Summary
Her beskriver vi ved hjelp av spinning disk AC confocal mikroskopi bilde enkelt phagocytic hendelser av musen bosatt peritoneal makrofager. Protokollene kan utvides til andre phagocytic celler.
Abstract
Fagocytose spiller en nøkkelrolle i vert forsvar og vev utvikling og vedlikehold, og innebærer rask, reseptor-mediert rearrangements i utgangen cytoskeleton å fange, innhylle og sluke store partikler. Selv om phagocytic reseptorer og nedstrøms signalveier effektor, som Rho GTPases, har blitt identifisert, dynamisk cellen cytoskjelett remodeling av bestemte reseptor-mediert phagocytic hendelser fortsatt uklart. Fire tiår siden, to forskjellige mekanismer for fagocytose, eksemplifisert ved Fcγ reseptor (FcγR)- og supplement reseptor (CR) - mediert fagocytose, ble identifisert med skanning elektronmikroskop. Binding av immunglobulin G (IgG)-opsonized partikler til FcγRs utløser protrusion av tynne membranen utvidelser, som først danner såkalte phagocytic kopp rundt partikkel før det blir helt lukket og trukket inn i cellen. Derimot synes supplement opsonized partikler å synke i phagocyte etter binding til utfylle reseptorer. Disse to modusene for fagocytose, phagocytic cup formasjon og synker, har blitt godt etablert i litteraturen. Men forskjellene mellom de to modusene har blitt mer utydelige av rapporter som supplement reseptor-mediert fagocytose kan indusere ulike membran utstikkende deler. Med anvendeligheten av høy oppløsning imaging teknikker, fagocytose analyser er nødvendig som tillater sanntids 3D (tredimensjonal) visualisering av hvordan bestemte phagocytic reseptorer megle opptaket av enkelte partiklene. Mer vanlig tilnærminger for å studere fagocytose, som end-point analyser, gå glipp av muligheten til å forstå hva som skjer på grensesnittet av partikler og phagocytes. Her beskriver vi phagocytic analyser, bruker time-lapse spinning disk AC confocal mikroskopi, at 3D-bildebehandling enkelt phagocytic hendelser. I tillegg beskriver vi analyser utvetydig bilde Fcγ reseptor - eller supplement reseptor-mediert fagocytose.
Introduction
Tjue år før Metchnikoffs observasjon av phagocytic mesenchyme celler i sjøstjerner larver, i 1882, og utvikling av sin teori om fagocytose1, beskrevet Ernest Haeckel i 1862, engulfment uløselig fargestoff partikler av blod cellene i Thetis fimbris (Tethys fimbria), en art av ROV havet slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Han beskrevet uttrykkelig membran utstikkende deler innhyllende partikler, som senere ble tatt i cytoplasma og rundt cellekjernen. Mer enn 100 år senere, foreslo en banebrytende studie av Kaplan at det var minst to morphologically forskjellige mekanismer fagocytose2. Kaplan viste ved skanning elektronmikroskop at musen peritoneal makrofager inntatt en IgG-opsonized sauer røde blodlegemer bruker tynne membranen utvidelser som nådde opp og tett innhyllet partikkelen, først gir opphav til en kopp som struktur. Phagocytic cup dannelsen nødvendig begrepsordbok polymerisasjon siden det ble avskaffet av celle-permeable fungal gift cytochalasin B, kjent for å blokkere begrepsordbok dynamics3. Derimot syntes sauer røde blodceller opsonized med supplement å synke direkte i macrophage uten generering av membran utvidelser, selv i enkelte bilder, membran ruffles kan sees i den umiddelbare nærheten av synkende partikler. I motsetning til phagocytic cup formasjon var supplement reseptor-mediert synker i insenstive cytochalasin B behandling2. I eksperimentene beskrevet av Kaplan, supplement opsonization ble utført av rugende immunglobulin M (IgM) merket sauer røde blod celler med serum fra supplement C5-mangelfull mus, som omgår hemolyse av komplement C5-avhengige terminalen utfylle komplekse.
De to modiene av fagocytose, phagocytic cup formasjon og synker, identifisert av Kaplan har blitt etablert mening i feltet4,5,6,7,8,9 . Men de ultrahøy oppløsning brukt i den opprinnelige studien av Kaplan2, samt en lignende studie av Munthe-Kaas et al. 10, bare gi øyeblikksbilder av phagocytic hendelser. I en fersk vurdering, Rougerie et al. 11 understreket at morfologiske forskjellene mellom FcγR - og CR-mediert fagocytose gjenstår å bli avklart, og dessuten membran ruffles er observert under supplement reseptor-mediert partikkel opptak2. Live-celle imaging enkelt phagocytic hendelser som spenner fra partikkel fange til internalisering, kombinert med genetisk endret musen modeller, kan forbedre vår forståelse av hvordan phagocytes fange og ingest partikler. En tilnærming kunne bruke rask atomic force mikroskopi (AFM) som gir ultrahøy oppløsning (10-20 nm) topografiske avbilding av levende celler. Nylig er en rask AFM systemet12 utviklet, som egner seg for tenkelig celle overflater raskt med lite støy. Denne teknikken har fordelen at høy oppløsning, topografiske og mekanisk parametere av levende celler kan måles i korte intervaller (sekunder), i motsetning til skanning elektronmikroskop, som nødvendiggjør fiksering og kritisk punkt tørking av celler. En annen tilnærming er time-lapse 3D AC confocal mikroskopi, som er allment tilgjengelig, selv om Phototoksisitet og bleking er begrensende faktorer under opptak. Denne tilnærmingen er svært allsidig og muliggjør optisk snitting med høy romlig oppløsning ekstraordinære fleksibel i merking med en svimlende rekke fluorescerende sonder, inkludert genetisk kodet fluorescerende proteiner. Her beskriver vi fagocytose analyser med time-lapse spinning disk AC confocal mikroskopi at høy spatiotemporal oppløsning på bestemte reseptor-mediert phagocytic hendelser.
Protocol
Protokollene følger retningslinjene for våre lokale menneskelige forskning etikk og dyr omsorg retningslinjene.
1. isolering av bosatt musen Peritoneal makrofager
- Ofre musen (3-4 måneder av alderen (begge kjønn); f.eks C57BL/6 belastning) med en overdose av flyktige bedøvende isoflurane (> 5% i luft) eller karbondioksid13, etterfulgt av cervical forvridning. Induksjon av anestesi kan vurderes lett tap av rettende refleks14og tap av pote uttak refleks.
- Etter rengjøring magen av musen med 80% etanol i vann, gjør en midtlinjen huden snitt og utsette underliggende bukveggen.
- Plass et 24-G plast kateter inn i peritonium og nasal lavage hulrommet med 2 x 4.5 mL iskald Hanks bufrede salt løsning (HBSS), uten Ca2 + og Mg2 +via en 5 mL plastsprøyte. Mens sprøytebruk, la ca 0,5 mL gjenværende HBSS (5-4.5 mL (injisert) = 0,5 mL) i sprøyten i tilfelle vev er sugd inn i spissen av kateter og må bli utvist. Overføre aspirerede suspensjon i en 14 mL polypropylen runde bunn rør og sentrifuge på 300 x g for 6.5 min ved romtemperatur.
Merk: Tuppen av plast kateter er sløv, som sammenlignet med en nål, reduserer skader på mage innholdet. Vanligvis følgende milde underlivs massasje, 8 mL peritoneal celle suspensjon kan hentes fra bukhulen. - Forkaste nedbryting og resuspend peritoneal cellene i 1 mL bikarbonat-fri RPMI 1640 medium som inneholder 20 mM Hepes, 10% inaktivert fosterets bovin serum og antibiotika, som penicillin (100 enheter/mL) og streptomycin (100 µg/mL), utarbeidet av fortynne 100 x penicillin/streptomycin 1: 100. Dette gir vanligvis en konsentrasjon av rundt 6 x 106 celler/mL.
Merk: Ca 30% av isolerte peritoneal celler er makrofager, mens andre (mindre) cellene er lymfocytter, hovedsakelig B-celler.
2. seeding Peritoneal celler i kanalen lysbilder
-
Etter pipettering celle suspensjon opp og ned for å redusere klumper, Pipetter 100 µL suspensjon i forhåndsutfylte kanalen (volum, 100 µL) av et fibronectin-belagt kanal lysbilde (en 100 µL kanal har dimensjonene (lengde x bredde x høyde): 50 x 5 mm 0.4 mm).
- Prefill kammeret ved å legge 1 mL serum-supplert RPMI 1640 (Hepes) medium til en av de to reservoarene kanal lysbildet, vippe lysbildet og deretter aspirating mediet nedstrøms reservoaret (figur 1).
- Fjerne uønskede luftbobler, eller lange strimler av luft, i kanalen ved å legge til 1-2 mL medium til en av to reservoarene, tett søker en reservoaret cap pumpe ut luften gjennom rytmisk tommelen press på hetten og, der det er nødvendig, vippe lysbildet. Etter utviste luft, vipp lysbildet med uncapped reservoaret (og som inneholder mediet) nedover før fjerne hetten å unngå luften blir sugd inn kanalen.
- Prefill kammeret ved å legge 1 mL serum-supplert RPMI 1640 (Hepes) medium til en av de to reservoarene kanal lysbildet, vippe lysbildet og deretter aspirating mediet nedstrøms reservoaret (figur 1).
- Inkuber kanal lysbildet plantet med celler, i et fuktig kammer for 2t på 37 ° C i fravær av CO2 (CO2 er ikke nødvendig siden den HCO3-/CO2 buffer system er erstattet av Hepes). Kanal lysbildene kan være plassert på et stativ, som har åtte sider. Vanligvis er 6 – 8 lysbilder forberedt fra én mus, men opp til 10 eller flere er mulig.
-
Fjern brettet og utveksle RPMI 1640 (Hepes) mediet i hvert lysbilde for RPMI 1640 medium med bikarbonat, supplert med 10% fosterets bovin serum, samt penicillin/streptomycin.
- Tilt lysbildet og Sug opp medium først fra lavere reservoaret og deretter fra øvre reservoaret. Deretter legge 1 mL av det nye mediet til en av reservoarene, tilt nedstrøms reservoaret lysbildet og leveringstanken mediet etter at det har strømmet gjennom kanalen.
- Etter denne vask (middels exchange) trinn, fylle kanal lysbildet ved å legge 1 mL medium til en av reservoarene.
Merk: Vask skritt benytter kanal lysbilder er svært enkel og effektiv løsning exchange og fjerne ikke-tilhenger celler. Merk at RPMI 1640 (bikarbonat) medium er vanligvis pre inkubert med 5% CO2 over natten slik termisk og pH balanse.
- Inkuber cellene overnatting på 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2. Utføre eksperimenter på dagen.
3. isolering av menneskelig røde blodlegemer
- På dag 2 (andre dag av eksperimenter; etter overnatting inkubasjonstiden for de isolerte peritoneal makrofagene), samle 1-2 mL perifere venøst blod fra en frisk donor, i et heparinized rør. Overføre 1 mL til en rund bunn 2.0 mL (polypropylen) microcentrifuge tube, sentrifuger 300 x g i 5 minutter ved 18 ° C (empirisk innstilling), og fjerne nedbryting (plasma og buffy pels).
- Forsiktig Sug opp 100 µL av de sedimented røde blodlegemene og bland dette volumet 1:1 med endrede RPMI 1640 (Hepes) medium (beskrevet nedenfor) i en rund bunn 2.0 mL microcentrifuge tube. Etiketten røret "1:1".
Merk: RPMI 1640 (Hepes) mediet brukes på dag 2 (for analyser) etter isolere celler inneholder, i tillegg til 10% inaktivert fosterets bovin serum, penicillin (100 enheter/mL), streptomycin (100 µg/mL) og 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glysin (for å redusere Phototoksisitet). Heretter, er dette mediet referert til som "modifisert" RPMI 1640 (Hepes)-medium. - Pipetter 4 µL av 1:1 utvannet røde blodlegemer suspensjon i 2 mL endret RPMI 1640 (Hepes) medium, pre-pipetted inn i et 2.0 mL microcentrifuge rør (gjenta dette trinnet klargjør dvs 2 rør). Label hver rør "4:2000". Plass "1:1" og "4:2000" rørene på isen.
4. merking av Macrophage Plasma membranen
- Fjern frø kanalen lysbildene fra CO2 inkubator og utveksle RPMI 1640 (bikarbonat) mediet i hvert lysbilde for mellomstore og modifisert RPMI 1640 (Hepes). Deretter plasser cellene i et fuktig kammer på 37 ° C i fravær av CO2.
Merk: Etter overnatting inkubasjon og vask, de fleste av lymfocytter er fjernet fra kanalen. Fleste av de gjenværende tilhenger cellene er makrofager, som kan identifiseres enten morphologically eller ved immunofluorescence flekker med anti-F4/80 antistoff. Rundt er 95% av musen bosatt peritoneal makrofager F4/80 positiv. - Fortynn fluorescently grønne merket anti-musen F4/80 antistoff (lagret på 4 ° C) 1:40 modifisert RPMI 1640 (Hepes)-medium. Ta et lysbilde, vippe den og Pipetter (dråpe for dråpe) 100 µL av antistoff blandingen inn i åpningen av 100 µL kanalen lysbildet (se figur 1). Sug opp medium som flyter i nedstrøms reservoaret. Inkuber celler for 20 min på 37 ° C (fuktet miljø, uten CO2). Under inkubasjonstiden, kan du merke de menneskelige røde blodlegemene (se seksjon 5).
Merk: Som antydet ovenfor, CO2 er ikke nødvendig siden den HCO3-/CO2 buffer system er erstattet av Hepes. - Etter 20 min incubation tid (som menneskelige røde blod celler er farget og opsonized), vask lysbildet ved å legge til 1 mL endret RPMI 1640 (Hepes) medium til reservoarene og aspirating mediet etter at det har strømmet gjennom kanalen, tilrettelagt av vippe lysbildet. Legg til 1 mL medium for kortsiktige lagring eller gå videre til et eksperiment (dvs. pipettering i partikler (opsonized røde blodlegemer) og tenkelig fagocytose av time-lapse spinning disk AC confocal mikroskopi).
5. merking Plasma membranen av menneskelig røde blodlegemer
- Starte merking av menneskelig røde blod celler umiddelbart etter rugende et lysbilde makrofager med grønne fluorescently merket anti-F4/80 antistoff (etter inndelingen 4.2). Etter forsiktig blanding, tar 400 µL fra en av "4:2000" rørene (se Seksjon 3.3) og kvitte deg det inn i et (runde nederst) 2.0 mL microcentrifuge rør. Gi tid for suspensjon å varme opp rundt 37 ° C (se avsnitt nedenfor). Legge til 0,4 µL oransje/fluorescerende plasma membran flekk (dele lagret på 20 ° C), bland og ruge ved 37 ° C i 5 minutter.
Merk: En oppvarmet aluminium blokk, plassert inne laminær strømning panseret, er nyttig for å minimere varmetapet klargjøring lysbilder. Rør kan plasseres i bore brønner oppvarming blokken og en separat, eller integrert, oppvarmet aluminium plate kan tjene som et arbeidsområde. - Etter 5 min incubation periode, forberede første vask trinn ved å legge til 1600 µL endret RPMI 1640 (Hepes) medium (fylle 2.0 mL microcentrifuge tube).
- Sentrifuge røret på 300 x g i 5 minutter ved 18 ° C (empirisk innstilling). Kompakt røde pellets skal vises på veggen (dvs. midtstilt) på bunnen av røret. Rotere røret slik at pellet er vendt oppover, og fjern forsiktig alle nedbryting suksessivt (i to trinn) ved hjelp av en 1-1,5 mL pipette tips.
- Etter aspirating nedbryting, Legg 2000 µL endret RPMI 1640 (Hepes) middels, mix (å resuspend cellene), og gjenta de ovenfor sentrifugering og nedbryting aspirasjon.
- Resuspend pellets (i plasma membranen farget og 2 x vasket røde blodlegemer) med 400 µL av modifisert RPMI 1640 (Hepes)-medium. Etiketten røret PMS (forkortelse for plasma membranen flekken).
Merk: Alternativt succinimidyl ester av en pH-sensitive rhodamine derivat, som blir mer sterkt fluorescerende på surt pH, kan brukes til å merke menneskelige røde blodlegemer. I dette tilfellet fungerer fluorescens intensiteten i tillegg som et mål på phagosome modning etter partikler er internalisert.
6. opsonization (merking) av menneskelig røde blod celler med musen immunglobulin G (IgG)
- Legge 1 µL mus (IgG2b) monoklonale (klone HIR2) anti-menneskelige CD235a (1 mg/mL) antistoff (lagret på 20 ° C) til røret merket PMS (se avsnitt 5.2-5.5), som inneholder plasma membranen farget menneskelige røde blodlegemer suspendert i 400 µL medium. CD235a (også kjent som glycophorin A) er en erythroid slektslinje kundespesifikk membran sialoglycoprotein.
-
Inkuber ved 37 ° C i 8 min. Merk at opsonization av menneskelig røde blodlegemer med IgG årsaker agglutinerende (celle clumping). Selv agglutinerende kan fungere som en visuell indikator på opsonization, er det ønskelig for avbilding av enkelt phagocytic effekter. Å omgå agglutinerende, gjentatte ganger bland celle suspensjon (hver 1 min) bruker, for eksempel en variabel 20 til 200 µL volum pipette satt til 200 µL.
- Mot slutten av 8 min inkubasjonstiden, hvis ønsket, vask macrophage lysbildet inkubert med grønne fluorescently merket anti-F4/80 antistoff, med 1 mL endret RPMI 1640 (Hepes) medium. Kontroller at begge reservoarer kanal lysbildet er gratis medium etter vask trinnene.
7. imaging fagocytose av Plasma membranen farget og IgG-belagt menneskelige røde blodlegemer
- Pipetter 100 µL suspensjon som inneholder plasma membran-farget og IgG-opsonized menneskelige røde blodlegemer i kanalen på et lysbilde som inneholder makrofager merket med grønne fluorescerende anti-F4 etter den 8 min inkubering med anti-CD235a antistoff (Seksjon 6.2), / 80 antistoff (trinn 4). Dermed røde fluorescerende, IgG-opsonized menneskelige røde blod celler, legges til grønne fluorescerende phagocytes (makrofager).
- Så snart som menneskelig røde blod celler er lagt, montere kanal lysbildet på spinning disk AC confocal mikroskop (med scenen inkubator satt til 37 ° C) for imaging, for eksempel via en 60 X / 1.49 oljeneddyp linsen. Starte imaging så snart som mulig, siden partikler begynner å slå seg ned innenfor 1 min.
Merk: Med fluorescerende perler med en diameter på 100 nm, vi målt, ved analyse av punkt spredning funksjoner, XY vedtak av x = 0.22 µm, y = 0,23 µm (488 nm laser) og x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm laser). Men for å redusere photobleaching og Phototoksisitet under time-lapse 3D-bildebehandling av levende celler, kompromiss vi romlig oppløsning med 2 x 2 binning. Binning øker følsomheten (forbedrer signal-til-støy forholdet) og tillatte Rammehastigheten, men på bekostning av romlig oppløsning. - Bruke en perfekt fokus (eller lignende) system for å forhindre fokus drift under opptak. Etter aktivering perfekt fokus systemet, bruker offset kontrollen å fokusere på macrophage lamellipodial utstikkende deler like over dekkglassvæske (se merknaden nedenfor) kanal lysbildet. Dette fokus nivået tilsvarer Z = 0 µm. motta Z-stabler fra-1 µm til +16 µm på 0,8 µm-trinn, som utgjør 22 Z-skiver. Z-stabler, for eksempel fås med en hastighet på 1 stabel (for hver kanal) hver 15 s for totalt 16 min.
Merk: Lengre opptak perioder lider tap av bildekvalitet, hovedsakelig på grunn av photobleaching. Z-stabler er ervervet for hver av de to kanalene: makrofager er avbildet med en 488 nm laser (grønn kanal) og menneskelige røde blod celler er avbildet med en 561 nm laser (rød kanal). Bruker denne tilnærmingen, ulike visninger av makrofager inntak IgG-opsonized menneskelige røde blod celler på forskjellige timepoints kan fås (for eksempel se figur 2).
Merk: Vanlige innstillinger av systemet (med 2 x 2 binning) er: grønne kanalen (20.5% laser (50 mW; 488 nm) strøm, 101 følsomhet (range, 0-255) og 200 ms eksponeringstid); røde kanalen (10,5% laser (50 mW; 561 nm) strøm, 101 følsomhet (range, 0-255) og 98 ms eksponeringstid).
Merk: Bunnen av kanalen lysbildet er en polymer med samme tykkelse som en #1.5 glass dekkglassvæske og samme optiske egenskaper av glass, men spesielt materialet har fordelen av gass permeabilitet.
8. imaging fagocytose Plasma membran farget og komplement-belagt menneskelige røde blod celler
- Supplement-opsonize plasma membranen farget og IgG-opsonized menneskelig røde blod celler tilsvarende deler 5 og 6, unntatt, i stedet for pipettering 4 µL av 1:1 utvannet røde blodlegemer suspensjon i 2 mL endret RPMI 1640 (Hepes) medium, som beskrevet i Seksjon 3.3, Pipetter 4 µL i 1 mL endret RPMI 1640 (Hepes) medium, og tilsvarende etikett røret 4:1 000. Dermed er menneskelige røde blod celler 2 ganger mer konsentrert.
- Fortsett med trinnene i avsnitt 4 og 5, men starter med 4:1,000 i stedet for 4:2,000 utvannet bestanden av menneskelig røde blodlegemer (4:1 000 og 4:2,000 refererer til de påfølgende fortynninger av de opprinnelige 1:1 utvannet menneskelige røde blodlegemene beskrevet i avsnitt 3.1 og 3.2).
- Ofre C5 null mus (f.eks B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson Laboratory) ved (> 5% i luft) isoflurane innånding etterfulgt av halshogging og samle blod. Vi dryppe vanligvis om 0,8 mL blod i en rund bunn 14 mL plastrør umiddelbart etter isoflurane innånding og halshogging.
- Etter 1 h, når blodet er fullt koagulert, overføre gjenværende væsken i en 2.0 mL microcentrifuge rør og sentrifuge 300 x g for 5 min ved romtemperatur. Senere, nøye samle gulaktig serum. Vanligvis gjenopprette vi minst 200 µL C5 null serum. Plass C5 null serum på isen.
- Etter 4 min inkubasjonstiden for plasma membranen beiset menneskelige røde blod celler med IgG, legge til en annen 1 µL anti-CD235a antistoff (gir 2 x konsentrert), og deretter ta 50 µL av cellen suspensjon og bland det i et separat 2.0 mL microcentrifuge rør som inneholder 50 µL C5 null serum. Fortsette å blande flere ganger (hver 1 min) av pipettering opp og ned i Seksjon 6.2, for en annen 4 min. Dermed etter dette trinnet har menneskelige røde blod celler blitt ruget med anti-CD235a antistoff totalt 8 min.
NOTE 4 min inkubasjonstiden med C5 null serum er tilstrekkelig til å aktivere det klassiske supplement gjennomgripende og opsonize de menneskelige røde blod cellene med C3b, som er kløyvde av faktor jeg til iC3b.
9. bestillingsbekreftelse av IgG - og C3b-opsonization av menneskelig røde blodlegemer
-
Bekreft opsonization av menneskelig røde blodlegemer med musen anti-CD235a IgG (IgG2b, se Seksjon 6.1) antistoff ved rugende cellene med geit anti-mus (sekundære) IgG antistoff konjugert til en grønn eller rød fluorescerende fluorophore.
- Legg 1 µL musen anti-CD235a IgG-antistoffer og 1 µL fluorescently merket anti-musen sekundære antistoff til en 400 µL suspensjon av menneskelig røde blodceller, og ruge på 37 ° C i 8 min. Senere vaskes to ganger (som deler 5.2-5.5).
- Resuspend celle pellets med 400 µL endret RPMI 1640 (Hepes) medium og Pipetter 100 µL av suspensjon i en kanal Skyv (se figur 1 c) for AC confocal fluorescens bildebehandling.
Merk: Cellene blir klynge (agglutinate) etter vask og rørets, men vask er nødvendig å redusere bakgrunnen fluorescens på grunn av ubundet sekundære antistoff.
-
Bekrefte opsonization av menneskelig røde blodlegemer, pre merket med musen IgG og inkubert med C5 null musen serum, C3b/iC3b med for eksempel rotte anti-musen C3b/iC3b/C3c antistoffer og en sekundær antistoff, for eksempel geit anti-rotte IgG antistoff konjugert til en grønn fluorescerende fluorophore.
- Gjenta trinnene i delen 8 med unstained kvinne menneskelige røde blodceller.
- Legg 0,25 µL fluorescently merket anti-musen C3b/iC3b/C3c mot 100 µL blandingen (50 µL IgG-merket menneskelige røde blodlegemer + 50 µL C5 null musen serum) og ruge på 37 ° C i 8 min.
- Vask to ganger, resuspend pellets i 100 µL endret RPMI 1640 (Hepes) medium og pipette suspensjon i en kanal Skyv (se figur 1 c) for AC confocal fluorescens bildebehandling.
Representative Results
En skjematisk diagram kanal lysbildet brukes for avbilding av fagocytose av time-lapse spinning AC confocal mikroskopi er vist i figur 1. Menneskelige røde blod celler (hRBCs) er farget med røde fluorescerende plasma membran markøren CellMask Orange, mens isolert musen bosatt peritoneal makrofager (Ms) er merket med grønne fluorescerende Alexa Fluor 488-konjugerte anti-F4/80 antistoff ( Figur 2), som serverer både en spesifikk markør for musen makrofager og som en plasma membran etikett. Menneskelige røde blod celler kan være opsonized med mus IgG (mIgG), eller musen IgM (mIgM), av rugende cellene med IgG (eller IgM) anti-CD235a antistoff (CD235a, også kjent som glycophorin A, er et protein spesielt uttrykt på menneskelig røde blodlegemer). Tidsinnstilt 3D bildebehandling av grønne fluorescerende makrofager presentert med røde fluorescerende menneskelige røde blod celler kan visualisering av én partikkel phagocytic hendelser (figur 2). Av enkelt phagocytic hendelser gjør detaljer av partikkel fangst og inntak skal angis. For eksempel kan erobringen av en mIgG-opsonized menneskelige røde blodlegemer av en macrophage filopodium, en tynn, finger-like projeksjon, observeres (figur 3A; se også Horsthemke et al. 15). dessuten innstrammingen av en menneskelig røde blodlegemer under phagocytic cup formasjon kan observeres (figur 3A). Utløse klassiske supplement kaskade, som kulminerer i dannelsen av en Hemolytisk membran komplekset på innføringen av fersk musen serum, mIgG-opsonized, eller mIgM-opsonized, menneskelige røde blodlegemer. The kinetics av komplement-mediert hemolyse kan måles ved imaging celler dual-farget med CellMask Orange og Calcein. Grønne fluorescerende cytosolic Calcein slippes raskt fra celler under hemolyse (figur 3B).
Figur 1: håndtering av fibronectin-belagt kanal lysbilder. (A) A kanal lysbildet består av to reservoarer forbundet med en kanal med dimensjoner 50 x 5 mm 0.4 mm. kanalen lysbilder er utgangspunktet ferdigfylt ved å bruke 1-2 mL medium til en av de to reservoarene og vippe lysbildet. (B) Caps kan plasseres på reservoarene før inkubasjon. Caps kan enkelt brukes til å pumpe ut uønskede luftbobler før såing kanalen med celler. (C) luft boble-fri 100 µL kanal kan fylles av direkte pipettering medium i munnen på en kanal. Dette trinnet brukes for eksempel til frø makrofager i et lysbilde eller legge til gfluorophore (grønn fluorescerende)-konjugert anti-F4/80 antistoff, som fungerer som en membran etikett, samt en mus macrophage markør. (D) etter pipettering partikler som opsonized menneskelige røde blod celler, i en kanal plantet med fluorescently farget makrofager lysbildet kan plasseres på scenen av en invertert mikroskop og time-lapse spinning disk AC confocal mikroskopi kan være utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Time-lapse 3D-bildebehandling av fagocytose. (A) skjematisk diagram som viser opsonization av plasma membran farget (rød fluorescerende) menneskelige røde blodlegemer (hRBCs) med musen (m) anti-CD235a immunglobulin G (mIgG) antistoff, og presentasjon av merket hRBCs til musen makrofager (Ms), merket (grønn fluorescerende) med grønne fluorescerende fluorophore-konjugerte anti-F4/80 antistoff. (B) Time-lapse bilder (XZ visninger), ved å spinne disk AC confocal mikroskopi, viser phagocytic cup dannelse og inntak av mIgG-opsonized hRBCs. Skala bar = 10 µm. (C) 3D rekonstruksjoner viser makrofager inntak av mIgG-opsonized hRBCs. Tilsvarende XZ visninger (for 3 av timepoints) vises i B. rutenettet spacings representerer 5.07 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: erobringen av en partikkel av en filopodium. Time-lapse bildene, oppnådd ved å spinne disk AC confocal mikroskopi, viser en mus macrophage fange en mus immunglobulin G (mIgG)-opsonized menneskelige røde blodlegemer (hRBC) via en filopodium (pilene i øvre panel), en finger-lignende anslag. Merk at for røde blodlegemer mister sin crenations tidlig under phagocytic cup formasjon. Videre synes phagocytic koppen å presse den omsluttede røde blodlegemer (angitt med pilene i nedre panel). Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
De aller fleste fagocytose analyser, spesielt sluttpunktet og høy gjennomstrømming analyser, gir ikke visualisering hvordan partikler er faktisk fanget, innhyllet og svelget. Banebrytende studier av Munthe-Kaas et al. 10 og Kaplan2 i 1970 foreslo at strikingly forskjellig cellen cytoskjelett omorganiseringer var involvert i fagocytose av IgG-opsonized versus komplement-opsonized partikler (sau røde blodlegemer). Her beskriver vi fagocytose analyser med spinning disk AC confocal mikroskopi som gir høy oppløsning, sanntid imaging enkelt phagocytic hendelser. Vår modell phagocyte er den musen bosatt peritoneal macrophage, som kan isoleres med minimal håndtering, og vi bruker ferske isolert menneskelige røde blod celler som partikler. Fagocytose analyser kan imidlertid brukes til andre phagocytes, som musen Ben margtransplantasjon-avledet makrofager eller nøytrofile, musen macrophage cellelinjer, menneskelige monocytt-avledet makrofager eller menneskelig perifert blod nøytrofile. Ved menneskelige phagocytes eller musen nøytrofile være alternativ fluorescently merket antistoffer nødvendig, for eksempel fluorescently merket anti-CD14 antistoffer (menneskelige monocytter/makrofager)16 eller anti-Gr-1 (Ly - 6 G) antistoffer (mus nøytrofile).
Unopsonized menneskelig røde blod celler, som tradisjonelt brukes sauer røde blod celler, er inaktivt i den forstand at disse cellene er ikke (eller, minst, veldig sjelden) ingested av musen peritoneal makrofager. Dette sikrer, i motsetning til polystyren perler, lav bakgrunn aktivitet. Menneskelige røde blod celler kan være en praktisk opsonized med immunglobuliner bruker musen IgG eller IgM monoklonale antistoffer mot CD235a (glycophorin A), en spesifikk markør for menneskelig erytrocytter (røde blodlegemer) og erythroid forløpere17, 18. i parallell analyser, fluorescently merket anti-musen IgG eller IgM sekundære antistoffer kan brukes for å bekrefte opsonization. De IgG og IgM er antistoffer hemagglutinins, stoffer (antistoffer) som forårsaker røde blodlegemer til agglutinate. For å unngå agglutinerende, har vi blande midlertidig celle suspensjon under 8 min incubation periode med anti-CD235a antistoffer og vi legger blandet suspensjon direkte i macrophage inneholder kanal lysbildet (fibronectin-belagt lysbilde) uten en wash trinn . Vask fremgangsmåten involverer sedimentering av røde blodlegemer av sentrifugering, som fremmer sterkt agglutinerende. Før opsonizing menneskelige røde blod celler, merke vi plasma membranen med en lipofile oransje/fluorescerende sonde. Denne sonde er sterkt fluorescerende begynnelsen av time-lapse opptak, men signalet forsvinner gradvis, sannsynligvis hovedsakelig på grunn photobleaching19. I tillegg kan makrofager og fibronectin belegget på lysbildet bli svakt oransje/fluorescerende under opptak. Dette problemet skyldes antagelig utilstrekkelig vask av menneskelig røde blodlegemer etter merking. Istedet for benytter merketråd lipofile fluorescerende plasma membran, kan menneskelige røde blod celler merkes med en pH-sensitive rhodamine derivat bruker sin Amin reaktive succinimidyl ester15,20. Dette har fordelen at visualisering av phagosome modning siden fluorescens intensitet øker med minkende pH15,20, men denne tilnærmingen har ulempen at reaktive ester forberedelser er dyrt og ustabil etter rekonstituering i vandig medium.
IgG-opsonized menneskelige røde blodlegemer inntatt via FcγRs, som kan bekreftes ved hjelp av peritoneal makrofager isolert fra NOTAM21 eller Fcer1g- / - (Fcer1g knockout) mus. NOTAM makrofager binde IgG-opsonized menneskelige røde blod celler, men mangler ITAM (immunoreceptor tyrosin-basert aktivering motiv) - mediert signalisering kreves for å indusere fagocytose, mens Fcer1g knockout makrofager ikke uttrykke overflaten FcγRs. IgG - eller IgM-opsonized menneskelige røde blod celler kan i tillegg opsonized med C3b (som er kløyvde til iC3b) av rugende cellene med fersk isolert serum fra supplement C5 null mus (vill-type serum fører til hemolyse). Opsonins IgG og IgM aktivere klassiske supplement kaskade, som fører til dannelsen av porene (membran angrep komplekser) og celle lysis. I mus mangler supplement C5, supplement kaskade fortsetter å utfylle C3 spalting, men C5 banens C3 konvertase mangler underlaget må katalysere terminal veien. Vi utviklet enkle analyser for å måle the kinetics av komplement kaskade. Kort sagt, kan menneskelige røde blod celler co merket med en rød fluorescerende, plasma membranen markør og den grønne fluorescerende, cytosolic fluorophore. På dannelsen av membran angrepet komplekse, dannet av komplement komponenter C5-C9 cytosolic fluorophore er raskt (i sekunder) mistet fra stoffer. Visualisering av den slutten-effektor (cytolysis) i supplement cascade indikerte at 4 min incubation tid er tilstrekkelig for C3b/iC3b opsonization av menneskelig røde blodlegemer. I parallelle analyser, kan C3b/iC3b belegg av menneskelig røde blod celler lett vurdert etter bruk en blanding av anti-musen C3b og fluorescently merkes sekundære antistoffer. I dette tilfellet kreves en wash trinn for å fjerne ubundet fluorescerende antistoffer. Selv om det vask trinnet innebærer celle sedimentaion av sentrifugering, som fremmer agglutinerende, kan vellykket opsonization lett vurderes av AC confocal mikroskopi. Supplement reseptor-mediert fagocytose kan avbildes enten bruke IgG- / iC3b-opsonized menneskelig røde blod celler NOTAM eller Fcer1g- / - makrofager eller ved å innføre IgM- / iC3b-opsonized menneskelig røde blod celler til vill-type makrofager. IgM-opsonized blod celler er ikke anerkjent av den ITAM inneholder FcγRs (FcγRI, FcγRIII og FcγRIV) kreves for fagocytose IgG-opsonized partikler22.
For å bilde phagocytic kan hendelser, plasma membranen av makrofager merkes med grønne fluorescerende fluorophore konjugert anti-F4/80 antistoff, som også fungerer som en spesifikk markør for musen makrofager. Menneskelige røde blodlegemer gjengis rød fluorescerende av inkubasjon med en oransje/fluorescerende plasma membran markør, som beskrevet ovenfor. Denne lipofile plasma membranen markøren unngår forvirrende virkning antistoff-plateselskap. Rød fluorescerende menneskelige røde blod celler, med eller uten opsonization, kan være direkte pipetted i 100 µL kanalen en kanal lysbilde og 3D time-lapse fotografert via en 60 X / 1,49 olje nedsenking (eller lignende) linsen utført ved hjelp av 488 nm og 561 nm laser linjer , henholdsvis av spinning disk AC confocal (eller lignende) mikroskop. Det er fristende å optimalisere systemet for høy-resolution tenkelig, men oppkjøpet av gjentatte Z-stabler over 16 min eller så kan forårsake betydelig photobleaching og Phototoksisitet. Vi valgte å bruke 2 x 2 binning for å fremme god signal-til-støy-forhold og tillate reduksjoner i eksitasjon intensitet og/eller eksponeringstider, men på bekostning av optisk oppløsning. I tillegg for å redusere Phototoksisitet, legger vi en scavenger av reaktive oksygen arter til mediet. I fremtidige studier, kan analyser endres bilde fagocytose av apoptotisk menneskelige røde blodlegemer. Anvendelsen av en Ca2 + ionophore, som A23187, kan brukes å indusere fosfatidylserin eksternalisering23, en "eat me" signal og kjennetegner tidlig apoptose24,25.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd HA 3271/4-1 og HA 3271/4-2 fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) og grant FF-2016-05 fra EXC 1003 (klynge av fortreffelighet 1003), celler i bevegelse (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
