Summary
Vävnadstekniska nedsatt konstruktioner ger en lösning för organbrist och skadliga effekter av dialys. Här beskriver vi ett protokoll till micro dissekera murina njurar för isolering av cortico-medullär segment. Dessa segment implanteras i byggnadsställning-fri cellulära konstruktioner, bildar nedsatt organoids.
Abstract
Njurtransplantation är nu en mainstream terapi för slutstadiet njursjukdom. Dock med cirka 96 000 personer på väntelista och endast en fjärdedel av dessa patienter som uppnådde transplantation, finns det ett trängande behov för alternativ för dem med misslyckas organ. För att minska de skadliga konsekvenserna av dialys tillsammans med de övergripande hälso-och sjukvårdskostnader som det ådrar sig, pågår aktiv utredning jakten på alternativa lösningar till organtransplantation. Implanterbara vävnadstekniska nedsatt cellulär konstruktioner är en sådan möjlig strategi till att ersätta förlorade nedsatt funktionalitet. Här är beskrivs för första gången, lokalt murina njurar för isolering av levande corticomedullary nedsatt segment. Dessa segment klarar snabb inkorporering inom byggnadsställning-fri endothelial-fibroblast konstruktioner som kan aktivera snabb anslutning med värd vaskulatur en gång implanteras. Vuxen mus njurarna uppbringades från levande donatorer, följt av stereoskop lokalt att få nedsatt segment 200-300 µm i diameter. Flera nedsatt konstruktioner var fabricerade med hjälp av primära nedsatt segment skördas från endast en njure. Denna metod visar ett förfarande som kunde rädda funktionella nedsatt vävnad från organ som annars skulle kasseras.
Introduction
Kronisk njursjukdom (CKD) är en av de nuvarande stora folkhälsan utmaningar världen över1. Prevalensen av CKD i Förenta staterna är över 14 procent av den totala befolkningen, med över 600 000 amerikaner lider av den allvarligaste formen, slutstadiet njursjukdom (ESRD)2. De nuvarande behandlingsalternativ som finns för dem med ESRD inkluderar dialys och njurtransplantation. Även om cirka 25.000 patienter genomgå njurtransplantation varje år, läggs ett betydande antal patienter årligen leder till en stor skillnad mellan de som väntar på en livräddande organ och de mottagande transplantation3. Förutom dess allvarliga negativa effekter på livslängd och livskvalitet är dialys associerade med en häpnadsväckande ekonomisk börda. Under 2014 Medicare betalda fordringar uppgick till över 30 miljarder dollar för ESRD patienter2. Med en begränsad orgel leverans och inga uppenbara stadigt i patienter som kräver dialys, forskningsinsatser som syftar till att identifiera alternativa lösningar till dialys och transplantation är någonsin viktiga. Även en relativt kort fördröjning i behov av dialys ökar patientens antalet kvalitetsjusterade levnadsår och produktiviteten väsentligt samtidigt skjuta upp kostnader relaterade till dialys4,5,6.
Lösningar för funktionell vävnad förlust, sånt i ESRD, studeras för närvarande i vävnadsteknik och regenerativ medicin laboratorier, med varierande strategier alltifrån byggnadsställning-baserade organoid fabrication till hela orgel engineering använder cell-lösa orgel strukturer för cellulära implantation7,8,9,10,11. Går igenom komplexa nedsatt strukturer från marginell eller kasserad njurarna har endast delvis utretts. I själva verket ignoreras nästan 20% av njurar anskaffas för transplantation för olika skäl12,13. Den funktionella nedsatt vävnaden från dessa förmodade grafter kan utnyttjas och införlivas med en eller flera vävnadstekniska konstruktioner. Tidigare studier har visat möjligheten att arbeta med dessa kasserade organ, utnyttja njurar för extra-cellulära matrisen för tissue engineering ändamål14,15. Dock har några används primära nephronal vävnad från friska njurar för vävnadsteknik ändamål16,17,18.
En metod som tidigare beskrivs av Kim et al. innebär isolering av nedsatt ”segment” från frisk råtta njurar, som då var seedad på polyglycolic syra (PGA) ställningar för konstruktion tillverkning16. Men lite information ges angående exakta dissektion metodik och segment erhölls från en kombination av fina malning och filtrering. Vi beskriver en ändring av detta protokoll, som Likaså producerar diskret nedsatt segment med intakt nephronal arkitektur, utan istället förlitar sig på lokalt tekniker. Nephrectomies utförs på levande vuxna möss, varefter njurarna överförs till mikroskopet dissektion där nedsatt kapseln avlägsnas och vävnaden är ytterligare dissekeras. Småkalibriga 30½ G nålar används som skärande instrument och även som vägleder medhjälp i dissektion, som nålen diameter är lika med målet diameter nedsatt segment. Segmenten isolerade, i detta fall murina, nedsatt bibehålla lönsamheten i kultur och införliva med byggnadsställning-fri endothelial-fibroblast cellulära konstruktioner19. Dessa konstruktioner har tidigare använts för att konstruera andra organ, inklusive en bio-konstgjord bukspottkörtel20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur kirurgiska förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av den institutionella djur vård och använda kommittén (IACUC) på Medical University of South Carolina innan alla djur operationer eller användning av någon djurvävnader.
1. murina nefrektomi
- Don kirurgisk mask och bouffant keps för att minimera risken för kontaminering. Upprätthålla sterilitet under uppbyggnaden av det kirurgiska området.
- Placera icke-fenestrated operationsdukar på operationsbordet.
- Öppna förpackningen av Ånghärdad instrument på de sterila draperier. De instrument som krävs för nefrektomi inkluderar 3 små Peanger, fin pincett med tänder, fina tången utan tänder, och raka iris sax.
- Placera en annan icke-fenestrated kirurgiska draperi i mitten av operationsbordet.
- Förbereda 5 mL av Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS) med kalcium och magnesium, kompletteras med 1% penicillin/streptomycin i en 15 mL sterilt koniska rör. Placera denna lösning på isen bredvid operationsbordet.
- Skaffa en 8-12 vecka gammal C57BL/6 mus (manlig eller kvinnlig) från djurstallar komplexet.
- Placera muspekaren inuti en kammare för induktion av anestesi och framkalla med 3,5% inhaleras isofluran. Placera en Kona på musen, använder 2% isofluran för underhåll anestesi.
- Monitor för tillräcklig djup anestesi regelbundet under hela ingreppet genom att bedöma för pedal reflex (fast tå nypa).
- Ta bort alla håret från den ventrala torso använda hårborttagningskräm. Skölj området med destillerat vatten för att säkerställa allt hår har tagits bort från buken.
- Flytta musen till sterila operationsbordet i ryggläge under topp icke-fenestrated drapera. Klipp ut en 2 x 2 cm2 fenestration i drapera bara överliggande mus buken.
- Tillämpa povidonjod följt av 70% etanol till buken med hjälp av steril gasväv eller bomull bollar.
- Med fin pincett med tänder och iris saxar, göra en 3-4 cm vertikal bukhuden snitt parallellt med mittlinjen, 0,5 cm till vänster om mittlinjen
Obs: Om försöker ta bort den högra njuren, kommer detta vara ett snitt 0,5 cm till höger om mittlinjen.- Greppa bukhinnan med fina tången utan tänder och incisionsfilm med iris sax ange bukhålan. Gälla de överlägsna och underlägsna laterala kanterna av hud och bukhinnan att placera spänning sidled och förbättra exponering Peanger.
- Skifta tarminnehållet försiktigt på höger sida av buken att exponera den vänstra njuren. Placera försiktigt dragkraft på njuren att lyfta det ur buken.
- Placera en hemostat över hilum för den vänstra njuren. Använd iris sax till transekt de urinledaren och nedsatt fartyg.
- Placera den vänstra njuren i 1% Penicillin/Streptomycin DPBS lösning på is.
- Överföra röret som innehåller njuren till sterila vävnadsodling huven. Överföra njuren från 15 mL koniska röret till en 60 mm petriskål (figur 1). Skölj två gånger med 5 mL DPBS med kalcium och magnesium. Hålla njurarna upphängd i 5 mL DPBS i 60 mm skålen.
- Förbereda en ytterligare 60 mm petriskål med 5 mL DPBS användas under protokollet lokalt.
- Avliva musen av torakotomi och exsanguination efter upphandling av njure, enligt ett godkänt IACUC djur protokoll.
2. murina njure lokalt nedsatt segmentet isolering
- Fortsätta med steril teknik för denna del av protokollet, inklusive sterila handskar, kirurgisk mask, och bouffant att minimera risken för kontaminering.
- Plats sterila draperier på stereo Mikroskop plattform samt vad gäller områden som just lämnat och rätten av mikroskopet som har ett sterilt fält för instrument. Självhäftande plastfolie på mikroskopet fokus rattar och spraya med 70% etanol. Slå på dubbla svanhals lampan att lysa upp scenen.
- Öppna steriliserade instrument (fina tången utan skalpell handtag, två raka Peanger, #15 skalpell blade, tänder, två 30½ spårvidd hollow-bore nålar) på sterila draperier. Plats #15 blad på skalpell hantera nu och fäst en hemostat varje nål adapter/hubb för att skapa nål dissektion instrument för senare användning, som visas i figur 1.
- Flytta de 60 mm Petriskålarna, en som innehåller njure i DPBS och den andra bara DPBS, från vävnadsodling huven till området mikroskopet.
- Placera 60 mm petriskål under målet och ta av locket för att exponera njuren. Lämna DPBS-innehållande skålen till sida på det sterila fältet för senare användning.
- Flytta skålen så att endast den främre eller bakre ytan av njuren är i vyn (dvs.stora platta ansiktet njure, med andra ansiktet att röra botten av skålen). Zooma till 3.2-4 X för denna del av förfarandet. Använder den icke-dominanta handen, Använd fin pincett utan tänder att genomborra och fästa njuren mot skålen nära njuren underlägsna och överlägsna poler.
- Hålla den icke-dominanta handen för att fästa njuren. Med dominerande hand, ta bladet #15 bort den genomskinliga fibrösa kapsulära lagret från den exponerade ytan. Raka den mest ytliga 0,5 mm från den exponerade ytan i njuren att avlägsna återstoden av kapseln.
- Använd #15 bladet för att dissekera en inverterad pyramid av vävnad från det decapsulated området, cirka 2 mm3 i storlek. Hämta 60 mm skålen som innehåller endast DPBS och placera pyramiden av vävnad i rena skålen. Kassera resten av njuren.
- Minska förstoringen till 1,5-2,0 X för resten av dissektion. Använda två hemostat-nål instrument som skärande instrument, skiva vävnad fragmentet i successivt mindre bitar tills de vävnad segmenten är mindre än eller lika med diametern av nålen tips. En nedsatt vävnad 2 mm3 i storlek kommer att producera mer än 50 segment en gång helt dissekerade.
- Flytta 60 mm skålen med nedsatt segment till vävnadsodling huven. Ta bort DPBS med 1000 µL pipett. Tillsätt 5 mL DMEM, kompletterad med 10% fetalt bovint Serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin.
- Kultur i 3 dagar vid 37 ° C i en inkubator eller implantat i cellulära konstruktioner omedelbart.
3. nedsatt segmentet cellulära konstruera Fabrication
- Kultur normala mänskliga dermal fibroblaster (NHDF) och mänskligt fett mikrovaskulära endotelceller (HAMEC) i flera veckor att få 7,2 x 105 fibroblaster och 1,8 x 105 endothelial celler per konstruktion som önskas. I vävnadsodling huven, utsäde lämplig förhållandet av fibroblaster till endotelceller (4:1) i stavformade brunnar i agaros formar att bilda byggnadsställning-fri pre vaskulära endotel-fibroblast konstruktioner (SPEC) som tidigare beskrivs av Czajka et al 19.
- Skaffa en steriliserad hemostat, 30½ G nål och en steril spatel med platta änden.
- Ta bort majoriteten av media från 60 mm plattan som innehåller nedsatt segment, vara noga med att inte aspirera och ta bort segmenten nedsatt.
- Utrusta kirurgiska luppar att visualisera implantation av segmenten.
- Skrapa i slutet av spateln försiktigt längs botten av 60 mm skålen du få 10-15 segment, spridas jämnt längs den yttersta spetsen av spateln. Placera spetsen på spateln så nära som möjligt till läppen av brunnen där SPEC var seedade.
- Använd en hemostat-30½ G nål instrument i andra hand för att flytta varje enskilt segment från spatel spets till kanten av brunnen. Flytta försiktigt varje segment in i den väl med kanylspetsen tills något nedsänkt i tidigare seedade cellulära avstängning.
- Kultur nedsatt segment-SPEC i 2:1:1-förhållande av kvinnlig Könsstympning-2/EGM-2/DMEM medium (2,5 mL volym totalt). Ändra kultur media varje 24 h i 3 dagar. Ta bort konstruktioner från formarna på 72 h och fixa eller flash-frysa för bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs producerar cirka 50 nedsatt segment per pyramidal 2 mm3 avsnitt av nedsatt vävnad. Nedsatt segment som har bearbetats och avbildade har tubulär och glomerulär komponenter i olika proportioner (se figur 2). Segmenten intakt utsattes för ett test för att bestämma lönsamheten för olika segment en gång varje 24 h i tre dagar. Grön fluorescerande calcein-AM är närvarande med intracellulära esterasaktivitet, vägledande av levande celler. Röd fluorescerande etidiumbromid homodimer-1 ses med förlust av plasmamembranet integritet. Även om dessa segment är intakt, tredimensionella strukturer, betydande assay penetration är märkbar med konfokalmikroskopi (se figur 3).
Segment präglades ytterligare storlek enhetlighet med samma cell livskraft analys. Med glasskivor med fördjupningar, placerades segment under lock snedsteg utan mekanisk kraft placeras på någon dimension segment. Gratis flytande, segmenten var avbildad 30 minuter efter placering i cell livskraft/toxicitet analys. En z-projektion med 10 µm stegstorlek togs genom hela segmentet. Den största 'X' och 'Y' dimensioner var erhållits och registreras. Dimensionen 'Z' erhölls genom att beräkna avståndet från först till den sista synliga fluorophore. Segmenten är ungefär kubik, en enkel kubisk volymmätning erhölls och ritade att jämföra 10 slumpmässigt valda segment från ett lokalt experiment. Rikta volym (300 µm)3 = 0,027 mm3 visas med en röd markör på histogrammet(figur 4). Representativa 'X' och 'Y' mätningar visas i figur 4B. Det finns extremvärden, finns det många segment nära målvolymen. Upprepa experiment har visat konsekventa resultat (n = 20). De råa mätningar (visas inte här) visar att i de allra flesta av segment, det finns minst en dimension mäta 200-300 µm. Detta har viktiga konsekvenser för diffusion begränsningar.
Nedsatt segmenten är inbäddade i byggnadsställning-fri endothelial-fibroblast konstruktioner och odlade i 3 dagar. Segmenten nedsatt införliva med cellulära konstruktioner att bilda intakt strukturer av dag 3 (se figur 5A). Konstruktioner upprätthålla deras pre vaskulär endotelial nätverk, visas av märkning med von Willebrands faktor (figur 5E). Det verkar dock inte att nätverket invaderar det renala cellulära materialet. Nedsatt epitelceller är märkta med Cytokeratin-18 (figur 5B, grön). Dessa konstruktioner inkuberades med FITC-märkt albumin (figur 5C, grå) för att testa i vitro nedsatt funktionalitet. Medan det finns kvarstående finns albumin från segmenten av inbäddade nedsatt vävnad, finns det ”hot spots” i området av renala tubulära epitelceller, de kända att ta upp albumin som korsar intra-luminally. Detta är tänkt att representera albumin återupptaget i den nedsatt segment cellulära konstruktion.
Figur 1 : Representant fotografier från nefrektomi och nedsatt segmentera lokalt. En murin njure är bort, sköljas, placeras i en 60 mm maträtt och flyttade till stereoskop Mikroskop scenen. Nålens spets diameter används för att vägleda dissektion. Peanger bifogas för att nål tips för dissektion instrument. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Microdissected nedsatt segmentet. Microdissected nedsatt segmenten innehåller varierande proportioner av glomeruli (nedre vänstra hörnet, basofila struktur) och tubuli (resten av bilden) i deras infödda arrangemang. 10 X bild, skalstapeln som anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Nedsatt segmentet livskraft. Microdissected nedsatt segmenten innehåller delar av levande och döda vävnaden. Huvudsakligen, segmenten är levande, och så förbli i kulturen på 72 h. Observera att olika segment användes för olika tidpunkter, som lönsamhet analysen själv är giftigt för celler. 10 X bilder, skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Nedsatt segmentet volym enhetlighet. (A) Segment Kubikvolymen i mm3 från en dissektion experiment (n = 10). Enskilda segment representeras av blå punkter, jämfört med röda målpunkt (target volume 0.027 mm3). (B) representant X och Y dimension mätningar från levande döda-analysen, 10 X image. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Vävnadstekniska byggnadsställning-gratis nedsatt segmentet konstruktion. (A) sammanfogad bild visar införlivande av nedsatt segment i SPEC. (B) Cytokeratin-18-positiva renala tubulära epitelceller (grön). (C) FITC-märkt albumin. (D) Hoescht fläcken för kärnor. (E) von Willebrand faktorn (vWF) positivitet belysa prevascular nätverket. 10 X bilder, skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna att ingenjör levande nedsatt vävnad konstruktioner varierar kraftigt när det gäller både typ av celler och biomaterial utnyttjas, och i många fall är inaktuella eller inte välkarakteriserad i litteratur7. Medan många använder stamceller metoder eller går igenom enskilda komponenter nedsatt arkitekturen i isolering, utsikterna att artificiellt att återskapa hela organ med över 26 olika differentierade celltyper från cellulära suspensioner är överväldigande för att överväga21. Detta är sannolikt varför andra har flyttat till metoder med hjälp av segment av nedsatt vävnad i vävnad tekniska tillämpningar. Som beskrivits ovan, har tidigare arbete gjorts i isolering av nedsatt segment för seedning på PGA ställningar16. Men den metod som används för att beskriva isolering av segment beskrevs i detalj och segmenten odlades inte under någon tid att bedöma för livskraft. Den metod som beskrivs här, tillsammans med användning av cellulära lönsamhet analysen, visar att åtminstone delar av segmenten nedsatt behåller livskraft till 72-h varumärket, som inte har beskrivits innan. Metoden har också fördelen att producera segment med ganska förutsägbar dimensioner. Dessa metoder ger dessutom en kliniskt översättningsbara strategi att utöka misslyckas njurfunktion, främst visar en genomförbar metod för isolering av segment av primära nedsatt vävnad från organ som annars skulle kasseras.
Utveckla metoden, var, de största utmaningarna först identifiera en steril objekt i lämplig storlek, dels att upprätthålla sterilitet som förfarandet involverade många steg utanför cellen kultur huven. 30½ G nål tips visat sig vara användbar mätning samt dissektion enheter. Sterilitet var en utmaning tidigt i experiment, främst relaterade till kirurgiska set-up och kontrollerande murina päls.
Begränsningar av förfarandet är relaterade till nedsatt vävnad segmenten tredimensionella karaktär. I en vy under mikroskopet verkar måtten på segmentet vara ungefär storleken på nålen diameter, 0.260 mm. Z-dimensionen är dock inte synlig på ett stereoskop. Lokalt görs för hand, vilket i sig är en annan begränsning. I framtiden, skulle robotic standardisering vara perfekt. Om den 2 mm3 pyramidal del av nedsatt vävnad underhölls i rätt riktning under dissektion, skulle dissekera sig intakt nephrons inte vara outgrundliga. Slutligen, jämföra dessa konstruktioner till bio-konstgjorda bukspottkörteln, i vilka islet celler var inbäddade i SPEC, man måste erkänna viktiga skillnader20. Njuren är funktionellt och arkitektoniskt unika från bukspottkörteln och utan tvekan mer komplexa. Dessutom är cellöar endast en subtyp av funktionella celler i bukspottkörteln, i motsats till konglomeratet av funktionella celler isolerade med nedsatt segment i denna metod. Med arkitektur och specifikt riktverkan spelar en stor roll i funktion i njurar och särskilt filtrering, är bristen på enhetliga orientering av segmenten inom bygga en ytterligare svaghet av denna metod.
Pågående forskning syftar bedömning av nedsatt segment och nedsatt konstruera funktionalitet, att klargöra i vilken utsträckning som albumin upptaget sker och utvärdera andra nedsatt funktioner. Framtida djurförsök skulle innebära implantation av nedsatt konstruktioner i blåsväggen. Bädda in konstruktionen i denna mycket vaskulära kroppslig struktur skulle tillåta snabb anastomos samt undanröja behovet av ett insamlingssystem, med filtratet utsöndra direkt in i urinblåsan. Med tanke på att in vitro- funktionalitet i njur vävnader är extremt begränsad, är i vivo tester avgörande. Endast in vitro- testerna för närvarande rapporterats i litteraturen är centrerade kring albumin upptag och erytropoietin uttryck17,22. Dessa levande segment av intakt nedsatt vävnad i dess infödda arkitektur inbäddad i konstruktioner med primitiva endothelial nätverk, som inte lita på någon utländsk biomaterial, visar löfte i riktning mot funktionella, biokompatibla nedsatt vävnad ersättare .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
NIH institutionella postdoktorala utbildning Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
- Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
- 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).
- de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
- Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
- Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
- Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).
- Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
- Langer, R., Vacanti, J.
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
- Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
- Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
- Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
- Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119 (2014).
- Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
- Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
- Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
- Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
- Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680 (2016).
- Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
- Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).
