Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Metodikk for Sputum induksjon og laboratoriet behandling

Published: December 17, 2017 doi: 10.3791/56612
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group, University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines), University of Liege
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi teknikken av sputum induksjon. Denne protokollen forklarer også sputum behandling å utføre en differensiell celletall og samle sputum supernatant og celler for videre analyse.

Abstract

Teknikken av sputum induksjon og behandling er en anerkjent ikke-invasiv metode slik at innsamling og analyse av celler fra luftveiene, som er interessant i ulike respiratoriske sykdommer som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose. Denne teknikken er godt tolerert, trygt og ikke-invasiv, men er foreløpig begrenset til oppslagstjenester og spesialiserte sentre i klinisk praksis fordi det er teknisk krevende, tidkrevende og krever opplært personale. Suksessrate på sputum induksjon og analyse er ca 80%.

Her beskriver vi induksjon og laboratoriet behandlingen av sputum prøver. Sputum er indusert av innånding hypertonic eller isotonic saltoppløsning med salbutamol. Behandlingen bruker vi hele sputum teknikken. Dithiothreitol (DTT) brukes til å tillate mucolysis av sputum prøver. Hovedmålet med sputum behandling er å oppnå en differensiell celletall å studere i celletyper tilstede i airway lumen. Flere analyser kan også utføres på sputum supernatant og sputum celler, som kan tillate ytterligere undersøkelse i inflammatoriske prosesser og immun mekanismer. Studere meklarar i sputum supernatant og utføre et stort spekter av analyse på sputum celler som flowcytometri, genomics eller Proteomikk eksempler.

Til slutt, representant resultatene av sputum analyse i sunn kontroller, astmatikere og COPD pasienter presenteres.

Introduction

Flere metoder brukes til å undersøke airway betennelse: direkte målinger (som bronchial biopsier eller bronchoalveolar lavages) og indirekte metoder (som symptom vurdering, blod prøve analyse og lunge-funksjon tester)1. Direkte teknikker har fordelen av pålitelig vurdere airway betennelse, men de er invasive og ikke gjennomførbart i stor skala på grunn av tålmodig ubehag og risikoen som1. Som for de indirekte metodene korrelerer de dårlig med direkte vurdering av airway betennelse1.

Sputum samling er en annen måte å prøve celler fra luftveiene og tillater direkte vurdering av airway betennelse. Likevel produsere sputum spontant kan føre til eksempler på dårlig kvalitet og er ikke mulig for alle pasienter2. Dette problemet er løst ved hjelp av ultrasonically nebulized hypertonic saltvann for å indusere sputum produksjon2. Denne metoden ble opprinnelig brukt hos pasienter infisert med humant immunsviktvirus (HIV) for diagnostisering av Pneumocystis carinii lungebetennelse3 og er tilrettelagt for friske og astmatikere i 19924. Sputum induksjon er også mulig i mer alvorlig pasienter ved hjelp av isotonic saltvann5. Selv om det er generelt godt tolerert, kan innånding saltoppløsning forårsake bronkospasme hos pasienter med hyperresponsive airways5. Det anbefales derfor å administrere en kort-fungerende beta Agonistiske før prosedyren1. Dessuten, vi har tidligere vist at å legge til salbutamol saltvann i den ultrasoniske forstøveren ytterligere redusert denne risikoen6. Fordelene med sputum induksjon er at det er ikke-invasiv2 og trygt når passende forholdsregler er tatt5.

For behandling av sputum eksempler, to metoder som brukes i litteraturen: hele sputum teknikken og plug utvalg7. I vårt laboratorium utføres hele sputum teknikken. Hovedmålet med sputum behandling er å oppnå en differensiell celletall å studere av betennelse i luftveiene lumen. Men mange flere analyser er også mulig å undersøke nærmere inflammatoriske prosesser og immun mekanismer, enten ved å studere meglere i sputum supernatant8 eller ved å utføre detaljert undersøkelse på sputum celler (f.eks , flow cytometri9celle kulturer10genomics10, Proteomikk10, immunocytochemistry7, i situ hybridisering7, etc.)

Teknikken av sputum induksjon og analyse er foreløpig begrenset til forskning tjenester og spesialiserte sentre i klinisk praksis fordi det er teknisk krevende, tidkrevende og krever opplært personale1. Airway betennelse kan undersøkes med denne metoden for ulike respiratoriske sykdommer som astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose11.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet i denne delen er godkjent av den etiske komiteen av universitetet sykehus i Liege og alle sunn fag ga skriftlig samtykke for deltakelse.

1. sputum induksjon

  1. Pre- og post bronkodilatator Spirometri
    1. Utføre en Spirometri (forsert ekspiratorisk volum i ett sekund [FEV1] og Forsert vitalkapasitet [FVC] manøver) Ifølge American Thoracic Society (ATS) / europeiske åndedretts samfunnet (ERS) standardkriteriene12.
    2. Administrere 400 µg av inhalert salbutamol fra et taksameter dose inhalator (MDI) via en avstand-enhet.
      Merk: Hos voksne er bivirkninger av inhalert salbutamol inkluderer tremor og takykardi13.
    3. Gjenta Spirometri (FEV1 og FVC manøver) 15 min senere, i henhold til ATS/ere standardkriteriene12.
  2. Utarbeidelse av ultralyd forstøveren
    Merk: Forstøveren må grundig rengjøres og desinfiseres før hver bruk, i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Fyll forstøveren kammeret med destillert vann til det anbefalte nivået.
    2. Sett en ren kopp i forstøveren kammeret.
    3. Dekk koppen med passende lokket.
    4. Fyll koppen med en 50 mL av hypertonic saltvann (5%) for en pasient med etter bronkodilatator FEV1 > 65% spådd eller 50 mL isotonic saltoppløsning (0,9%) for en pasient med etter bronkodilatator FEV1≤65% spådd.
    5. Legge til 1,75 mL salbutamol sulfat løsning (5 mg/mL) i koppen.
    6. Koble rør og ventiler i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Tåke og sputum samling
    Merk: Utføre teknikken under legetilsyn.
    1. Forklar fremgangsmåten til pasienten.
    2. Be pasienten om å bruke en neseklemmen.
    3. Aktivere forstøveren, og velg det laveste nivået av aerosol og fan.
    4. Be pasienten om å inhalerer aerosoler gjennom munnen med tidevanns puste i 5 minutter.
      Merk: Aerosol og fan kan økes avhengig av pasientens toleranse.
      1. Ved uutholdelig hoste eller kvalme kan avbryte fremgangsmåten og gå til trinn 1.3.5.
      2. Tetthet i brystet eller åndedretts ubehag, gå til trinn 1.3.8.
    5. Slå på forstøveren.
    6. Be pasienten om å fjerne neseklemmen, skyll munnen med vann og gurgle før forkaster det i vasken.
      Merk: Spytt celler kan forurense sputum prøven og føre til en ubrukelig prøve.
    7. Be pasienten om å hoste opp sputum i en plastbeholder.
    8. Utføre en Spirometri (forsert ekspiratorisk manøver) for å måle FEV1.
    9. Evaluere FEV1 fall som følger: (FEV1 målt i trinn 3.8 [mL]) - (etter bronkodilatator FEV1 målt i trinn 1.3 [mL]) / (etter bronkodilatator FEV1 målt i trinn 1.3 [mL]) * 100.
      1. Hvis FEV1 faller med 20% eller mer fra etter bronkodilatator verdien, avbryte prosedyren. Måle FEV1 igjen 10 min senere. Hvis FEV1 faller 20% eller mer, spør legen å administrere nebulized ipratropiumbromid bromide (0,25 mg/2 mL) og holde pasienten under medisinsk observasjon. Gå til trinn 1.3.10.
      2. Hvis FEV1 ikke faller med 20% eller mer fra etter bronkodilatator verdien, Gjenta trinn 3.2 til 3,9 én til tre ganger å nå en total tåke tid med 10 til 20 minutter.
        Merk: Totalt tåke tid avhenger av kvalitet (tilstedeværelsen av plugger eller tyktflytende deler) og antall sputum prøven. Hvis prøven kvalitet og/eller antall er dårlig etter 10 min av tåke, skal prosedyren utvides for å nå en total tåke tid med 15 å 20 min.
    10. Holde sputum prøven nedkjølt før behandling.

2. sputum behandling

Merk: Behandle sputum innen 3 timer etter prøvetaking for optimal celle levedyktighet.

Forsiktig: Bruk en labfrakk, vernehansker og vernebriller.

  1. Foreløpig forberedelser
    1. Gjøre en 10 ganger fortynning av konsentrert dithiothreitol løsning (mucolytic agent) med sterilt destillert vann for å få 10 mL av en 6.5 mM løsning, i henhold til produsentens instruksjoner.
      Merk: For å unngå konsentrert dithiothreitol løsningen blanding med luft, trekke løsningen fra ampullen sterile sprøyter og nål. Når åpnet, må konsentrert løsning ampullen holdes ved romtemperatur og brukes innen 5 dager. Utvannet løsningen tilberedes daglig.
      Advarsel: På grunn av øye- og hudirritasjon fare, Bruk verneutstyr (klær, hansker og beskyttelsesbriller).
    2. Gjøre en 5-fold fortynning av trypan blå løsningen (0,4%) med Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvann (DPBS) å få en 0,08% løsning. Holde denne utvannet løsningen ved romtemperatur og bruk innen 2 uker.
      Advarsel: På grunn av kreftfremkallende farer, Bruk verneutstyr (klær, hansker og beskyttelsesbriller).
  2. Samling av Sputum nedbryting
    1. Overføre hele sputum i et 50 mL konisk bunnen plastrør og veie prøven.
    2. Legge til en 3-fold vekt DPBS løsning.
    3. Sakte vortex utvalget for 30 s.
    4. Sentrifuger 800 x g og 4 ° C i 10 min.
    5. Filtrere utvalget gjennom 2 enkelt lag av sterilt gasbind og samle nedbryting i et 50 mL konisk bunnen plastrør.
    6. Aliquot nedbryting i 2 mL plast rør og lagre dem på-80 ° C.
      Merk: Supernatant prøvene er nyttig for analysen sputum flytende fase komponenter.
  3. Sputum Mucolysis
    1. Om nødvendig kan du legge DPBS til celle pellet å nå et samlet volum på cellen suspensjon av 5 mL.
    2. Fortynne celle suspensjon med 1 volum på 6.5 mM dithiothreitol. Bruk en benk rocker for å rocke celle suspensjon for 20 min ved romtemperatur.
      1. Gjenta 3 ganger med DPBS.
    3. Sentrifuge utvannet celle suspensjon på 550 x g og 4 ° C i 10 min.
Kast nedbryting.
  • Resuspend celle pellet på ca 1 mL av DPBS.
  • Vurdering av kvalitative egenskapene til sputum prøven (celle konsentrasjon, squamous celle forurensning og levedyktighet av Trypan blå utelukkelse metoden) ved hemocytometer teller
    1. Vurdere og registrere den nøyaktige mengden celle suspensjon.
    2. Legge til 50 µL av cellen suspensjon 50 µL av 0,08% trypan blå løsningen og homogenize.
    3. Sette prøven under dekkglassvæske av en hemocytometer (Thoma kammer) og plasser den under optisk mikroskopet (400 X).
    4. Telle squamous cellene, levende ikke-squamous cellene (ufargede celler), og døde ikke-squamous celler (blå farget celler).
      Merk: I tilfelle for lav eller for høy tetthet, konsentrere eller fortynne celle suspensjon Gjenta trinn 2.4.1-2.4.3
    5. Vurdere celle konsentrasjonen av suspensjon, prosentandelen av plateepitel celler og andelen levedyktigheten til ikke-squamous celler.
      Merk: Beregne totalt ikke-squamous celle teller/g av sputum: celle konsentrasjon av suspensjon (trinn 5.4) * volumet av cellen suspensjon (trinn 4.8) * % av ikke-squamous celler / vekt på sputum utvalget (trinn 2.2.1).
  • Utarbeidelse av en farget cytospin lysbilde med den cellen suspensjon og lagring av gjenværende celler, hvis nødvendig
    Merk: Hvis cellen suspensjon inneholder mer enn 80% squamous celler, prøven regnes dårlig kvalitet og uegnet for en cytospin lysbilde14. I så fall avslutte behandlingen og vurdere dette eksemplet mislykket.
    1. Fortynne en aliquot av cellen suspensjon med DPBS å få minst 350 µL av en celle suspensjon på 500.000 celler/mL.
    2. Samle celle presisjonstørking i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Fyll hver av de 3 avdelinger til celle konsentrator med 100 µL av denne cellen suspensjon.
    4. I en cytocentrifuge, spinne i 2 minutter på 150 x g og romtemperatur. Kast supernatants.
    5. Demonter til celle konsentrator i henhold til produsentens instruksjoner.
    6. La lysbildet til luft tørr.
      Merk: På dette stadiet, gjenværende celler kan lagres i en tilstrekkelig buffer hvis nødvendig for videre eksperimenter.
    7. Flekk lysbildet med en kommersiell flekker kit (se Tabell for materiale), i henhold til produsentens instruksjoner.
    8. Montere lysbildet med en egnet montering medium og en cover slip.
    9. Sett lysbildet under optisk mikroskopet (600 X) med oljeneddyp.
    10. Telle minst 500 ikke-squamous celler: nøytrofile, eosinofile, makrofager, lymfocytter og epitelceller.
      Merk: Differensiell celletall utføres vanligvis av bare én eller to dedikerte og utdannet observatører til å begrense interobserver avvik.
    11. Absolutt postverdier og prosenter av hver celle.

    • Representative Results

    Hemocytometer
    En typisk avbildning er vist i figur 1 som er visualisert med mikroskopet ved hjelp av hemocytometer. Plateepitel celler er lett identifiseres, som de er mye større enn ikke-squamous cellene. Disse squamous cellene er epitelceller kommer fra munnen. Begge typer celler er farget av Trypan blå når død. Forsiktighet må utvises å unngå teller gjær, bakterier og skrap.

    Figure 1
    Figur 1 : Hemocytometer bilde viser (A) en levende ikke-squamous celle, (B) en død ikke-squamous celle, og (C) en squamous celle. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Cytospin lysbilde: figur 2 viser et representativt bilde av en cytospin lysbilde innhentet etter sputum behandling. De ulike celletyper (nøytrofile, eosinofile, makrofager, lymfocytter og epitelceller) kan differensieres deres morfologi og farge. I noen tilfeller forurensning av plateepitel celler kan være viktig og hvis prosentandelen av plateepitel celler er større enn 80%, prøven regnes som mislykket (Figur 3).

    Figure 2
    Figur 2 : Cytospin lysbildet vises (A) en nøytrofile, (B) en macrophage, (C) en eosinophil, (D) en lymfocytt, og (E) en tarmepitelet. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 : Eksempel på en dårlig kvalitet cytospin lysbilde med > 80% av plateepitel celler. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Suksessraten
    I vår avdeling, er suksessraten av prosedyren (kombinerer en vellykket induksjon og en lesbar cytospin), basert på et utvalg av 1,129 pasienter (friske, astmatikere eller COPD pasienter), 82% (924/1,129). I en sub analyse i henhold til pasienter er suksessraten 75% (57/76) i friske, 82% (827/1,004) i astmatikere og 82% (40/49) i COPD pasienter.

    Resultater i friske
    I en retrospektiv analyse av en rekke 289 sunn fag fra vår avdeling, medianen (interquartile rekkevidde) sputum vekt var 3,72 g (interquartile rekkevidde av 2,46 g - 5.54 g) og median totalt ikke-squamous celle teller/g av sputum var 0,59 x 106 ( interquartile rekkevidde 0,37 x 106 - 1,29 x 106).

    I disse sunn fag, squamous celler er lav på 19% (10% - 34%) og levedyktigheten er høy på 66% (54-78%). Om prosentandelen av de forskjellige celletyper, resultatene oppsummeres i figur 4A. Vi kan observere at prosentandelen av makrofager (49% [31-68%]) er høyere enn prosentandelen av nøytrofile (34% [14% - 60%]), mens prosenter av lymfocytter (2% [1-3%]), eosinofile (0% [0-0%]) og epitelceller (4% [2-11%]) er lav. Disse resultatene er lignende når dataene er uttrykt i absolutte verdier (figur 4B).

    Figure 4
    Figur 4 : Representant resultatene av den differensial celletall observert i friske uttrykk som (A) prosenter eller (B) absolutte verdier. Resultatene vises som median (interquartile rekkevidde). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Det er også viktig å ta hensyn til alder av pasienter. Faktisk finnes en sterk sammenheng mellom pasientens alder og andelen av nøytrofile i sputum prøver (figur 5). Likeledes, når klassifisere pasienter etter 10 års aldersgrupper (figur 6), observerte vi en betydelig økning i nøytrofile prosenten med økende aldersgruppe. Derfor denne variabelen må vurderes når sammenligne resultatene fra forskjellige kohorter, og forsiktighet må tas i den tilsvarende av fag.

    Figure 5
    Figur 5: Sammenheng mellom alder og sputum nøytrofile prosent. Korrelasjon ble beregnet med Spearman test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 6
    Figur 6: Utviklingen av nøytrofile prosenten i henhold til hvilken. P-verdien for ANOVA var < 0,0001 for sammenligning av nøytrofile mellom alder klasser. Flere sammenligninger ble gjort med Dunns flere sammenligninger test. P-verdiene representeres som følger: * p < 0,05, ** p < 0.01, og *** p < 0,001. Resultatene vises som median (interquartile rekkevidde). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Resultater hos pasienter som lider av respiratoriske sykdommer
    Teknikken av indusert sputum brukes vanligvis til å vurdere den inflammatoriske celle profilen astmatisk pasienter.Denne teknikken kan også brukes på pasienter som lider av COPD, en annen inflammatorisk luftveissykdom. Når du sammenligner friske, astmatikere og COPD pasienter (3 grupper matchet for alder, kjønn og tobakk vaner), observerte vi at inflammatorisk celle profilen er ganske annerledes mellom disse kohorter (figur 7). Faktisk er astmatisk pasienter vanligvis preget av hevet sputum eosinofile, mens sputum nøytrofile er vanligvis høyere i COPD pasienter i forhold til sunn kontroller, som er koblet til sykdommens alvorlighetsgrad.

    Figure 7
    Figur 7 : Sputum inflammatorisk celle profil av friske (n = 45), asthmatic pasienter (n = 108), og COPD pasienter (n = 54). De tre gruppene ble matchet for kjønn, alder og tobakk vaner. P-verdiene av ANOVA var < 0,05, < 0,0001, og < 0,0001 for sammenligning av nøytrofile, eosinofile granulocytter og makrofager mellom grupper, henholdsvis. Flere sammenligninger ble gjort med Dunns flere sammenligninger test. P-verdiene representeres som følger: * p < 0,05 og *** p < 0,001. Resultatene vises som median (interquartile rekkevidde). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    Metoden indusert sputum er et nyttig verktøy å studere airway batterirommet. Det er flere mulige anvendelser av denne teknikken. Først, kan det forbedre kunnskap om immunceller og mekanismer involvert i ulike luftveissykdommer. For eksempel, denne teknikken har tillatt etterforskningen av airway betennelse i store kohorter av pasienter, og det har vist at rundt halvparten av astmatisk pasienter er preget av en unormal airway eosinophilic betennelse15, 16 , 17, mens COPD pasienter vanligvis viser en hevet sputum nøytrofile telle18. Denne teknikken har også bidratt til å bedre karakteristikk av airway betennelse hos pasienter med idiopatisk lungefibrose og bevis meglere som kan bidra til denne sykdommen19. Andre kan teknikken av indusert sputum være nyttig å forutsi respons på behandling. Tilstedeværelsen av en unormal sputum eosinofile har for eksempel vist å være en prediktiv markør kortikosteroid respons11,18. Astma og KOLS, ble skreddersy dosen av corticosteroids normalisere andelen sputum eosinofile vist å være mer effektive i å redusere antall eksaserbasjoner enn justere behandling i henhold til gjeldende kliniske retningslinjer11 ,20,21. Tredje kan sputum analyse bidra til å utvikle målrettet terapi. For eksempel har tilstedeværelsen av en uvanlig antall sputum nøytrofile COPD og noen astmatisk pasienter ført til utviklingen av antineutrophilic behandlinger11. Fjerde kan teknikken spille en rolle i diagnose. For eksempel er tilstedeværelsen av sputum eosinophilia nødvendig å stille en diagnose av ikke-astmatiske eosinophilic bronkitt11.

    Foruten en differensiell celletall, innrømmer teknikken av inducing sputum likeledes ytelsen til mange flere analyser, ved å studere sputum supernatant eller sputum celler. Analyse av meglere8,19,22 og vurdering av chemotactic aktiviteten til utvalget for eosinofile22er eksempler med sputum supernatant. Sputum celler, RNA kan trekkes ut og brukes for microRNA eller genuttrykk analyserer19,23 . Sputum cellene kan også analyseres ved flyt cytometri9,23 som tillater, blant annet immunophenotyping og sortere celler. Videre sputum celler kan være kulturperler10, og mellommann produksjonen kan måles i vitro24. Det er verdt å merke seg at i dette tilfellet, megler innholdet er forskjellig fra hva kan finnes i sputum supernatant. Meklarar i sputum supernatant kan faktisk bli påvirket av sekret fra airway bosatt celler og plasma exudation, i motsetning til de sputum celle kultur modell24. Til slutt, immunocytochemistry og i situ hybridisering også utføres med sputum celler7.

    Indusert sputum teknikken har noen begrensninger. Induksjon må utføres under medisinsk tilsyn. Det er også viktig for operatøren å gi nøyaktige instruksjoner til pasienter. Andre begrensninger omfatter samarbeid og medisinsk tilstand av pasienter, som åndedretts innsats er nødvendig. Hensyn til gjennomførbarheten av denne teknikken i barn, flere studier har rapportert at det var vellykket og trygt i barn eldre enn 6 år25. Data om barn av < 6 år mangler25, men det er sannsynlig at sputum induksjon er vanskelige å utføre i disse barn14. Teknikken er begrenset til forskning tjenester og spesialiserte sentre fordi det er teknisk krevende, tidkrevende, og det krever opplært personale1. En annen begrensning er at teknikken av sputum induksjon og analyse ikke er alltid lykkes, betyr at en lesbar cytospin ikke er alltid fått26. Men er suksessraten vanligvis rundt 80% i forskjellige kohorter pasienter,4,,26,,27,,28,,29. Endelig må forsiktighet tas når man sammenligner forskjellige kohorter av pasientene om den tilsvarende alder som det ble vist å påvirke sputum celle teller30,31. Likeledes har andre parametere som kjønn og tobakk samkjøres som de også kan påvirke sputum celle teller29,32. Når pasienten matchende ikke er mulig, er en annen måte å ta hensyn til alder, kjønn eller røyking status å justere den statistiske analysen for disse egenskapene.

    Sammenlignet med andre teknikker som tillater samle celler fra airways, som biopsier og bronchoalveolar lavages, har indusert sputum metoden fordelene av å være enkel, godt tolerert, sikker, reproduserbare, kostnadseffektiv og ikke-invasiv. Disse fordelene kan indusert sputum teknikken utføres i stor skala og gjentatte ganger over tid, og gjøre det et alternativ valg for airway prøvetaking. Bronchosorption er en annen teknikk slik at samlingen av slimhinnene slimhinnen væske for å vurdere airway meglere33. Mens denne teknikken (krever bronkoskopi) er mer invasiv enn indusert sputum, har fordelene av unngå enhver kontaminering med spytt og oppnå høyere konsentrasjoner av meglere enn bronchoalveolar lavage33.

    Avgjørende skritt trenger oppmerksomhet i protokollen. Forsiktighet må først tas opp om saltvann konsentrasjon og tidspunktet for induksjon, fordi disse to parametere kan påvirke resultatene og må derfor være standardisert34,35. Andre er mucolysis med DTT et viktig skritt i behandling. Sammenlignet med PBS, ble DTT vist å bedre spre sputum celler7, som forbedrer cytopsin lysbilde kvaliteten og er viktig å ha en reproduserbar celle teller2. Mucolytic agent kan imidlertid forstyrre målingen av biokjemiske komponenter.Skyter eksperimenter skal deretter utføres når du måler en ny biokjemiske sammensatte36. Til slutt, en annen viktig trinn i fremgangsmåten er cellen teller trinn som må utføres av en tekniker å sikre pålitelig og interpretable resultater.

    En alternativ metode med sputum plugger (seigtflytende eller tettere deler), i stedet for hele sputum, er også beskrevet i litteraturen7. Begge teknikkene har fordeler og ulemper. Hele sputum teknikken tillater raskere behandling7, men er ofte forurenset med spytt, som utvanner prøven og kan redusere kvaliteten på cytospins2,7. Med plug utvalg teknikken, er spytt forurensning redusert, noe som betyr at prøvene er ofte av bedre kvalitet for dosering av flytende fase meglere og cytospin lysbilder7. Behandlingen er imidlertid lengre7 valgte plugger kan ikke representant for hele prøven37. Det er også verdt å merke seg at ikke alle prøver inneholder plugger, som kan være begrensende. Begge metodene er validert og reproduserbare, og det er ingen bevis for at de differensial celletall fra begge disse metodene er forskjellige14,38.

    I fremtiden, kan indusert sputum brukes som et klinisk verktøy for å gi biomarkers for etterforskning, diagnose og behandling av alle typer inflammatorisk luftveissykdommer.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av universitetet sykehus i Liege (CHU Liege). Vi erkjenner "Instants produksjoner" for video produksjon. Vi erkjenner også Cedric François, pasienten som dukket opp i filmen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Spirometer - Spirobank MIR France
    Salbutamol MDI - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
    Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
    Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
    DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
    One-way Valves Hudson RCI USA 41664
    One-way Valves Hudson RCI USA 41665
    Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
    Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
    NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
    Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
    Salbutamol sulfate 5 mg/mL - Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
    Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL - Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
    Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
    Sputolysin reagent Calbiochem 56000
    Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
    Hemocytometer - Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
    Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
     Medion Diagnostic 
    Mounting medium - Entellan Merck Belgium 107960
    Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
    2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
    3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
    4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
    5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
    6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
    7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
    8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
    9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
    10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
    11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
    12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
    13. Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , http://www.ginasthma.org/ (2017).
    14. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
    15. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
    16. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
    17. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory? BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
    18. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
    19. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
    20. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
    21. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
    22. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
    23. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
    24. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
    25. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
    26. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
    27. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
    28. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
    29. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
    30. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
    31. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
    32. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
    33. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
    34. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
    35. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
    36. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
    37. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
    38. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

    Tags

    Medisin problemet 130 mennesker Sputum nedbryting Airway betennelse eosinofile nøytrofile makrofager lymfocytter epitelceller lungesykdommer
    Metodikk for Sputum induksjon og laboratoriet behandling
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., … More

    Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J. L., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter