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Bioengineering

Microdissection प्राथमिक गुर्दे ऊतक क्षेत्रों और उपंयास पाड़ मुक्त निर्माण प्रौद्योगिकी के साथ शामिल होने के

Published: March 27, 2018 doi: 10.3791/57358
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina
* These authors contributed equally

Summary

ऊतक इंजीनियर गुर्दे का निर्माण डायलिसिस के अंग की कमी और बचके प्रभाव के लिए एक समाधान प्रदान करते हैं । यहां, हम cortico-दिमाग़ी क्षेत्रों के अलगाव के लिए माइक्रो काटना murine गुर्दे के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इन क्षेत्रों पाड़ मुक्त सेलुलर constructs में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, गुर्दे organoids बनाने ।

Abstract

गुर्दा प्रत्यारोपण अब अंत चरण गुर्दे की बीमारी के लिए एक मुख्यधारा चिकित्सा है । हालांकि, लगभग ९६,००० लोगों के साथ प्रतीक्षा सूची पर और केवल एक-चौथाई प्रत्यारोपण प्राप्त करने के इन रोगियों के लिए विकल्प के लिए एक सख्त जरूरत है अंगों के साथ उन लोगों के लिए । आदेश में समग्र स्वास्थ्य देखभाल लागत के साथ डायलिसिस के हानिकारक परिणामों को कम करने के लिए, सक्रिय जांच अंग प्रत्यारोपण के लिए वैकल्पिक समाधान की तलाश में चल रहा है । प्रत्यारोपित ऊतक-इंजीनियर गुर्दे सेलुलर constructs एक ऐसी व्यवहार्य दृष्टिकोण खो गुर्दे की कार्यक्षमता की जगह के लिए कर रहे हैं । यहां, पहली बार के लिए वर्णित है, corticomedullary गुर्दे क्षेत्रों रहने के अलगाव के लिए murine गुर्दे की microdissection है । इन क्षेत्रों पाड़ मुक्त endothelial-fibroblast निर्माण जो मेजबान vasculature के साथ तेजी से संबंध में सक्षम हो सकता है एक बार प्रत्यारोपित में तेजी से शामिल करने में सक्षम हैं । वयस्क माउस गुर्दे जीवित दाताओं से खरीद रहे थे, stereoscope microdissection के बाद गुर्दे वर्गों प्राप्त करने के लिए 200-व्यास में 300 µm । एकाधिक गुर्दे का निर्माण केवल एक गुर्दा से काटा प्राथमिक गुर्दे खंडों का उपयोग कर गढ़े थे । इस विधि एक प्रक्रिया है जो अंगों से कार्यात्मक गुर्दे के ऊतकों को उबार सकता है कि अंयथा खारिज कर दिया जाएगा दर्शाता है ।

Introduction

क्रोनिक गुर्दे की बीमारी (सीकेडी) वर्तमान प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चुनौतियों में से एक है दुनिया भर में1। संयुक्त राज्य अमेरिका में सीकेडी की व्यापकता कुल जनसंख्या का 14% से अधिक है, ६००,००० सबसे गंभीर रूप से पीड़ित अमेरिकियों के साथ, अंत चरण गुर्दे की बीमारी (ESRD)2। वर्तमान उपचार ESRD के साथ उन लोगों के लिए उपलब्ध विकल्प डायलिसिस और गुर्दे प्रत्यारोपण शामिल हैं । हालांकि लगभग 25,000 रोगियों को हर साल गुर्दे प्रत्यारोपण से गुजरना, रोगियों की एक महत्वपूर्ण संख्या सालाना जोड़ रहे है एक जीवन रक्षक अंग की प्रतीक्षा कर रहे लोगों के बीच एक बड़ी असमानता के लिए अग्रणी और उन प्राप्त ट्रांसप्लांटेशन3। दीर्घायु और जीवन की गुणवत्ता पर अपनी गंभीर नकारात्मक प्रभाव के अलावा, डायलिसिस एक आश्चर्यजनक वित्तीय बोझ के साथ जुड़ा हुआ है । 2014 में, मेडिकेयर भुगतान दावों ESRD रोगियों के लिए $३०,०००,०००,००० से अधिक कुल2। एक सीमित अंग की आपूर्ति और डायलिसिस की आवश्यकता रोगियों में कोई स्पष्ट गिरावट के साथ, अनुसंधान डायलिसिस और प्रत्यारोपण के लिए वैकल्पिक समाधान की पहचान करने के उद्देश्य से प्रयास कभी भी महत्वपूर्ण हैं । यहां तक कि डायलिसिस के लिए की जरूरत में एक अपेक्षाकृत कम देरी गुणवत्ता के एक रोगी की संख्या-समायोजित जीवन साल और उत्पादकता काफी बढ़ जाती है जबकि डायलिसिस से संबंधित लागत4,5,6स्थगित ।

कार्यात्मक ऊतक हानि के लिए समाधान, जैसे कि ESRD में, वर्तमान में ऊतक इंजीनियरिंग और अपक्षयी दवा प्रयोगशालाओं में अध्ययन किया जा रहा है, व्यापक रूप से विविध पाड़ से लेकर दृष्टिकोण-आधारित organoid निर्माण पूरे अंग इंजीनियरिंग का उपयोग करने के साथ सेलुलर आरोपण के लिए सेलुलर अंग संरचनाओं7,8,9,10,11। सीमांत या त्याग गुर्दे से Recapitulating जटिल गुर्दे संरचनाओं केवल आंशिक रूप से जांच की गई है । वास्तव में, प्रत्यारोपण के लिए खरीद गुर्दे के लगभग 20% विभिन्न कारणों से12,13के लिए छोड़ दिया जाता है । इन ख्यात भ्रष्टाचार से कार्यात्मक गुर्दे ऊतक का उपयोग किया जा सकता है और एक या कई ऊतक में शामिल इंजीनियर निर्माण । पूर्व अध्ययनों ने इन खारिज अंगों के साथ काम करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोजनों के लिए अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स के लिए गुर्दे का उपयोग14,15. हालांकि, कुछ ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोजनों के लिए स्वस्थ गुर्दे से प्राथमिक nephronal ऊतक का इस्तेमाल किया है16,17,18।

एक विधि पहले किम एट अल द्वारा वर्णित है. स्वस्थ चूहा गुर्दे, जो फिर polyglycolic एसिड (पीजीए) मचान पर बीज के निर्माण के लिए किया गया था से गुर्दे का अलगाव शामिल16। हालांकि, थोड़ा जानकारी सटीक विच्छेदन पद्धति के बारे में दिया जाता है, और क्षेत्रों ठीक नख़रेबाज़ और निस्पंदन के संयोजन से प्राप्त किया गया । हम इस प्रोटोकॉल है, जो इसी तरह बरकरार nephronal वास्तुकला के साथ असतत गुर्दे क्षेत्रों का उत्पादन का एक संशोधन का वर्णन है, लेकिन बजाय microdissection तकनीकों पर निर्भर करता है । Nephrectomies वयस्क चूहों रहने पर प्रदर्शन कर रहे हैं, जिसके बाद गुर्दे विच्छेदन खुर्दबीन जहां गुर्दे कैप्सूल हटा दिया जाता है स्थानांतरित कर रहे हैं, और ऊतक आगे विच्छेदित है. छोटे बोर 30 ½ जी सुइयों उपकरण काटने के रूप में और भी विच्छेदन में सहायता गाइड के रूप में उपयोग किया जाता है, सुई व्यास गुर्दे क्षेत्रों के लक्ष्य व्यास के बराबर है के रूप में. अलग, इस मामले murine में, गुर्दे क्षेत्रों संस्कृति में व्यवहार्यता बनाए रखने और पाड़ मुक्त endothelial-fibroblast सेलुलर के साथ शामिल19का निर्माण करती है । ये निर्माण पहले एक जैव कृत्रिम अग्ंयाशय20सहित अंय अंगों, इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

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Protocol

सभी पशु शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के नीचे वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल विश्वविद्यालय में किसी भी जानवर सर्जरी या किसी भी जानवर के ऊतकों के उपयोग से पहले से मंजूरी दे दी गई ।

1. Murine Nephrectomy

  1. एक शल्य मुखौटा और bouffant टोपी को संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए डॉन । सर्जिकल क्षेत्र के सेट अप के दौरान बांझपन बनाए रखें ।
    1. ऑपरेटिंग मेज पर गैर fenestrated सर्जिकल पर्दे प्लेस ।
    2. बाँझ पर्दे पर autoclaved उपकरणों के पैक खोलें । nephrectomy के लिए आवश्यक उपकरणों में 3 छोटे hemostats, दांतों के साथ फाइन संदंश, दांतों के बिना फाइन संदंश, और सीधे आइरिस कैंची शामिल है ।
    3. ऑपरेटिंग टेबल के केंद्र में एक और गैर fenestrated सर्जिकल कपड़े प्लेस ।
    4. Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के 5 मिलीलीटर तैयार कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ, एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब में 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक । इस समाधान को ऑपरेटिंग टेबल के आगे बर्फ पर लगाएं ।
  2. पशु आवास परिसर से एक 8-12 सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस (पुरुष या महिला) प्राप्त करें ।
  3. एक संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर के अंदर माउस प्लेस और 3.5% सांस isoflurane के साथ प्रेरित । माउस पर एक नाक शंकु प्लेस, रखरखाव संज्ञाहरण के लिए 2% isoflurane का उपयोग कर ।
    1. संज्ञाहरण के लिए पर्याप्त गहराई के लिए मॉनिटर पेडल पलटा (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) के लिए आकलन करके शल्य प्रक्रिया के दौरान समय पर ।
  4. बालों को हटाने क्रीम का उपयोग कर ventral धड़ से बालों के सभी निकालें । आसुत जल के साथ इस क्षेत्र कुल्ला सभी बाल सुनिश्चित करने के लिए पेट से हटा दिया गया है ।
  5. शीर्ष गैर fenestrated कपड़ा के तहत लापरवाह स्थिति में बाँझ ऑपरेटिंग तालिका के लिए माउस स्थानांतरण. एक 2 एक्स 2 सेमी2 fenestration में बाहर कट बस माउस पेट से अधिक लिपटे ।
  6. लागू povidone-आयोडीन द्वारा 70% इथेनॉल के बाद पेट बाँझ धुंध या कपास गेंदों का उपयोग कर ।
  7. दांत और आइरिस कैंची के साथ ठीक संदंश का उपयोग करना, एक 3-4 सेमी ऊर्ध्वाधर उदर त्वचा midline के समानांतर चीरा, midline के बाईं ओर 0.5 सेमी
    नोट: यदि सही गुर्दे को हटाने का प्रयास, यह एक चीरा 0.5 सेमी midline के अधिकार के लिए किया जाएगा ।
    1. दांत के बिना ठीक संदंश के साथ और उदर गुहा में प्रवेश करने के लिए आइरिस कैंची के साथ incise के साथ आँख बाद में तनाव और बढ़ाने के लिए त्वचा और योनि के सुपीरियर और अवर पार्श्व किनारों पर hemostats लागू करें ।
    2. आंत्र सामग्री नाजुक पेट के दाईं ओर करने के लिए छोड़ दिया गुर्दे का पर्दाफाश करने के लिए Shift । धीरे से यह पेट से बाहर तरक्की करने के लिए गुर्दे पर कर्षण जगह है ।
    3. बायीं किडनी के hilum के आरपार एक hemostat लगाएं । मूत्रवाहिनी और गुर्दे की वाहिकाओं को transect करने के लिए आइरिस कैंची का प्रयोग करें ।
    4. छोड़ दिया गुर्दे 1% पेनिसिलिन/Streptomycin DPBS समाधान में बर्फ पर रखें ।
    5. बाँझ ऊतक संस्कृति हूड के लिए गुर्दे युक्त ट्यूब हस्तांतरण. किडनी को 15 एमएल वाली शंकु ट्यूब से 60 एमएम पेट्री डिश (फिगर 1) में ट्रांसफर करें । दो बार कुल्ला कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 5 मिलीलीटर DPBS का उपयोग । 60 एमएम के डिश में 5 एमएल DPBS में किडनी को निलंबित रखें ।
      1. microdissection प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले 5 एमएल DPBS के साथ एक अतिरिक्त 60 एमएम पेट्री डिश तैयार करें ।
    6. Euthanize द्वारा माउस thoracotomy और exsanguination गुर्दे की खरीद के बाद, एक अनुमोदित IACUC पशु प्रोटोकॉल के अनुसार ।

2. गुर्दे खंड अलगाव के लिए Murine गुर्दे Microdissection

  1. प्रोटोकॉल के इस भाग के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग जारी रखें, बाँझ दस्ताने सहित, सर्जिकल मास्क, और bouffant प्रदूषित जोखिम को कम करने के लिए.
    1. स्टीरियो माइक्रोस्कोप मंच पर बाँझ पर्दे प्लेस के रूप में अच्छी तरह से क्षेत्रों के लिए सिर्फ छोड़ दिया और सही माइक्रोस्कोप के लिए उपकरणों के लिए एक बाँझ क्षेत्र है. प्लेस प्लास्टिक माइक्रोस्कोप पर चिपकने वाला ध्यान knobs और स्प्रे के साथ 70% इथेनॉल । चरण प्रकाश करने के लिए दोहरे gooseneck प्रकाशक को चालू करें ।
    2. खुले निष्फल उपकरणों (दांत के बिना ठीक संदंश, स्केलपेल संभाल, #15 स्केलपेल ब्लेड, दो सीधे hemostats, २ ३० ½ गेज खोखले बोर सुई) बाँझ पर्दे पर । स्केलपेल संभाल पर #15 ब्लेड प्लेस अब और एक सुई अनुकूलक/हब के लिए एक hemostat संलग्न बाद में उपयोग के लिए सुई विच्छेदन उपकरणों बनाने के लिए, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है ।
  2. 60 मिमी पेट्री व्यंजन, एक DPBS में गुर्दे और अंय केवल DPBS, ऊतक संस्कृति हूड से माइक्रोस्कोप क्षेत्र के लिए युक्त हटो ।
    1. उद्देश्य के तहत 60 मिमी पेट्री पकवान प्लेस और ढक्कन को हटाने के लिए गुर्दे का पर्दाफाश । बाद में उपयोग के लिए बाँझ क्षेत्र पर पक्ष को DPBS-युक्त पकवान छोड़ दें ।
    2. पकवान ले जाएं ताकि केवल गुर्दे के पूर्वकाल या पीछे की सतह को देखने में है (यानी, गुर्दे के बड़े फ्लैट चेहरा, दूसरे चेहरे के साथ पकवान के नीचे छू) । प्रक्रिया के इस भाग के लिए 3.2-4x ज़ूम करें । गैर प्रमुख हाथ का उपयोग करना, दांत के बिना ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए पियर्स और गुर्दे के अवर और सुपीरियर डंडे के पास पकवान के खिलाफ गुर्दे पिन ।
    3. गुर्दे पिन करने के लिए जगह में गैर प्रमुख हाथ रखो । प्रमुख हाथ के साथ, उजागर सतह से पारदर्शी रेशेदार संपुटी परत को दूर करने के लिए #15 ब्लेड का उपयोग करें । कैप्सूल के शेष को दूर करने के लिए गुर्दे की उजागर सतह से सबसे सतही 0.5 मिमी दाढ़ी ।
    4. decapsulated क्षेत्र से ऊतक के एक औंधा पिरामिड काटना करने के लिए #15 ब्लेड का प्रयोग करें, लगभग 2 मिमी आकार में3 . केवल DPBS युक्त 60 मिमी पकवान निकालते हैं और साफ पकवान में ऊतक के पिरामिड जगह है । गुर्दे के शेष त्यागें ।
    5. विच्छेदन के आराम के लिए 1.5-2.0 x तक आवर्धन घटाएं । उपकरणों के काटने के रूप में दो hemostat सुई उपकरणों का उपयोग करना, ऊतक के क्षेत्रों से कम या बराबर सुई सुझावों के व्यास के लिए कर रहे हैं जब तक कि उत्तरोत्तर छोटे टुकड़ों में टुकड़े टुकड़े । एक गुर्दे ऊतक 2 मिमी3 आकार में एक बार पूरी तरह से विच्छेदित 50 से अधिक क्षेत्रों का उत्पादन होगा ।
    6. ऊतक संस्कृति हूड के लिए गुर्दे के क्षेत्रों के साथ 60 मिमी पकवान ले जाएँ. 1000 µ l पिपेट के साथ DPBS निकालें । 5 मिलीलीटर DMEM जोड़ें, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक ।
    7. एक मशीन या सेलुलर में प्रत्यारोपण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए संस्कृति तुरंत निर्माण ।

3. गुर्दे खंड सेलुलर निर्माण निर्माण

  1. संस्कृति सामांय मानव अधययन fibroblasts (NHDF) और मानव वसा microvascular endothelial कोशिकाओं (HAMEC) कई हफ्तों के लिए 7.2 x 105 fibroblasts और 1.8 x 105 endothelial कोशिकाओं के निर्माण के प्रति वांछित प्राप्त करने के लिए । टिशू कल्चर हुड में, बीज endothelial कोशिकाओं को fibroblasts के उचित अनुपात में (4:1) रॉड के आकार के कुओं में agarose molds में पाड़ मुक्त पूर्व संवहनी endothelial-fibroblast constructs (कल्पना) के रूप में पहले Czajka एट अल द्वारा वर्णित है 19.
  2. एक निष्फल hemostat, 30 ½ जी सुई, और सपाट अंत के साथ एक बाँझ रंग प्राप्त करें ।
    1. गुर्दे क्षेत्रों से युक्त 60 मिमी प्लेट से मीडिया के बहुमत को हटा दें, महाप्राण और गुर्दे क्षेत्रों को दूर करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा.
    2. सर्जिकल Loupes को प्रखंडों के आरोपण की कल्पना से सज्जित करना ।
    3. रंग के अंत में 60 मिमी पकवान के नीचे के साथ धीरे परिमार्जन 10-15 खंडों को प्राप्त करने के लिए, रंग के बहुत टिप के साथ समान रूप से फैल गया । रंग के टिप प्लेस के रूप में अच्छी तरह से जहां कल्पना वरीयता प्राप्त के होंठ को बंद करो ।
    4. दूसरे हाथ में एक hemostat-30 ½ जी सुई साधन का प्रयोग करें रंग टिप से प्रत्येक व्यक्ति खंड अच्छी तरह से किनारे करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए । धीरे से थोड़ा पहले वरीयता प्राप्त सेलुलर निलंबन में डूबे जब तक अच्छी तरह से सुई टिप का उपयोग कर में प्रत्येक खंड चाल ।
    5. संस्कृति गुर्दे खंड-2:1:1 में कल्पना का खात्मा-2/ईजीएम-2/DMEM मीडियम (2.5 mL वॉल्यूम टोटल) । बदलें संस्कृति मीडिया हर 24 3 दिनों के लिए एच । मोल्ड्स से निर्माणों को 72 h पर निकालें और प्रोसेसिंग के लिए flash-फ्रीज़ करें ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल वर्णित लगभग 50 प्रति गुर्दे खंड पिरामिड 2 मिमी गुर्दे ऊतक के3 खंड का उत्पादन । गुर्दे क्षेत्रों है कि संसाधित किया गया है और imaged अनुपात भिंन में ट्यूबलर और glomerular घटक है ( चित्रा 2देखें) । बरकरार क्षेत्रों में एक परख के अधीन थे ताकि विभिंन क्षेत्रों की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक बार हर 24 तीन दिनों के लिए एच । ग्रीन-फ्लोरोसेंट calcein-एएम intracellular esterase गतिविधि के साथ मौजूद है, जो कोशिकाओं के रहने का संकेत है । लाल-फ्लोरोसेंट ethidium homodimer-1 प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता के नुकसान के साथ देखा जाता है । हालांकि इन क्षेत्रों बरकरार हैं, तीन आयामी संरचनाओं, महत्वपूर्ण परख पैठ फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्रशंसनीय है ( चित्रा 3देखें).

खंडों आगे आकार एक ही सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग एकरूपता के लिए विशेषता थे । अवसादग्रस्तता के साथ ग्लास स्लाइड का उपयोग करना, सेगमेंट के किसी भी आयाम पर रखे गए यांत्रिक बल के बिना कवर स्लिप के अंतर्गत रखे गए थे. नि: शुल्क फ्लोटिंग, खंडों सेल व्यवहार्यता में प्लेसमेंट के बाद 30 मिनट की छवि/ पूरे सेगमेंट के जरिए 10-µm स्टेप साइज वाला जेड-प्रोजेक्शन लिया गया । सबसे बड़ा ' एक्स ' और ' Y ' आयाम प्राप्त किया और दर्ज की गई । ' Z ' आयाम पहले से अंतिम दिखाई fluorophore से दूरी की गणना करके प्राप्त किया गया था । यह देखते हुए कि क्षेत्रों में मोटे तौर पर घन हैं, एक सरल घन मात्रा माप प्राप्त किया गया था और एक microdissection प्रयोग से 10 बेतरतीब ढंग से चयनित क्षेत्रों की तुलना करने के लिए साजिश रची । लक्ष्य की मात्रा (300 µm)3 = ०.०२७ mm3 हिस्टोग्राम (चित्रा 4ए) पर एक लाल मार्कर के साथ दिखाया गया है । प्रतिनिधि ' X ' और ' Y ' माप चित्रा 4बीमें दिखाए जाते हैं । हालांकि outliers हैं, कई सेगमेंट लक्ष्य वॉल्यूम के करीब हैं । दोहराएँ प्रयोग लगातार परिणाम दिखाया गया है (n = 20). कच्चे माप (यहां नहीं दिखाया गया है) पता चलता है कि क्षेत्रों के विशाल बहुमत में, वहां है एक 200-300 µm को मापने के ंयूनतम एक आयाम । यह प्रसार सीमाओं के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है ।

गुर्दे क्षेत्रों पाड़ मुक्त endothelial में एंबेडेड है fibroblast constructs और 3 दिनों के लिए संस्कृति । गुर्दे क्षेत्रों सेलुलर के साथ शामिल करने के लिए 3 दिन से बरकरार संरचनाओं फार्म का निर्माण ( चित्रा 5एदेखें) । निर्माण अपने पूर्व संवहनी endothelial नेटवर्क को बनाए रखने, वॉन Willebrand फैक्टर (चित्रा 5ई) के साथ लेबलिंग द्वारा दिखाया गया है । हालांकि, यह नेटवर्क गुर्दे सेलुलर सामग्री पर आक्रमण कि प्रकट नहीं होता है. गुर्दे उपकला कोशिकाओं Cytokeratin-18 (चित्रा 5बी, ग्रीन) के साथ लेबल कर रहे हैं. इन का निर्माण FITC-लेबल एल्ब्युमिन (चित्रा 5सी, ग्रे) के साथ मशीन थे क्रम में इन विट्रो गुर्दे की कार्यक्षमता में परीक्षण करने के लिए । वहाँ अवशिष्ट एल्ब्युमिन एम्बेडेड गुर्दे ऊतक के क्षेत्रों से दूर पाया जाता है, वहाँ गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं के क्षेत्र में "गर्म धब्बे" कर रहे हैं, एल्ब्युमिन कि अंतर-चमकदार ट्रैवर्स को लेने के लिए जाना जाता है उन. यह गुर्दे खंड सेलुलर निर्माण में एल्ब्युमिन reuptake प्रतिनिधित्व करने के लिए सोचा है ।

Figure 1
चित्र 1 : Nephrectomy और गुर्दे खंड Microdissection से प्रतिनिधि तस्वीरें । एक murine गुर्दे निकाल दिया जाता है, कुल्ला, और एक 60 मिमी पकवान में रखा, और stereoscope माइक्रोस्कोप मंच पर ले जाया गया । सुई टिप के व्यास विच्छेदन गाइड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Hemostats विच्छेदन यंत्रों के लिए सुई युक्तियां से जुड़ी हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Microdissected गुर्दे खंड । microdissected गुर्दे क्षेत्रों glomeruli (निचले बाएं कोने, basophilic संरचना) और नलिकाओं (छवि के शेष) उनके मूल व्यवस्था में के अनुपात बदलती हैं । 10x छवि, स्केल बार के रूप में संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : गुर्दे खंड व्यवहार्यता । microdissected गुर्दे क्षेत्रों रहते है और मृत ऊतक के भाग होते हैं । मुख्य रूप से, क्षेत्रों में रह रहे हैं, और संस्कृति में 72 घंटे में तो रह ध्यान दें कि विभिंन क्षेत्रों अलग समय अंक के लिए इस्तेमाल किया गया, के रूप में व्यवहार्यता परख ही कोशिकाओं को विषाक्त है । 10x छवियां, स्केल सलाखों = 200 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : गुर्दे खंड मात्रा एकरूपता । (A) खंड एक विच्छेदन प्रयोग (n = 10) से मिमी3 में घन खंड । व्यक्तिगत सेगमेंट (लक्ष्य वॉल्यूम ०.०२७ mm3) लक्ष्य की तुलना में, नीले बिंदु द्वारा दर्शाए जाते हैं । (ख) जी मृत परख, 10x छवि से प्रतिनिधि एक्स और वाई आयाम माप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : ऊतक इंजीनियर पाड़-मुक्त गुर्दे खंड का निर्माण । (क) विलय कल्पना में गुर्दे क्षेत्रों के शामिल छवि । (ख) Cytokeratin-18-सकारात्मक गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं (हरा). (ग) FITC-त्यसपछि एल्ब्युमिन । (घ) नाभिक के लिए Hoescht दाग । (ङ) वॉन-Willebrand फैक्टर (vWF) सकारात्मकता के संवहनी नेटवर्क पर प्रकाश डाला । 10x छवियां, स्केल बार = 200 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इंजीनियर रहने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों गुर्दे ऊतक का निर्माण दोनों प्रकार की कोशिकाओं के संबंध में व्यापक रूप से बदलती हैं और उपयोग की गई सामग्री, और कई मामलों में, पुराने या नहीं कर रहे हैं अच्छी तरह से साहित्य में विशेषता7. जबकि कई स्टेम सेल दृष्टिकोण या recapitulating अलगाव में गुर्दे की वास्तुकला के व्यक्तिगत घटकों का उपयोग कर रहे हैं, कृत्रिम रूप से सेलुलर सस्पेंशन से 26 से अधिक विभिंन विभेदित कोशिका प्रकार के साथ एक पूरे अंग को पुनः बनाने की संभावना है 21पर विचार करना भारी । यह संभावना है क्यों दूसरों के ऊतकों इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में गुर्दे के ऊतकों के क्षेत्रों का उपयोग कर दृष्टिकोण को स्थानांतरित कर दिया है । जैसा कि ऊपर वर्णित है, पिछले काम पीजीए पाड़16पर बोने के लिए गुर्दे की खंडों के अलगाव में किया गया है । हालांकि, प्रखंडों के अलगाव का वर्णन करने के लिए पद्धति का उपयोग थोड़ा विस्तार में वर्णित किया गया था और प्रखंडों के लिए व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए समय की किसी भी अवधि के लिए संस्कृति नहीं थे । विधि यहां वर्णित है, सेलुलर व्यवहार्यता परख के उपयोग के साथ, से पता चलता है कि ंयूनतम पर, गुर्दे क्षेत्रों के कुछ हिस्सों में 72-एच मार्क, जो पहले नहीं बताया गया है की व्यवहार्यता बनाए रखने रहे हैं । विधि भी काफी उंमीद के मुताबिक आयामों के साथ क्षेत्रों के उत्पादन का लाभ है । इसके अतिरिक्त, इन तरीकों को एक नैदानिक अनुवाद करने के लिए असफल गुर्दे समारोह बढ़ाने, मुख्य रूप से अंगों है कि अंयथा छोड़ दिया जाएगा से प्राथमिक गुर्दे के ऊतकों के क्षेत्रों के अलगाव के लिए एक व्यवहार्य विधि का प्रदर्शन दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।

विधि के विकास में, सबसे बड़ी चुनौतियों थे, पहले, उचित आकार की एक बाँझ वस्तु की पहचान, और दूसरा, प्रक्रिया के रूप में बाँझ बनाए रखने कोशिका संस्कृति हूड के बाहर कई कदम शामिल. 30 ½ जी सुई सुझावों उपयोगी माप के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विच्छेदन उपकरणों साबित हुआ । बांझपन प्रयोग में जल्दी एक चुनौती थी, ज्यादातर शल्य सेट अप और murine फर को नियंत्रित करने से संबंधित ।

प्रक्रिया की सीमाएं गुर्दे ऊतक क्षेत्रों के तीन आयामी प्रकृति से संबंधित हैं । माइक्रोस्कोप के तहत एक दृश्य में, खंड के आयामों को लगभग सुई व्यास का आकार, ०.२६० mm प्रकट हो सकता है । हालांकि, Z-आयाम किसी stereoscope पर दृश्यमान नहीं है । microdissection हाथ से किया जाता है, जो खुद को एक और सीमा है । भविष्य में, रोबोट मानकीकरण आदर्श होगा । यदि 2 मिमी3 गुर्दे ऊतक के पिरामिडीय भाग विच्छेदन के दौरान सही अभिविन्यास में बनाए रखा गया था, बाहर बरकरार बिगडते अथाह नहीं होगा विदारक । अंत में, इन निर्माणों की तुलना जैव कृत्रिम अग्ंयाशय, जिसमें टाप कोशिकाओं कल्पना में एंबेडेड थे, एक प्रमुख मतभेदों को स्वीकार करना होगा20। गुर्दे कार्यात्मक और अग्ंयाशय और यकीनन अधिक जटिल से वास्तुकला अद्वितीय है । इसके अतिरिक्त, टाप कोशिकाओं को अग्ंयाशय के भीतर कार्यात्मक कोशिका के केवल एक उपप्रकार हैं, के रूप में कार्यात्मक कोशिकाओं के समूह के विरोध में इस पद्धति में गुर्दे क्षेत्रों के साथ पृथक । वास्तुकला के साथ और विशेष रूप से, गुर्दे और विशेष रूप से निस्पंदन के समारोह में इतनी बड़ी भूमिका निभा दिशात्मकता, निर्माण के भीतर क्षेत्रों के समान उंमुखीकरण की कमी इस पद्धति का एक अतिरिक्त कमजोरी है ।

चल रहे अनुसंधान गुर्दे खंड और गुर्दे का निर्माण कार्यक्षमता के आकलन के उद्देश्य से है, जो करने के लिए एल्ब्युमिन आगे बढ़ रहा है और अन्य गुर्दे कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए हद तक स्पष्ट करने के लिए. भविष्य पशु प्रयोगों गुर्दे के प्रत्यारोपण मूत्राशय की दीवार में निर्माण शामिल होगा । इस उच्च संवहनी शारीरिक संरचना में निर्माण embedding तेजी से सम्मिलन के रूप में अच्छी तरह से मूत्राशय में सीधे उत्सर्जन निस्पंदन के साथ, एक संग्रह प्रणाली के लिए की जरूरत निराकरण की अनुमति होगी । विचार है कि इन विट्रो में गुर्दे के ऊतकों की कार्यक्षमता अत्यंत सीमित है, vivo में परीक्षण महत्वपूर्ण है. केवल इन विट्रो परीक्षण वर्तमान में साहित्य में रिपोर्ट एल्ब्युमिन के आसपास केंद्रित कर रहे है और erythropoietin अभिव्यक्ति17,22। अपनी मूल संरचना में बरकरार गुर्दे के ऊतकों के इन रहने वाले क्षेत्रों आदिम endothelial नेटवर्क है, जो किसी भी विदेशी पर भरोसा नहीं है के साथ निर्माण में एंबेडेड सामग्री, कार्यात्मक, संगत गुर्दे ऊतक प्रतिस्थापन की ओर जाने में वादा शो .

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NIH संस्थागत Postdoctoral प्रशिक्षण अनुदान, NIH-एचएल-००७२६०

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-fenestrated Sterile Field Busse Hospital Disposables 696
Fenestrated Sterile Field Busse Hospital Disposables 697
Halsted Mosquito Forceps 5 Curved Miltex Mil-7-4 "Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth Fine Science Tools 11155-10 Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) Fine Science Tools 11152-10 Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09 Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% Purdue Products L.P. 67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") Fisher Healthcare 22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered Solution Corning 21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-Cl
Isoflurane, USP Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson 2254845
Nair Hair Remover Nair 22600-23307 Hair Removal Cream in text
200 Proof Ethanol Decon Laboratories 2705 Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture Dish Themo-Scientific 130181
Press'n Seal Glad 12587-70441 Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX16
Fiber Optic Illuminator Cole Parmer 41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck Cole Parmer EW-41720-60
Scalpel Handle #3 Miltex Mil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 Bard-Parker 371115
31 1/2 Gauge Needle ThermoFisher Scientific 14-826F Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine Serum Atlas Biologicals FS-0500-AD
Normal Human Dermal Fibroblasts Lonza CC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells Sciencell Research Laboratories 7200
Surgical Loupes (2.5x) Orascoptic (N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) Lonza CC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) Lonza CC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells ThermoFisher Scientific L3224
Anti-Cytokeratin-18 Antibody Abcam ab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 ThermoFisher Scientific A-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 ThermoFisher Scientific A-11010
Anti-Von Willebrand Factor Antibody Abcam ab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate Sigma Aldrich A9771-50MG
Hoescht 33342 BD Pharmingen 561908
Background Buster Innovex Biosciences NB306

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References

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इंजीनियरिंग अंक 133 Microdissection गुर्दे इंजीनियर के निर्माण गुर्दे का निर्माण पाड़ मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग प्राथमिक गुर्दे के ऊतकों
Microdissection प्राथमिक गुर्दे ऊतक क्षेत्रों और उपंयास पाड़ मुक्त निर्माण प्रौद्योगिकी के साथ शामिल होने के
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Arbra, C. A., Nadig, S. N., Dennis,… More

Arbra, C. A., Nadig, S. N., Dennis, S. G., Pattanaik, S., Bainbridge, H. A., Rhett, J. M., Fann, S. A., Atkinson, C., Yost, M. J. Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology. J. Vis. Exp. (133), e57358, doi:10.3791/57358 (2018).

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