Summary
Denne protokol beskriver den kirurgiske labyrinthectomy af en rotte, som er en nyttig metode til at studere det vestibulære system.
Abstract
For at studere det vestibulære system eller det vestibulære kompensationsprocessen, er blevet udviklet en række metoder til at forårsage vestibulære skade, herunder kirurgisk eller kemiske labyrinthectomy og vestibulære neurectomy. Kirurgisk labyrinthectomy er en relativt enkel, pålidelig og hurtig metode. Her beskrives den kirurgiske teknik til rotte labyrinthectomy. Et postauricular snit er lavet under generel anæstesi til at afsløre den ekstern auditive kanal og trommehinden, hvorefter trommehinden og øreknoglerne er fjernet uden stapes. Stapes arterie, som er beliggende mellem stapes og ovale vindue, er en sårbar struktur og skal bevares for at opnå et klart kirurgiske felt. Et hul til fenestrate forhallen er lavet med en 2.1-mm drill bur overlegen i forhold til stapes. Så, 100% ethanol er injiceres gennem dette hul og indsugning flere gange. Omhyggelig dissektion under et mikroskop og omhyggelig blødende kontrol er afgørende for at opnå pålidelige resultater. Symptomer af vestibulære tab, nystagmus, hoved vippe og en rullende bevægelse, ses umiddelbart efter operationen. Rotarod eller rotation stol test kan anvendes til objektivt og kvantitativt evaluere den vestibulære funktion.
Introduction
Den vestibulære orgel er afgørende for balance og øjet kontrol. En normal vestibulære funktion afhænger af symmetriske afferente signaler fra de vestibulære organer i de to indre ører. Vestibulære hypofunction eller tab inducerer svimmelhed, nystagmus og postural ubalance. Efter en akut skade genopretter den vestibulære funktion spontant inden for flere dage, en proces kendt som vestibulære erstatning1,2. Den vestibulære erstatning af statisk underskud er en proces af recovery relateret til ubalance i spontan hvilende aktivitet mellem de ipsilaterale og kontralaterale vestibulære kerner. Den vestibulære kompensation i dynamisk underskud opnås hovedsagelig via sensorisk og adfærdsmæssige udskiftninger (ved hjælp af visuelle eller somatosensoriske input)3. Disse processer er attraktive for neuronal plasticitet undersøgelser4,5.
En række metoder har været udviklet til at studere det vestibulære system og mekanismerne bag neuronal plasticitet under vestibulære kompensation, som kirurgisk og kemiske labyrinthectomy og vestibulære neurectomy5,6 ,7,8. Vestibulære neurectomy er en bestemt måde at fremkalde komplet vestibulære tab, men det er en mere vanskelig og invasiv procedure og kan medføre hjerneskade8,9. Denne metode kræver større kirurgiske færdigheder og tager længere tid end labyrinthectomy. Kemiske labyrinthectomy herunder phosphatbufferet, arsanilate og tetracain, er lettere og kan give pålidelige resultater10,11,12. Men øresneglen kan også være beskadiget og vestibulære tab kan udvikle sig over tid11. Derudover er virkningerne af kemikalier på hjernen, som bør bevares for nøjagtig evaluering, uklart. Kirurgisk labyrinthectomy blev først indført i dyreforsøg i 184215 og blev først rapporteret i rotte i 193616. Denne teknik er siden blevet brugt i mange dyre undersøgelser5,17,18,19. Kirurgisk labyrinthectomy er en specifik, pålidelig og relativt enkel metode. 13 , 14 Derudover symptomerne på vestibulære skader ses umiddelbart efter operationen. Her beskriver vi vores kirurgisk teknik til rotte labyrinthectomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), som er akkrediteret af Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care International.
Bemærk: Forsøgene blev udført på Sprague-Dawley (SD) mandlige rotter i 7-8 uger gamle (200/250 g). Hvert dyr blev akklimatiseret til laboratorieforhold for 1 uge før starten af forsøget. Dyrene har været opstaldet i en kontrolleret temperatur og luftfugtighed rum med en konstant 12-h:12-h lys: mørke cyklus med fri adgang til mad og vand.
1. Labyrinthectomy
- Dække de autoklaveres kirurgiske instrumenter med en steril pad. Desinficere området drift med 70% ethanol. Bruge en steril drapere og vedligeholde sterile forhold under operationen.
- Bærer en kjole, maske (for at dække næse og mund), kasket (til at dække hovedet), og et par af sterile handsker. De kirurgiske instrumenter må kun komme i kontakt med steril overflader.
- Injicere Tiletamin-zolazepam bedøvelsesmiddel (40 mg/kg kropsvægt) intramuskulært i de mediale lår eller intraperitoneal, og xylazin (10 mg/kg kropsvægt) intramuskulært eller intraperitoneal.
Bemærk: Andre former for narkose, herunder isofluran indånding, kan også bruges. - Placere rotten på en opvarmning pad (oprindeligt indstillet på 42 ° C). Anvende smøremiddel øjet salve på begge øjne af rotte at undgå øjet tørhed under anæstesi.
- Placere rotten på sin højre side. Barbere pels på det kirurgiske område med hårklippere. Desinficere site med 70% ethanol.
- Indsprøjte 1% lidocain hydrochlorid subkutant i området venstre retroauricular.
- Ved hjælp af en skalpel klinge #15, lave en ~5.0 cm retroauricular snit. Separat muskel og fascia at udsætte den ekstern auditive kanal med Iris saks (figur 1A). Lidt åbne eksterne auditive kanalen ved hjælp af klinge #15 eller Iris saks (figur 1B). Bredt udsætte trommehinden (figur 2A).
- Under et mikroskop (7,5 X eller 12,5 X), fjerne trommehinden og øreknoglerne undtagen stapes, ved hjælp af pincet. Løsne musklerne på lambdoidal-højderyggen med klinge #15 eller Iris saks (figur 2B).
- Ved hjælp af en boremaskine ved lav hastighed (< 3000 omdr. / min.) med en diamant bur (2.1 eller 1,4 mm), bore tympaniske bulla knogle omkring punktet af exit af facial nerve (figur 3A). Identificere den stapedial arterie. Passe på ikke for at beskadige den stapedial arterie i boring-processen.
- Fortsætte boring forhallen overlegen i forhold til den stapedial arterie og udsætte det runde vindue og knoklet laterale halvrunde kanalen. Åbn den laterale halvrunde kanalen nær dens ampulla. Fortsætte boring i flyet af den laterale halvrunde kanalen og bore den overlegne halvrunde kanalen ampulla.
- Aspirér indholdet af forhallen ved hjælp af en 18-G eller 22-G nål. Indsprøjtes og Opsug 1 cm3 100% ethanol 3 x.
- Luk musklerne og huden i to lag med enkle afbrudt suturer.
- Efterlad ikke et dyr uden opsyn indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Holde rotten varme, indtil det vækker, bruge en varmepude eller en varmelampe. Efter opvågning, flytte rotten til en individuel bur i et værelse med de sædvanlige miljøforhold.
- Administrere antibiotika (f.eks.Cefazoline 20 mg/kg, trimethoprim-sulfonamid 100 µL subkutant, eller penicillin 300.000 IU) efter behov på dag 1; en smertestillende (ikke en opioid; fxMetacam 2 mg/kg, Carprofen 5 mg/kg subkutant) kan også gives.
2. sham operation
- For sham operation som en kontrol, udføre de samme kirurgiske og post-kirurgiske procedurer (ifølge punkt 1), herunder eksponering af den ekstern auditive kanal og trommehinden (trin 1,7), fjernelse af trommehinden og øreknoglerne, og den udstationering af musklerne på lambdoidal ridge (trin 1.8), men ikke åbne den halvrunde kanalen eller injicere ethanol.
3. check tab af vestibulære funktion
Bemærk: Tab af vestibulære funktion kan evalueres ved hjælp af enten adfærdsmæssige eller vestibulære funktion tests. 13 , 17 , 18 adfærdsmæssige test omfatter en evaluering af postural asymmetri og nystagmus.
- Identificere postural asymmetri, som omfatter spontan eller evoked tønde-rullende, falde til venstre, eller bevæger sig rundt mens hælder mod lesioned side18. Se Video 1.
- Identificere nystagmus ved en besigtigelse af frivillige øjenbevægelser. Når spontan nystagmus er fraværende i hvilende tilstand, pust luft forsigtigt over hovedet på de animalske18. Se Video 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen af operationen blev valideret af adfærdsmæssige test. Alle dyr udstillet den typiske adfærd af en ensidig tab af vestibulære funktion. Spontan tønde-rullende var tydeligt umiddelbart efter operationen, at være fremkaldt af en luft pust over hovedet eller en let berøring til kroppen i den tidlige opvågningsfasen (Video 1). 3 d efter kirurgi, dyrene flyttes rundt hælder mod den lesioned side med lejlighedsvis falder til venstre side. Spontan nystagmus blev observeret i 2 d (Video 2). Evoked nystagmus blev observeret i 3 d.
Kirurgi som regel kræves < 30 min. I løbet af 50 operationer døde 2 rotter under operationen og 3 i 1 d af kirurgi. Samlet set var de tab 10% (5 dødsfald under/efter 50 operationer). Alle dødsfald var forårsaget af en skade til den stapedial arterie. Vi bemærkede ikke forsinket død og ingen infektion inden for 1 uge. I flere dage efter operationen, kan rotterne udviser en dårlig oral indtagelse og vægt tab.
Figur 1: post auricular indsnit i venstre øre. (A) A postauricular snit blev lavet, og facial nerve (↑) blev identificeret mellem temporalis musklen (*) og sternomastoid muskel (†). (B) derefter, ekstern auditive kanal (↑) blev åbnet lidt og brusken i det ydre øre var adskilt fra den pyramideformede knogle. Skalalinjen 2 mm gælder for alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksponering af den benede væg i forhallen. (A) efter åbning den ekstern auditive kanal bred, malleus (*) blev set under trommehinden. (B) efter fjernelse af trommehinden og øreknoglerne (med undtagelse af stapes), cochlear forbjerg (*) blev identificeret og musklerne på lambdoidal ridge forhøjet (†). Skalalinjen 2 mm gælder for alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: vestibulære fenestration. (A) efter fjernelse af den bageste laterale væg tympaniske hulrum, knogle omkring punktet af exit af facial nerve blev boret. Den stapedial arterie (↑) og det runde vindue (Δ) over cochlear forbjerget (*) blev udsat. (B) efter boring ud den laterale forhallen, ampulla af halvrunde kanaler var tilsyneladende i den vestibulære rest (↑), som var ringere end placeringen af cochlear forbjerg (*). Skalalinjen 2 mm gælder for alle paneler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. Spontan tønde rullende. SD rotten, der undergik labyrinthectomy 2 d tidligere viste spontan tønde rullende. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2. Spontan nystagmus. SD rotten, der undergik labyrinthectomy 2 d tidligere viste spontan nystagmus. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik er en nyttig metode til at skabe pludselige, permanent og komplet vestibulære funktion tab. Dette kan bruges til at studere vestibulære patologier såsom vestibulær neuritis, akustisk tumor og Menières sygdom. Mange undersøgelser har brugt denne teknik til at studere den neuronale plasticitet af vestibulære kerner eller relaterede central proces5,17,18,19.
The most kritiske trin til vellykket kirurgi er 1) bevarelse af den stapedial arterie, 2) en omhyggelig boring på den nøjagtige position, og 3) omhyggelig blødende kontrol. En stor postauricular snit kan forårsage en stor ekstern sår, som forstyrrer ben bevægelse på den behandlede side. Men et lille snit begrænser feltet kirurgisk og forårsager handlingen til at tage længere tid. En ordentlig retraktion er afgørende for at opretholde en tilstrækkelig kirurgisk Se13. Efter den postauricular indsnit, kan facial nerve identificeres over bulla og mellem digastric musklen og sternocleidomastoideus musklen, kører forreste inferiorly til ansigt. Retroauricular arterien og den større auricular nerve køre i den modsatte retning. Eventuelle skader på facial nerve årsager ansigtslammelse efter indgrebet. For at opnå en bredere kirurgisk Vis og undgå en stapes arterie skade, foretrækker vi at fjerne superior ekstern auditive canal væg og derefter tilgang overlegen i forhold til stapes arterie17,19. Denne tilgang er forbundet med en større risiko for infektion i forhold til ventrolaterale tilgang, som ikke er åbningen af eksterne auditive canal væg eller fjernelse af trommehinden, (som udsætter mellemøret til eksterne miljø). Vores erfaring, de langsigtede sequelae (den generelle animalsk ydelse, sine fodring og drikke vaner, genoptagelse af vægtøgning og infektion status) ikke afviger især mellem dyr underkastes transtympanic fremgangsmåden her og til ventrolaterale tilgang17,20. Åbne bulla kan skade den vedlagte muskel og undertiden resultere i nogle blødning. I rat krydser arteria stapes tæt på webstedet af vestibulære fenestration. Hos mennesker, men forsvinder stapes arterie under embryogenese. Når det kirurgiske felt er smalle, det er ikke let at kontrollere blødningen, og feltet kan hurtigt fyldes med blod. For at undgå dette, koagulerer nogle forfattere stapes arterie før hullet. Selv om dets rolle ikke er klart, foretrækker nogle forfattere ikke at koagulere stapes arterie14 , fordi det kan levere det indre øre, central nerve systemet (geniculate ganglion, mediale lemniscus og trapez kroppen) og facial nerve i rotte14 ,21. Hvis der opstår blødning, vi komprimere arterie med en lille vatpind og derefter bruge elektriske Koagulering med tilstrækkelig suge.
En små burr er nyttige for at gøre et hul i forhallen. En lille krog eller nål kunne bruges i stedet for en burr. En mekanisk boring system resulterer i mindre fenestration traumer og bidrager til at opnå ensartede resultater. Uden ethanol kunstvanding observeret vi variable adfærdsmæssige reaktioner efter labyrinthectomy13,17. Ethanol kunstvanding og suge sikre at labyrinten er beskadiget, uhelbredeligt. 13 stumpe elektriske koagulation af det vestibulære nerve kan blive udført via dette hul22. Ordentlig forstørrelse er afgørende, og et mikroskop er obligatorisk i de fleste tilfælde.
Den midterste og indre øre er også beskadiget under labyrinthectomy, der medfører døvhed. Der er ingen måde at bevare det indre øre sikkert. Kemiske labyrinthectomy kan bevare dyrets hørelse, men giver variable resultater8. Vestibulære neurectomy kan også forårsage skader på øresneglsimplantater nerve8. Hvis du vil udføre handlingen sham i kontrolgruppen, fjernede vi trommehinden og øreknoglerne uden stapes, hvilket resulterede i mild ledende hearing uden nogen vestibulære skader13.
Flere adfærdsmæssige og vestibulære funktion tests kan bruges til at bekræfte, at labyrinthectomy har udført13,14. Umiddelbart efter proceduren, kan en skæv afvigelse i øjet observeres. Efter genopretning fra anæstesi, kan spontan nystagmus, en rullende bevægelse og hoved vippe ses. Rotation af hale hængende er den mest pålidelige test17,20. Disse underskud inddrive langsomt inden for flere dage17,20. Spontan nystagmus med hurtig bevægelse til de kontralaterale side vil forsvinde inden for 3-4 d efter proceduren. Hoved kipning forbliver i flere måneder. Vestibulære funktion test, såsom en rotation stol test eller en rotarod test, kan levere mere objektive og kvantitative data23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Korea sundhed Technology R & D projekt gennem den Korea sundhed industri udvikling Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for sundhed og velfærd, Republikken Korea (giver nummer: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
- Curthoys, I. S., Halmagyi, G. M. Vestibular compensation: a review of the oculomotor, neural, and clinical consequences of unilateral vestibular loss. Journal of Vestibular Research. 5 (2), 67-107 (1995).
- Smith, P. F., Curthoys, I. S. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: a review. Brain Research. Brain Research Reviews. 14 (2), 155-180 (1989).
- Lacour, M., Helmchen, C., Vidal, P. P. Vestibular compensation: the neuro-otologist's best friend. Journal of Neurology. 263, Suppl 1. S54-S64 (2016).
- Darlington, C. L., Smith, P. F. Molecular mechanisms of recovery from vestibular damage in mammals: recent advances. Progress in Neurobiology. 62 (3), 313-325 (2000).
- Shinder, M. E., Ramanathan, M., Kaufman, G. D. Asymmetric gene expression in the brain during acute compensation to unilateral vestibular labyrinthectomy in the Mongolian gerbil. Journal of Vestibular Research. 16 (4-5), 147-169 (2006).
- Dutheil, S., Brezun, J. M., Leonard, J., Lacour, M., Tighilet, B. Neurogenesis and astrogenesis contribution to recovery of vestibular functions in the adult cat following unilateral vestibular neurectomy: cellular and behavioral evidence. Neuroscience. 164 (4), 1444-1456 (2009).
- Gunther, L., et al. N-acetyl-L-leucine accelerates vestibular compensation after unilateral labyrinthectomy by action in the cerebellum and thalamus. PLoS One. 10 (3), e0122015 (2015).
- Pericat, D., Farina, A., Agavnian-Couquiaud, E., Chabbert, C., Tighilet, B. Complete and irreversible unilateral vestibular loss: a novel rat model of vestibular pathology. Journal of Neuroscience Methods. 283, 83-91 (2017).
- Cass, S. P., Goshgarian, H. G. Vestibular compensation after labyrinthectomy and vestibular neurectomy in cats. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 104 (1), 14-19 (1991).
- Vignaux, G., et al. Evaluation of the chemical model of vestibular lesions induced by arsanilate in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 258 (1), 61-71 (2012).
- Berryhill, W. E., Graham, M. D. Chemical and physical labyrinthectomy for Meniere's disease. Otolaryngologic Clinics of North America. 35 (3), 675-682 (2002).
- Morgenstern, C., Mori, N., Arnold, W. Experimental studies on the effect of labyrinth anesthesia. Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 237 (3), 255-261 (1983).
- Nadasy, G. L., Raffai, G., Feher, E., Schaming, G., Monos, E. A simple standard technique for labyrinthectomy in the rat: a methodical communication with a detailed description of the surgical process. Physiology International. 103 (3), 354-360 (2016).
- Hitier, M., Besnard, S., Vignaux, G., Denise, P., Moreau, S. The ventrolateral surgical approach to labyrinthectomy in rats: anatomical description and clinical consequences. Surgical and Radiologic Anatomy. 32 (9), 835-842 (2010).
- Flourens, M. J. Recherches experimentales sur les propriétés et les fonctions du système nerveux dans les animaux vertébrés. , Crevot. Paris. (1824).
- T'Ang, Y., Wu, C. F. The effects of unilateral labyrinthectomy in the albino rat. Chinese Journal of Physiology. 10, 571-598 (1936).
- Chang, M. Y., et al. MicroRNAs 218a-5p, 219a-5p, and 221-3p regulate vestibular compensation. Scientific Reports. 7 (1), 8701 (2017).
- Bergquist, F., Ludwig, M., Dutia, M. B. Role of the commissural inhibitory system in vestibular compensation in the rat. The Journal of Physiology. 586 (18), 4441-4452 (2008).
- Cameron, S. A., Dutia, M. B. Cellular basis of vestibular compensation: changes in intrinsic excitability of MVN neurones. NeuroReport. 8 (11), 2595-2599 (1997).
- Park, M. K., Lee, B. D., Lee, J. D., Jung, H. H., Chae, S. W. Gene profiles during vestibular compensation in rats after unilateral labyrinthectomy. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 121 (11), 761-769 (2012).
- Yamamoto, H., Tominaga, M., Sone, M., Nakashima, T. Contribution of stapedial artery to blood flow in the cochlea and its surrounding bone. Hearing Research. 186 (1-2), 69-74 (2003).
- Potegal, M., Abraham, L., Gilman, S., Copack, P. Technique for vestibular neurotomy in the rat. Physiology & Behavior. 14 (2), 217-221 (1975).
- Tung, V. W., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L., Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. Journal of Visualized Experiments. (89), e51605 (2014).
- de Jeu, M., De Zeeuw, C. I.
