Summary
هندسة الأنسجة بنيات الكلوي توفر حلاً للنقص في الجهاز والآثار الضارة للغسيل الكلوي. هنا، يمكننا وصف بروتوكول للصغير تشريح الكليتين مورين لعزل قطاعات كورتيكو النخاع. يتم زرع هذه الأجزاء في ثوابت خالية من السقالة الخلوية، تشكيل أورجانويدس الكلوي.
Abstract
زرع الكلي الآن علاج الرئيسي لنهاية مرحلة المرض الكلوي. ومع ذلك، مع حوالي 96,000 شخصا على قائمة الانتظار وإلا ربع هؤلاء المرضى تحقيق الزرع، هناك حاجة ماسة للبدائل لأولئك مع فشل الأجهزة. لتقليل الآثار الضارة لغسيل الكلي جنبا إلى جنب مع أنها تتحمل تكاليف الرعاية الصحية الشاملة، يجري التحقيق النشط بحثاً عن حلول بديلة لزرع الأعضاء. القابلة للغرس هندسة النسيج الكلوي الخلوي بنيات هي أحد هذه النهج الممكنة للاستعاضة عن فقدان الوظائف الكلوية. هنا، ووصف لأول مرة، هو ميكروديسيكشن للكليتين مورين للعزلة كورتيكوميدولاري المعيشية القطع الكلي. هذه القطاعات قادرة على التأسيس السريع داخل بنيات خالية من السقالة غشائي-تنتجها الخلايا الليفية التي قد تمكن من الاتصال السريع مع المفرج المضيف مرة مزروع. وتم شراء الكلي الماوس الكبار من المانحين المعيشة، تليها ميكروديسيكتيون ستيريوسكوبي للحصول على القطع الكلي 200-300 ميكرون في القطر. كانت ملفقة ثوابت كلوية متعددة استخدام شرائح الكلوي الابتدائية تحصد من كلية واحدة فقط. هذا الأسلوب يوضح إجراء الذي يمكن إنقاذ النسيج الكلوي الوظيفي من الأجهزة التي سوف يتم إهمالها على خلاف ذلك.
Introduction
أمراض الكلي المزمنة (كد) واحد من الحالية الرئيسية للصحة العامة التحديات في العالم1. انتشار كد في الولايات المتحدة ما يزيد على 14 في المائة من مجموع السكان، ومع ما يزيد على 600,000 الأمريكيين الذين يعانون من شكل أشد، نهاية مرحلة المرض الكلوي (المسببات)2. وتشمل خيارات العلاج الحالية المتاحة لتلك مع المسببات زرع الكلي والغسيل الكلوي. على الرغم من أن حوالي 25,000 المرضى الخضوع لزرع الكلي كل عام، تتم إضافة عدد كبير من المرضى سنوياً مما يؤدي إلى تفاوت كبير بين أولئك الذين ينتظرون جهازا المنقذة للحياة، و زرع تلك المستقبلة3. بالإضافة إلى آثارها السلبية الخطيرة على طول العمر ونوعية الحياة، يرتبط الغسيل الكلوي عبئا ماليا مذهل. في عام 2014، الرعاية الطبية دفع المطالبات بلغت ما يزيد على دولار 30 بیلیون للمسببات المرضى2. مع إمدادات محدودة من جهاز وليس الانخفاض الظاهر في المرضى الذين يحتاجون إلى غسيل الكلي، الجهود البحثية الرامية إلى تحديد الحلول البديلة للغسيل الكلوي وزرع مهمان من أي وقت مضى. حتى مهلة قصيرة نسبيا في الحاجة للغسيل الكلوي يزيد عدد المريض سنوات العمر المعدلة حسب نوعية وإنتاجية كبيرة بينما أرجأ التكاليف المتصلة بالغسيل الكلوي4،،من56.
وتجري حاليا دراسة الحلول لفقدان أنسجة وظيفية، مثل التي في المسببات، في مختبرات الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة نهوجا متنوعة على نطاق واسع بدءاً من التصنيع القائم على سقالة أورجانويد لكل جهاز باستخدام الهندسة ديسيلولاريزيد هياكل الجهاز لغرس الخلوية7،،من89،10،11. تم جزئيا فقط التحقيق أتصدى هياكل كلوية معقدة من الكليتين هامشية أو التخلص منها. في الواقع، يتم تجاهل 20% من شراء لزرع الكلي تقريبا لمختلف الأسباب12،13. يمكن استخدامها وإدراجها في واحد أو العديد من بنيات هندسة الأنسجة النسيج الكلوي الوظيفي من هذه الطعوم المفترضة. وقد أثبتت الدراسات السابقة إمكانية للعمل مع هذه الأجهزة المهملة، استخدام الكلي للمصفوفة خارج الخلوية لأغراض هندسة الأنسجة14،15. ومع ذلك، قليلة استخدمت الأنسجة نيفرونال الابتدائي من الكليتين صحية لهندسة الأنسجة أغراض16،،من1718.
يتضمن أسلوب واحد سبق وصف كيم وآخرون العزل الكلي "شرائح" من الفئران صحية الكليتين، التي كانت تبذر ثم على السقالات (PGA) حمض بوليجليكوليك لبناء تصنيع16. بيد أن تعطي سوى القليل من المعلومات بشأن منهجية تشريح دقيق وتم الحصول على شرائح من مزيج من تنميق غرامة والترشيح. يصف لنا إدخال تعديل على هذا البروتوكول، وكذلك تنتج شرائح الكلوي المنفصلة مع الهندسة المعمارية نيفرونال سليمة، ولكن بدلاً من ذلك تعتمد على تقنيات ميكروديسيكشن. نيفريكتوميس تجري على الفئران الحية الكبار، بعدها يتم نقل الكلي إلى مجهر التشريح حيث يتم إزالة الكبسولة الكلوي، وكذلك يتم تشريح الأنسجة. وتستخدم كأدوات لقطع العيار الصغير ز 30 الإبر وأيضا كأدلة مساعدة في التشريح، الإبرة قطرها يساوي القطر المستهدفة من شرائح الكلوي. شرائح معزولة، وفي هذه الحالة مورين، الكلوي الحفاظ على استمرارية في الثقافة وتدمج مع ثوابت خالية من السقالة غشائي-تنتجها الخلايا الليفية الخلوية19. قد استخدمت سابقا هذه الثوابت لمهندس الأجهزة الأخرى، بما في ذلك بنكرياس اصطناعي بيو20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بموافقة جميع الإجراءات الجراحية الحيوانية المبينة أدناه "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في "جامعة ساوث كارولينا الطبية" قبل أي عملية جراحية الحيوان أو استخدام أي من الأنسجة الحيوانية.
1-مورين استئصال
- ارتداء قناع الجراحية، وغطاء منتفخ للتقليل من خطر التلوث. الحفاظ على العقم أثناء الإعداد لمنطقة العمليات الجراحية.
- وضع الستائر الجراحية غير فينيستراتيد على طاولة العمليات.
- فتح حزمة أدوات يعقم على الستائر العقيمة. الأدوات اللازمة لاستئصال تشمل 3 هيموستاتس الصغيرة، غرامة الملقط مع الأسنان، الملقط غرامة دون أسنان، ومقص القزحية مباشرة.
- مكان آخر غير فينيستراتيد ثني الجراحية في وسط طاولة العمليات.
- إعداد 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (دببس دولبيكو) مع الكالسيوم والمغنيسيوم، وتستكمل مع 1% البنسلين/ستربتوميسين في أنبوب 15 مل مخروطية عقيمة. وضع هذا الحل على الجليد بجوار طاولة العمليات.
- الحصول ماوس C57BL/6 أسبوع 8-12 قديمة (ذكر أو أنثى) من المجمع السكني الحيوان.
- ضع الماوس داخل دائرة التعريفي لتخدير وحمل مع isoflurane 3.5 ٪ استنشاقه. وضع مخروط الآنف على الماوس، واستخدام إيسوفلوراني 2% للمحافظة على التخدير.
- رصد للعمق الكافي التخدير دورياً طوال فترة الإجراءات الجراحية بتقييم لدواسة ريفلكس (قرصه إصبع ثابتة).
- إزالة جميع الشعر من الجذع البطني باستخدام كريم لإزالة الشعر. أشطف بهذا المجال مع الماء المقطر التأكد من إزالة جميع الشعر من البطن.
- نقل الماوس إلى طاولة العمليات العقيمة في موقف ضعيف تحت ثني غير فينيستراتيد العلوي. قطع 2 × 2 سم2 التثقب في ثني تغمر البطن الماوس فقط.
- تطبيق بوفيدون يتبعه الإيثانول 70% في البطن باستخدام كرات الشاش أو القطن المعقمة.
- استخدام الملقط غرامة مع الأسنان وقزحية المقص، وجعل شق جلد البطن عمودي 3-4 سم موازيا لخط الوسط، 0.5 سم إلى اليسار من خط الوسط
ملاحظة: إذا كان يحاول إزالة الكلي الصحيح، سيكون هذا شق 0.5 سم على يمين خط الوسط.- فهم الصفاق مع الملقط غرامة دون أسنان وجدا مع مقص آيريس لدخول تجويف البطن. تطبيق هيموستاتس على حواف الجانبي أعلى وأدنى من الجلد والصفاق مكان التوتر أفقياً، وتعزيز التعرض.
- تحويل محتويات الأمعاء دقيق إلى الجانب الأيمن من البطن لفضح الكلي اليسرى. بلطف مكان الجر على الكلي للارتقاء بذلك الخروج من البطن.
- المكان هيموستات عبر هيلم الكلي اليسرى. استخدام مقص آيريس لقطاع الحالب والأوعية الكلوية.
- مكان الكلية اليسرى في 1% البنسلين/ستربتوميسين "دببس الحل" على الجليد.
- نقل الأنبوب تتضمن الكلي إلى هود زراعة الأنسجة عقيمة. نقل الكلي من أنبوبة مخروطية الشكل 15 مل إلى طبق بتري 60 ملم (الشكل 1). شطف مرتين باستخدام 5 مل دببس مع الكالسيوم والمغنيسيوم. الاحتفاظ بالكلى قد علقت في 5 مل دببس في الطبق 60 ملم.
- إعداد طبق بيتري إضافية 60 ملم مع 5 مل دببس لاستخدامها خلال بروتوكول ميكروديسيكشن.
- Euthanize الماوس ثوراكوتومي واكسسانجوينيشن عقب شراء الكلي، وفقا لبروتوكول حيوانية معتمدة إياكوك.
2-مورين الكلي ميكروديسيكشن لعزل الجزء الكلوي
- الاستمرار في استخدام تقنية تعقيم لهذا الجزء من البروتوكول، بما في ذلك عقيمة قفازات وقناع الجراحية، ومنتفخ للتقليل من مخاطر التلوث.
- مكان معقم الستائر على منصة ستيريو المجهر، وكذلك فيما يتعلق بمجالات غادر لتوه وحق المجهر أن يكون حقل عقيمة للصكوك. وضع أوراق لاصقة بلاستيكية على مجهر التركيز المقابض ورذاذ مع الإيثانول 70%. قم بتشغيل إضاءة gooseneck المزدوجة الضوء على المسرح.
- فتح المعقم الصكوك (الملقط غرامة دون اثنين هيموستاتس على التوالي، شفرة المبضع #15، 30 اثنين، الأسنان، مقبض مشرط قياس الإبر جوفاء-تتحمل) على الستائر العقيمة. التعامل مع الآن مكان #15 شفرة على دون مشرط وإرفاق هيموستات واحد لكل محول إبرة/محور لإنشاء إبرة تشريح أدوات لاستخدامها في وقت لاحق، كما هو مبين في الشكل 1.
- نقل أطباق بيتري 60 ملم، واحدة تحتوي على الكلي في دببس وفي دببس أخرى فقط، من هود زراعة الأنسجة إلى منطقة المجهر.
- ضع طبق بيتري 60 ملم تحت الهدف وإزالة غطاء لفضح الكلي. ترك الطبق المحتوية على دببس إلى الجانب حقل العقيمة لاستخدامها في وقت لاحق.
- حرك الطبق بحيث فقط السطح الأمامي أو الخلفي للكلى في العرض (أيوجه الكلي، مسطحة كبيرة مع الوجه الآخر لمس أسفل الطبق). تكبير/تصغير إلى 3.2-4 X لهذا الجزء من الإجراء. باستخدام اليد غير المهيمنة، استخدام الملقط غرامة دون أسنان بيرس ودبوس الكلي ضد الطبق قرب القطبين أدنى وأعلى الكلي.
- إبقاء اليد غير المهيمنة في مكان دبوس في الكلي. مع اليد المسيطرة، استخدام شفرة #15 لإزالة الطبقة الحافظة الليفي شفافة من سطح مكشوف. حلق الأكثر سطحية 0.5 مم من سطح مكشوف الكلي لإزالة ما تبقى الكبسولة.
- استخدام شفرة #15 تشريح هرم مقلوب أنسجة من منطقة ديكابسولاتيد، حوالي 2 مم3 في الحجم. استرداد الطبق 60 ملم التي تحتوي على دببس فقط ووضع هرم الأنسجة في طبق نظيف. تجاهل ما تبقى الكلي.
- تقليل التكبير إلى X 1.5-2.0 لبقية التشريح. باستخدام إبرة هيموستات الصكين كأدوات لقطع، شريحة يفتت النسيج إلى أجزاء أصغر تدريجيا حتى شرائح الأنسجة أقل من أو يساوي قطر نصائح إبرة. سوف تنتج أنسجة كلوية 2 مم3 في حجم شرائح أكثر من 50 مرة تماما تشريح.
- تحريك الطبق 60 ملم مع شرائح الكلوي إلى هود زراعة الأنسجة. إزالة دببس مع 1000 ميليلتر ماصة. إضافة 5 مل دميم، وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
- بنيات الثقافة لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية في حاضنة أو زرع في الخلوي فورا.
3-الجزء كلوية بناء الخلوية تلفيق
- ثقافة الليفية الجلدية البشرية العادية (نهدف) والبشرية microvascular غشائي الخلايا الدهنية (هاميك) لعدة أسابيع للحصول على 7.2 × 105 الليفية و 1.8 × 105 خلايا بطانية كل بناء المطلوب. في هود زراعة الأنسجة، البذور المناسبة نسبة الخلايا الليفية لخلايا بطانية (4:1) في الآبار على شكل قضيب في [اغروس] قوالب لتشكيل خالية من السقالة قبل الأوعية بنيات غشائي تنتجها الخلايا الليفية (المواصفات) كما تم وصفه سابقا قبل كزاجكا وآخرون 19.
- الحصول هيموستات معقمة وابرة ز 30 ملعقة عقيمة مع نهاية مسطحة.
- إزالة غالبية وسائل الإعلام من لوحة 60 ملم تحتوي على شرائح الكلوي، مع الحرص على عدم نضح وإزالة الأجزاء الكلوي.
- تجهيز الموازين الجراحية لتصور غرس الأجزاء.
- تتخلص من نهاية الملعقة بلطف على طول الجزء السفلي من الطبق 60 ملم الحصول على شرائح 10-15، وتنتشر بشكل متساو على طول طرف جداً الملعقة. ضع غيض البسط أقرب ما يمكن إلى شفة البئر حيث كان المصنف في المواصفات.
- استخدام أداة إبرة ز هيموستات-30 في اليد الأخرى لنقل كل قطعة فردية من طرف الملعقة إلى حافة البئر. تحرك بلطف كل قطعة من إلى أيضا استخدام تلميح إبرة حتى أغرقت قليلاً في تعليق الخلوية المبذورة سابقا.
- ثقافة المواصفات الجزء الكلي في 2: نسبة 1:1 لتشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية-2/EGM-2/دميم المتوسطة (2.5 مل الحجم الإجمالي). تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل 24 ساعة لمدة 3 أيام. إزالة بنيات من العفن في ح 72 وإصلاح أو فلاش-تجميد للمعالجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بروتوكول وصف تنتج حوالي 50 شرائح الكلوي كل قسم3 مم 2 الهرمية للنسيج الكلوي. القطع الكلي التي تم تجهيزها وتصويرها بمكونات أنبوبي والكبيبي بنسب مختلفة (انظر الشكل 2). شرائح سليمة تعرضوا لفحص من أجل تحديد صلاحية مختلف شرائح مرة واحدة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام. أخضر نيون كالسين-ص موجود مع نشاط استراز داخل الخلايا، ويدل على الخلايا الحية. ويعتبر اثيديوم الأحمر نيون هوموديمير-1 مع فقدان سلامة غشاء البلازما. على الرغم من أن هذه القطع هياكل سليمة، ثلاثية الأبعاد، تغلغل المقايسة كبير ملموس مع الفحص المجهري [كنفوكل] (انظر الشكل 3).
كذلك اتسمت شرائح لتوحيد حجم استخدام مقايسة بقاء الخلية نفسها. استخدام الشرائح الزجاجية مع المنخفضات، شرائح ووضعت تحت غطاء كشوف دون القوة الميكانيكية على البعد أي من القطاعات. مجاناً عائمة، في القطاعات كانت المصورة 30 دقيقة بعد الإيداع في فحص صلاحية/سمية الخلية. ض-إسقاط مع حجم الخطوة 10 ميكرون اتخذ من خلال الجزء المتعلق بأكملها. أكبر الحصول على أبعاد 'X' و 'ص' وتسجيلها. تم الحصول على البعد 'Z' بحساب المسافة من الأول إلى آخر فلوروفوري مرئية. نظراً لأن القطع مكعب تقريبا، تم الحصول على قياس حجم مكعب بسيط وتآمروا لمقارنة 10 قطاعات مختارة عشوائياً من التجربة ميكروديسيكشن واحد. استهداف وحدة التخزين (300 ميكرون)3 = 0.027 مم3 يظهر مع علامة حمراء على الرسم البياني(الشكل 4). قياسات تمثيلية 'X' و 'ص' مبينة في الشكل 4ب. على الرغم من وجود القيم المتطرفة، هناك قطاعات كثيرة قريبة من وحدة التخزين الهدف. تكرار التجارب أظهرت نتائج متسقة (n = 20). القياسات الخام (غير معروضة هنا) تظهر أنه في الغالبية العظمى من شرائح، هناك واحد على الأقل بعد قياس 200-300 ميكرون. وهذا آثار هامة على قيود نشر.
الجزء المتعلق بالكلى جزءا لا يتجزأ من ثوابت خالية من السقالة غشائي-تنتجها الخلايا الليفية ومثقف لمدة 3 أيام. إدراج شرائح الكلوي مع بنيات الخلوية لتشكيل هياكل سليمة قبل يوم 3 (انظر الشكل 5ألف). الاحتفاظ بنيات شبكتهم غشائي الأوعية الدموية مسبقاً، تظهر بوصفها مع فون ويليبراند عامل (الشكل 5ه). ومع ذلك، لا يبدو أن الشبكة يغزو المواد الخلوية الكلوية. تتم تسمية الخلايا الظهارية الكلوي مع سيتوكيراتين-18 (الشكل 5ب، الأخضر). كانت المحتضنة هذه الثوابت مع الزلال المسمى فيتك (الشكل 5ج، رمادي) من أجل اختبار وظائف الكلي في المختبر . بينما هناك بقايا الزلال وجدت بعيداً عن قطاعات النسيج الكلوي مضمن، هناك "النقاط الساخنة" في مجال الخلايا الظهارية الأنبوبي الكلوي، تلك المعروفة بتناول الزلال أن يخترق داخل لومينالي. ويعتقد هذا تمثل امتصاص الزلال في بنية الخلوية الجزء الكلي.
الشكل 1 : صور الممثل من استئصال والكلوي الجزء ميكروديسيكتيون. الكلي مورين هو إزالة وتشطف، وتوضع في طبق 60 ملم، وانتقلت إلى مرحلة مجهر ستيريوسكوبي. قطر طرف إبرة يستخدم لتوجيه التشريح. هيموستاتس متصلة بإبرة نصائح لأدوات التشريح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الجزء الكلوي ميكروديسيكتيد. شرائح الكلوي ميكروديسيكتيد تحتوي على نسب متفاوتة من جلوميرولي (الزاوية اليسرى السفلي، وهيكل باسوفيليك) والأنابيب (ما تبقى الصورة) على الترتيب الأصلي. 10 X صورة، شريط مقياس كما هو مبين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : استمرارية الجزء الكلوي. شرائح الكلوي ميكروديسيكتيد تحتوي على أجزاء من الأنسجة الحية والميتة. غالباً، الجزء المتعلق بالمعيشة، وتظل كذلك في الثقافة في h. 72 علما أن قطاعات مختلفة استخدمت لنقاط زمنية مختلفة، كما تحليل الجدوى نفسها سامة للخلايا. 10 X صور وأشرطة مقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الجزء الكلوي حجم التوحيد. (أ) الجزء حجم مكعب في ملم3 من التجربة تشريح واحدة (n = 10). وتمثل النقاط الزرقاء، بالمقارنة مع نقطة حمراء الهدف (الهدف حجم 0.027 مم3) الأجزاء الفردية. (ب) ممثل X و Y البعد قياسات من مقايسة الميت يعيش، 10 X الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : هندسة الأنسجة السقالة خالية الكلوي الجزء بناء. (أ) الصورة ممزوج عرض إدماج قطاعات الكلي المواصفات (ب) سيتوكيراتين-18-إيجابية كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية (أخضر). (ج) المسمى فيتك الزلال. (د) هويخست وصمة عار للنوى. (ه) عامل (vWF) فون ويليبراند الإيجابية تسليط الضوء على الشبكة بريفاسكولار. الصور X 10، شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطرق المستخدمة لهندسة الأنسجة الكلوية الحية ثوابت تختلف على نطاق واسع فيما يتعلق بكل نوع من الخلايا والمواد الحيوية المستخدمة، وفي كثير من الحالات، التي عفا عليها الزمن أو لا يميز جيدا في الأدب7. بينما كثير تستخدم الخلايا الجذعية نهج أو لخص المكونات الفردية للهيكل الكلي بمعزل عن غيرها، احتمال مصطنع إعادة إنشاء جهاز كامل مع أنواع مختلفة من خلية متمايزة ما يزيد على 26 من المعلقات الخلوية الساحق للنظر في21. هذا المرجح لماذا الآخرين انتقلوا إلى النهج باستخدام شرائح من الأنسجة الكلوية في الأنسجة التطبيقات الهندسية. كما هو موضح أعلاه، قد أنجز العمل السابق بمعزل عن القطع الكلي للبذر في الشبكة السقالات16. ومع ذلك، وصف المنهجية المستخدمة لوصف عزلة قطاعات في القليل من التفاصيل والقطاعات كانت مثقف لا لأية فترة من الوقت لتقييم لجدوى. الأسلوب الموصوفة هنا، جنبا إلى جنب مع استخدام فحص صلاحية الخلوية، تبين أن أجزاء من القطع الكلي على الأقل، هي الحفاظ على استمرارية لعلامة 72-h، التي وصفت لا قبل. ويمتاز الأسلوب أيضا إنتاج شرائح ذات أبعاد يمكن التنبؤ بها إلى حد ما. بالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الأساليب نهجاً سريرياً قابل للنقل إلى زيادة الفشل في وظيفة الكلي، أساسا إثبات طريقة مجدية لعزل أجزاء من الأنسجة الكلوية الأولية من الأجهزة التي سوف يتم إهمالها على خلاف ذلك.
في تطوير الأسلوب، كانت، أولاً، تحديد أكبر التحديات كائن عقيمة الحجم المناسب، وثانيا، الحفاظ على العقم كما ينطوي الإجراء خطوات كثيرة خارج هود ثقافة الخلية. ز 30 إبرة نصائح ثبت قياس مفيدة، فضلا عن أجهزة التشريح. وكان العقم تحديا مبكرا في التجريب، يتصل معظمها بإنشاء العمليات الجراحية والفراء موريني المسيطر.
القيود المفروضة على الإجراء تتعلق بطبيعة ثلاثية الأبعاد من قطاعات النسيج الكلوي. في طريقة عرض واحدة تحت المجهر، قد تظهر أبعاد الجزء المتعلق بأن يكون حجم قطر الإبرة، 0.260 مم تقريبا. ومع ذلك، Z-البعد غير مرئي في ستيريوسكوبي. ويتم في ميكروديسيكشن من جهة، نفسه الذي قيد آخر. في المستقبل، سيكون من المثالي توحيد الروبوتية. إذا حوفظ على الجزء الهرمي3 مم 2 من الأنسجة الكلوية في الاتجاه الصحيح أثناء التشريح، تشريح من النيفرون سليمة لن يكون الاكتناه. وأخيراً، مقارنة هذه الثوابت بالبنكرياس الأحيائية الاصطناعي، في جزيرة ليلى التي تم تضمين الخلايا في المواصفات، واحد يجب أن نقر الاختلافات الأساسية بينهم20. الكلي وظيفيا ومعماريا فريداً من البنكرياس ويمكن القول أن أكثر تعقيداً. بالإضافة إلى ذلك، خلايا الجزيرة فرعي واحد فقط من الخلايا الوظيفية داخل البنكرياس، بدلاً من تكتل الخلايا الوظيفية معزولة بالقطع الكلي في هذا الأسلوب. مع الهندسة المعمارية وعلى وجه التحديد اتجاهية لعب دوراً كبيرا في وظيفة الكلي وخاصة الترشيح، عدم وجود اتجاه موحد الأجزاء داخل بنية ضعف إضافية لهذه المنهجية.
البحوث الجارية تهدف إلى تقييم الجزء الكلي ووظيفة بناء الكلوية، توضيح مدى الذي يحدث امتصاص الزلال وتقييم وظائف الكلي الأخرى. التجارب الحيوانية المقبلة سيشمل غرس بنيات الكلوية في جدار المثانة. التضمين في البناء في هذا الهيكل بدنية عالية والأوعية الدموية سوف تسمح لملامسة السريع، فضلا عن تفادي الحاجة إلى نظام لجمع، مع filtrate التغوط مباشرة في المثانة. وبالنظر إلى أن وظيفة في المختبر من الأنسجة الكلوية محدودة للغاية، في فيفو اختبار أمر حيوي. الاختبارات فقط في المختبر حاليا ذكرت في الأدبيات تتركز حول الزلال الإقبال وارثروبويتين التعبير17،22. هذه المقاطع الحية من الأنسجة الكلوية سليمة في هندسته المعمارية الأصلية جزءا لا يتجزأ من بنيات مع شبكات غشائي البدائية، والتي لا تعتمد على أي الحيوية الأجنبية، وإظهار الوعد في المضي قدما نحو استبدال الأنسجة الكلوية الوظيفية، متوافق حيويا .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
منحة التدريب ما بعد الدكتوراه المؤسسي المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة-HL-007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J.
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
