- 분무기 챔버에 깨끗 한 컵을 넣습니다.
- 적절 한 뚜껑 컵 커버.
- 후 bronchodilator FEV1 환자에 대 한 고 식 염 수 (5%)의 중 50 mL 컵 채우기 > 65% 예측 또는 예측 후 bronchodilator FEV1≤65 %는 환자에 대 한 isotonic 식 염 수 (0.9%)의 50 mL.
- Salbutamol 황산 솔루션 (5 mg/mL)의 1.75 mL 컵을 추가 합니다.
- 튜브와 밸브 제조업체의 지침에 따라 연결 합니다.
- Nebulization 및가 래 컬렉션
참고: 의료 감독 기법을 수행 합니다.- 환자에 게 절차를 설명 합니다.
- 코 클립을 사용 하 여 환자를 부탁 드립니다.
- 는 분무기를 돌려 고 졸 및 팬 설정의 최저 수준을 선택 합니다.
- 5 분 간만 호흡과 입 조각을 통해에 어로 졸을 흡입 환자를 부탁 드립니다.
참고:에 어로 졸 및 팬 설정 환자의 허용 오차에 따라 증가 수 있습니다.- 참을 수 없는 기침 또는 구역 질, 절차를 중단 하 고 1.3.5 단계로 이동 합니다.
- 가슴 답 답, 호흡 불편 경우 1.3.8 단계로 이동 합니다.
- 분무기를 해제 합니다.
- 코 클립을 제거, 그의 입을 물으로 헹 구 고 싱크대에 그것을 삭제 하기 전에 두 번 양치질을 환자를 부탁 드립니다.
참고: 타 액 셀이 래 샘플을 오염 하 고 사용할 샘플 이어질 수 있습니다. - 플라스틱 용기에가 래를 기침 환자를 부탁 드립니다.
- FEV1측정 spirometry (강제로 내쉬는 숨 작전)을 수행 합니다.
- FEV1 가 다음과 같이 평가: (FEV1 단계 3.8 [mL]에서 측정)-(후 bronchodilator FEV1 단계 1.3 [mL]에서 측정) / (후 bronchodilator FEV1 측정 단계 1.3 [mL]) * 100.
- FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지면, 절차를 중단 합니다. FEV1 다시 10 분 후 측정 합니다. 만약 FEV1 nebulized ipratropium 브 로마 이드 (0.25 mg/2 mL)를 관리 하 고 유지 의료 관찰 아래 환자를 의사에 게 20% 이상 떨어진다. 1.3.10 단계로 이동 합니다.
- FEV1 사후 bronchodilator 값에서 20% 이상 떨어지지 않는다, 반복 단계 3.2 3.9 1 ~ 3 배 10 ~ 20 분의 총 nebulization 시간에 도달.
참고: 총 nebulization 시간 품질 (플러그 또는 점성 부품의 존재)와 래 샘플의 수량에 따라 달라 집니다. 경우 샘플 품질 또는 수량 가난한 nebulization의 10 분 후, 15 ~ 20 분의 총 nebulization 시간 도달 하 절차를 확장 합니다.
- 가 래 샘플을 처리까지 냉장 하십시오.
2.가 래 처리
참고: 최적의 세포 생존 능력에 대 한 샘플링의 3 시간 안에가 래를 처리 합니다.
주의: 연구실 코트, 보호 장갑 및 고글을 착용.
- 사전 준비
- 제조업체의 지침에 따라 6.5 m m 솔루션의 10 mL를 무 균 증류수와 집중된 dithiothreitol 솔루션 (mucolytic 에이전트)의 10 희석을 확인 합니다.
참고: 방지 하기 위해 주변 공기를 혼합 하는 집중된 dithiothreitol 솔루션, 솔루션에서에서 철수 유리병 멸 균 주사기와 바늘. 일단, 집중된 솔루션 유리병은 실 온에서 보관 고 5 일 이내에 사용 해야 합니다. 희석된의 솔루션은 매일 준비 하 고 있다.
주의: 눈과 피부 자극 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용. - Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 5 희석와 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 0.08% 솔루션을 확인 합니다. 실 온에서이 희석된 솔루션을 유지 하 고 2 주 이내 사용.
주의: 발암 위험 때문에 보호 장비 (의류, 장갑, 고글) 착용.
- 제조업체의 지침에 따라 6.5 m m 솔루션의 10 mL를 무 균 증류수와 집중된 dithiothreitol 솔루션 (mucolytic 에이전트)의 10 희석을 확인 합니다.
- 가 래 상쾌한의 컬렉션
- 50 mL 원뿔 하단 플라스틱 튜브에 전체 선 전송 및 샘플 무게.
- DPBS 솔루션의 3 무게를 추가 합니다.
- 천천히 소용돌이 샘플 30 s.
- 원심 분리기 800 x g와 4 ° C 10 분.
- 멸 균 거 즈의 2 단일 레이어를 통해 샘플을 필터링 하 고 상쾌한 50 mL 원뿔 바닥에 플라스틱 튜브에서를 수집.
- Aliquot 2 mL 플라스틱에서 상쾌한 튜브 및-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
참고: 표면에 뜨는 샘플은가 래 액체 단계 구성 요소 시험에 유용.
- 가 래 Mucolysis
- 필요한 경우, 세포 현 탁 액 5 ml의 총 볼륨에 연결할 셀 펠 릿을 DPBS를 추가 합니다.
- 6.5 m m dithiothreitol의 1 볼륨 세포 현 탁 액을 희석. 벤치 로커를 사용 하 여 실 온에서 20 분 동안 세포 현 탁 액을 바위.
- DPBS와 3 번 이상 반복 합니다.
- G와 10 분 동안 4 ° C x 550에 희석된 세포 현 탁 액 원심
- 평가 하 고 셀 서 스 펜 션의 정확한 볼륨을 기록.
- 0.08 %trypan 블루 솔루션의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 균질.
- Hemocytometer (Thoma 챔버)의 coverslip 아래 샘플을 넣어 하 고 광학 현미경 (400 X) 두십시오.
- 계산 편평 세포, 생활 비 편평 상피 세포 (질된 세포), 그리고 죽은 비 편평 상피 세포 (블루 색 셀).
참고: 너무 낮게 또는 너무 높은 세포 밀도 경우 집중 또는 세포 현 탁 액을 희석 하 고 반복 단계 2.4.1-2.4.3. - 정지, 편평 세포의 비율 및 비 편평 세포의 생존 능력의 비율의 세포 농도 평가 합니다.
참고: 계산가 래의 총 비 편평 세포 수/g: 세포 현 탁 액 (단계 5.4)의 농도 * 볼륨 세포 현 탁 액 (단계 4.8)의 * 비 편평 세포의 % 무게 /가 래 샘플 (2.2.1 단계)의.
참고: 세포 현 탁 액 포함 80% 이상이 편평 세포, 샘플 간주 됩니다 가난한 품질과 cytospin 슬라이드14를 위해 부적 한. 이 경우, 처리를 중단 하 고이 샘플 실패 고려.
- 500, 000 셀/mL에 세포 현 탁 액의 적어도 350 µ L를 DPBS와 세포 현 탁 액의 약 수를 희석.
- 조립 셀 집중 장치 제조업체의 지침에 따라.
- 이 세포 현 탁 액의 100 µ L 셀 집중의 3 구획의 각각을 채우십시오.
- Cytocentrifuge에서 150 x g 및 실 온에서 2 분 동안 회전. supernatants 삭제 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 셀 집중 분해.
- 건조 공기를 허용 합니다.
참고:이 단계에서 잔여 세포 저장할 수 있습니다 적절 한 버퍼에 추가 실험을 위해 필요한 경우. - 얼룩 상업 얼룩과 슬라이드 키트 ( 테이블의 자료를 참조), 제조업체의 지침에 따라.
- 적합 한 장착 매체와 커버 슬립 슬라이드를 탑재 합니다.
- 기름 침수와 광학 현미경 (600 X) 슬라이드를 놓습니다.
- 적어도 500 편평 비 셀: 호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포.
참고: 차동 세포 수는 일반적으로 단 하나에 의해 수행 또는 2 전용 interobserver 불일치를 제한 하는 관찰자 훈련. - 레코드의 절대 값 및 각 셀의 비율을 입력합니다.
Representative Results
Hemocytometer
일반적인 이미지는 hemocytometer를 사용 하 여 현미경으로 시각화는 그림 1 에 표시 됩니다. 편평 세포는 쉽게 식별 합니다, 그들은 비 편평 세포 보다 훨씬 더 큰. 이 편평 상피 세포는 상피 세포는 입에서 나오는. 두 종류의 세포는 Trypan 블루 때 죽은 물 들 다. 주의 효 모, 박테리아 및 스크랩 방지로 이동 해야 합니다.
그림 1 : 죽은 비 편평 상피 세포, 그리고 (C)는 편평 상피 세포 (A) 생계 비 편평 상피 세포, (B)를 보여주는 Hemocytometer 그림. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Cytospin 슬라이드: 그림 2 는 선 처리 후 얻은 cytospin 슬라이드의 대표 이미지. 다른 세포 유형 (호 중구, 호 산 구는, 대 식 세포, 림프 톨, 그리고 상피 세포) 그들의 형태학 및 채색에 의해 분화 될 수 있다. 경우에 따라 편평 상피 세포에 의해 오염 중요 한 있을 수 있습니다 그리고, 편평 세포의 비율 80% 보다 큰 경우, 샘플 실패 (그림 3) 것으로 간주 됩니다.
그림 2 : Cytospin 슬라이드 그림 표시 (A) neutrophil, (B)는 대 식 세포, (C)는 eosinophil (D)는 림프 구 및 (E)는 상피 세포. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 와 품질 cytospin 슬라이드의 예 > 편평 세포의 80%. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
성공률
우리 부서에서 (성공적인 유도 및 읽을 수 있는 cytospin 결합) 절차의 1,129 환자 (건강 한 과목 이나 천식, COPD 환자)의 샘플에 따라, 82% (924/1,129). 환자의 유형에 따라 하위 분석에서 성공률 이며 건강 한 과목에서 75% (57/76), 82% (827/1,004) 천식, COPD 환자의 82% (40/49).
건강 한 과목에 결과
우리 부서, 중앙값 (interquartile 범위)에서 289 건강 한 과목의 일련의 회 고 분석에 선 무게 3.72 g (2.46 g-5.54 g의 interquartile 범위) 이었고,가 래의 메디아 총 비 편평 세포 수/g x 106 (0.59 0.37 x 10의 interquartile 범위6 -1.29 x 106).
그 건강 한 주제에서 편평 세포의 비율이 19% (10%-34%)에 낮은 이며 생존은 66% (54-78%)에서 높은. 다른 세포 유형의 비율에 대 한 결과 그림 4A에서 요약 된다. 우리는 대 식 세포 (49% [31-68%])의 백분율은 동안 세포 (2% [1-3%])의 비율 (34% [14%-60%]), 호 중구의 비율 보다 높은, 호 산 구는 (0% 0%-0%)과 상피 세포 (4% [2-11%])는 낮은 볼 수 있습니다. 이러한 결과 비슷한 데이터 절대 값 (그림 4B)에서 표시 됩니다 때.
그림 4 : 건강 한 과목에서 차동 세포 수의 대표적인 결과 절대 값 (A) 백분율 또는 (B)로 표현 합니다. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그것은 또한 환자의 나이 고려 하는 것이 중요입니다. 실제로, 강한 상관 관계는가 래 샘플 (그림 5)에 환자의 나이 및 호 중구의 비율 사이 존재. 마찬가지로, 10 년 나이 그룹 (그림 6)에 따라 환자를 분류 하는 경우 연령 증가 함께 호 중구 백분율에 상당한 증가 관찰 합니다. 따라서, 다른 동료에서 결과 비교할 때이 변수를 고려 한다 그리고 과목의 일치에 주의 이동 해야 합니다.
그림 5: 나이 및가 래 호 중구 백분율 사이 상관 관계 상관 관계 계산 Spearman 테스트와 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 나이 카테고리에 따라 호 중구 백분율의 진화. ANOVA의 p-값이 < 0.0001 호 중구 백분율 나이 클래스 간의 비교에 대 한. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p < 0.05, * * p < 0.01, 그리고 * * * p < 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 있는 결과
유도 된가 래의 기술 주로 천식 환자에서 염증 성 셀 프로 파일을 평가 하기 위해 사용 됩니다.이 기술은 또한 COPD, 다른 염증 성 호흡기 질환으로 고통 받아 환자에 적용할 수 있습니다. 비교할 때 건강 한 과목, 천식, COPD 환자 (나이, 성별, 그리고 담배 습관에 대 한 일치 되는 3 그룹), 염증 성 셀 프로 파일은이 동료 (그림 7) 사이 아주 다른 관찰 합니다. 실제로, 천식 환자는 보통 특징 제기 래 호 산 구는가 래 호 중구의 비율은 COPD 환자의 건강 한 컨트롤에 비해 일반적으로 더 높은 질병 심각도에 연결 되는.
그림 7 : 건강 한 과목의가 래 염증 셀 프로 파일 (n = 45), 천식 환자 (n = 108), 및 COPD 환자 (n = 54). 3 그룹은 성별, 나이, 및 담배 습관에 대 한 일치 했다. ANOVA의 p-값 < 0.05, < 0.0001, 및 < 0.0001 호 중구, 호 산 구는, 및 세포 그룹 간의 비교에 대 한 각각. 여러 비교 던의 여러 비교 테스트 했다. P-값은 다음과 같이 표시 됩니다: * p < 0.05와 * * * p < 0.001. 결과 중간 (interquartile 범위)로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
유도 선 방법은 기도 구획을 공부 하는 유용한 도구입니다. 이 기술의 몇 가지 가능한 응용 프로그램을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 그것은 면역 세포와 다양 한 호흡기 질환에 관련 된 메커니즘에 대 한 지식을 높일 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 환자의 큰 동료에서 기도 염증의 조사를 허용 했다 그리고 천식 환자의 절반 정도는 비정상적인 기도 감염은 염증15, 특징은 보여왔다 16 , 17, COPD 환자는 일반적으로 올려진된 선 neutrophil 전시 하는 동안18세. 이 기술은 특 발성 폐 섬유 증 환자에서 기도 염증의 더 나은 특성 및 증거 중재자가 병19에 기여할 수에 기여 했다. 둘째, 유도 된가 래의 기술 치료 반응 예측을 유용할 수 있습니다. 예를 들어가 래 호 산 구는의 비정상적인 비율의 존재 코르 티 코 스테로이드 반응성11,18의 예측 마커 되도록 표시 되었습니다. 천식 및 COPD가 래 호 산 구는의 비율을 정상화 코르 티 코 스테로이드의 복용량을 조정 표시 했다11 현재 임상 지침에 따라 치료 조정 보다 exacerbations의 수를 감소에 더 효과적 ,,2021. 셋째, 선 분석 표적으로 한 치료를 개발 하는 데 도움이 있습니다. 예를 들어가 래 COPD와 일부 천식 환자에서 호 중구의 비정상적인 수의 존재 antineutrophilic 치료11의 개발을 주도하 고 있다. 넷째, 기술 진단에 한 역할을 재생할 수 있습니다. 예를 들어가 래 eosinophilia의 존재 비 천식 감염은 기관지염11의 진단을 만들 필요가 있다.
차동 셀 개수 구하기, 외 선 유도의 기술 또한 표면에 뜨는 래 또는 래 세포를 공부 하 여 많은 추가 분석의 성능 수 있습니다. 표면에 뜨는 래와 예로 중재자8,,1922 의 분석 및 호 산 구는22에 대 한 샘플의 혈 활동의 평가 있습니다. 가 래 세포에서 RNA를 추출 수 및 예측에 관한 사용 또는 유전자 발현 분석19,23 . 가 래 셀 흐름 cytometry9,23 사람들과 immunophenotyping 및 셀 정렬 허용 하 여 분석할 수 있습니다. 또한,가 래 세포 배양된10, 수 그리고 그들의 중재자 생산 측정 된 생체 외에서24를 수 있습니다. 이 경우에 지적 가치가 있다, 중재자 콘텐츠는 무엇에서 찾을 수 있습니다 선 표면에 뜨는 다릅니다. 실제로, 표면에 뜨는 래에 중재자 기도 주민 세포에서 분 비 물에 의해 및 플라즈마 나옴가 래 세포 문화 모델24반대에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 마지막으로, immunocytochemistry와 제자리에서 교 잡도 수행할 수 있습니다가 래 세포7를 사용 하 여.
유도 선 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 감 응 작용은 의료 감독 하에 수행 되어야 합니다. 또한 환자에 게 철저 한 지침 연산자에 대 한 필수적 이다. 호흡 노력 필요에 따라 다른 한계는 협력 및 환자의 건강 상태를 포함 합니다. 아이 들에 있는이 기술의 타당성에 관한 여러 연구 결과 그것이 성공적이 고 6 세25이상의 어린이 안전 보고 있다. 자식에는 데이터 < 나이의 6 년25, 부족 하지만 선 유도 그 아이 들14에서 수행 하기 어려운. 기술은 현재 연구 서비스 및 전문된 센터 때문에 기술적으로 까다로운, 시간이 걸리는, 그것은 훈련된 한 직원1필요 제한 됩니다. 또 다른 한계 선 유도 및 분석의 기술 항상 성공, 읽을 수 있는 cytospin는 항상26을 취득 하지 의미 하지는 않다는 것입니다. 그러나, 성공률은 일반적으로 80% 환자4,26,27,,2829의 다른 동료에 약. 마지막으로, 환자의 래 셀 수30,31영향을 같이 했다 나이 일치에 관한 다른 동료를 비교할 때 주의 촬영 해야 합니다. 마찬가지로, 성별 및 담배 습관 같은 다른 매개 변수 또한가 래 셀 수29,32방해할 수로 일치 해야 합니다. 환자 일치 하는 것은 불가능 하다, 나이, 성별, 흡연 상태 고려해 야 하는 또 다른 방법은 이러한 특성에 대 한 통계 분석을 조정입니다.
생체 검사와 bronchoalveolar lavages, 같은 항공에서 세포를 수집을 허용 하는 다른 기술에 비해 유도 선 방법 간단한, 잘 용납, 안전, 재현성, 비용, 및 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 이러한 장점을 수행 할 큰 규모에서 반복적으로 시간이 지남에, 유도 선 기술을 허용 하 고 기도 샘플링에 대 한 선택의 대안. Bronchosorption 기도 중재자33평가 점 막 내벽 액체의 수집을 허용 하는 다른 기술입니다. 이 기술은 (필요한 상계) 유도 래 보다 더 많은 침략 하는 동안 타 액과 어떤 오염 든 지 고 bronchoalveolar 게33보다 중재자의 높은 농도 얻기의 이점이 있다.
중요 한 단계는 프로토콜에 주의가 필요합니다. 첫째, 주의 이러한 두 개의 매개 변수는 결과 영향을 미칠 수 있기 때문에 그러므로 표준화 된34,35를 해야 염 분 농도 유도 시간에 관한 촬영 해야 합니다. 둘째, DTT와 mucolysis는 처리의 중요 한 단계 이다. PBS, 비교 DTT가 래 셀7, cytopsin 슬라이드 품질을 향상 하 고 재현할 수 셀 카운트2필수적입니다 더 나은 분산 표시 했다. 그러나, mucolytic 에이전트는 생 화 확 적인 부품의 측정을 방해할 수 있습니다.급상승 실험 다음 수행 되어야 한다 새로운 생 화 확 적인 화합물36를 측정 하는 경우. 마지막으로, 프로시저의 또 다른 중요 한 단계는 안정적이 고 해석할 결과 숙련 된 기술자에 의해 수행 해야 단계를 계산 하는 셀입니다.
전체 선 대신가 래 플러그 (점성 또는 밀도 부품)를 사용 하 여 다른 방법 또한 문학7에 설명 되어 있습니다. 두 방식 모두 장단점이 있다. 전체 선 기술은 더 빠른7, 처리 수 수 하지만 자주 타 액 샘플을 dilutes cytospins2,7의 품질을 줄일 수 있으며 오염 된. 플러그 선택 기법으로 타 액 오염 감소, 즉 그 샘플 들은 액체 단계 중재자의 복용량에 대 한 고 cytospin 슬라이드7에 대 한 더 나은 품질의. 그러나 처리는 더 이상7 하 고 선택한 플러그 전체 샘플37의 대표 되지 않을 수 있습니다. 그것은 또한 모든 샘플 제한 될 수 있습니다 플러그 포함 지적 가치입니다. 두 방법 모두는 검증 되 고 재현, 그리고 현재는 이러한 두 방법에서 얻은 차동 셀 카운트는 다른14,38증거.
미래에, 유도 선 조사, 진단, 및 염증 성 호흡기 질환의 모든 종류의 관리에 대 한 바이오 마커를 제공 하기 위해 임상 도구로 사용 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 대학 병원의 리 (추 리)에 의해 지원 되었다. 우리는 비디오 제작에 대 한 "순간 프로덕션" 인정합니다. 우리는 또한 세 드 릭 프랑수아, 영화에 등장 하는 환자를 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spirometer - Spirobank | MIR France | ||
| Salbutamol MDI - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
| Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
| Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
| DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
| Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
| Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
| NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
| Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
| Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
| Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
| Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
| Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
| Hemocytometer - Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
| Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
| Mounting medium - Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
| Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |
References
- Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
- Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
- Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
- Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
- Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J.
- Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
- Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
- Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Vignola, A. M., et al.
- Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
- Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
- Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
- Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
- Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
- Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
- Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
- Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
- Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
- Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
- Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
- Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
- Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
- Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
- Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
- Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
- Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
- Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
- Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
- Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
- Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
- Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).
