Summary
Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.
Abstract
L'emphysème est une caractéristique importante de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Les études impliquant un modèle de souris emphyséame exigent une fixation optimale des poumons pour produire des spécimens histologiques fiables du poumon. En raison de la nature de la composition structurelle du poumon, qui se compose en grande partie d'air et de tissu, il y a un risque qu'il s'effondre ou se dégonfle pendant le processus de fixation. Diverses méthodes de fixation pulmonaire existent, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. La méthode de fixation pulmonaire présentée ici utilise une pression constante pour permettre une évaluation optimale des tissus pour les études utilisant un modèle de poumon de souris emphysématous. Le principal avantage est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois. Les échantillons pulmonaires sont obtenus à partir de souris chroniques exposées à la fumée de cigarette. La fixation pulmonaire est effectuée à l'aide d'équipements spécialisés qui permettent la production d'une pression constante. Cette pression constante maintient le poumon dans un état raisonnablement gonflé. Ainsi, cette méthode génère un spécimen histologique du poumon qui convient pour évaluer l'emphysème doux induit par la fumée de cigarette.
Introduction
La MPOC est l'une des principales causes mondiales de décès1. La fumée de cigarette est la cause la plus importante de la MPOC, mais les mécanismes de pathogénie restent incomplètement définis. La MPOC présente deux caractéristiques principales, y compris la limitation progressive du débit d'air et une réponse inflammatoire anormale du poumon. Le désordre emphysème se produit fréquemment dans les poumons des patients de COPD2. Les résultats pathologiques de l'emphysème sont caractérisés par la destruction de mur alvéolif3. Plusieurs espèces animales ont été utilisées pour produire des modèles de MPOC in vivo (c.-à-d. chiens, cobayes, singes et rongeurs)4. Cependant, la souris est devenue la plus couramment utilisée dans la construction de modèles de MPOC. Cela a de nombreux avantages, y compris son faible coût, la capacité d'être génétiquement modifié, la disponibilité étendue de l'information génomique, la disponibilité des anticorps, et la capacité d'utiliser une variété de souches de souris5. Actuellement, il n'y a aucun modèle de souris qui peut imiter toutes les caractéristiques de la MPOC humaine; ainsi, les chercheurs individuels doivent choisir quel modèle convient le mieux à la recherche spécifique sur la MPOC6. Le modèle de souris emphyséame est l'un des nombreux modèles de souris COPD qui sont actuellement disponibles. D'autres modèles incluent le modèle de souris d'exacerbation, le modèle systémique de comorbidités, et le modèle de susceptibilité de COPD7.
Le modèle de souris emphyséame peut être généré par plusieurs types d'agents exogènes, y compris les agents chimiques et l'exposition à la fumée de cigarette4. L'exposition chimique (p. ex., à l'élastase) produit un type grave d'emphysème, tandis que la fumée de cigarette entraîne un emphysème léger8,9. On croit que la fumée de cigarette est la principale cause de la pathogénie de la MPOC; par conséquent, le choix de la fumée de cigarette comme un moyen de créer un modèle de souris COPD est raisonnable10. De nombreuses études ont utilisé la fumée de cigarette pour créer de l'emphysème chez la souris. Par exemple, Nikula et coll. ont réussi à créer un modèle de souris emphyséamée à partir de souris femelles B6C3F1 en les exposant à la fumée de cigarette pendant 7 ou 13 mois11. Nous avons également établi un modèle de souris emphyséame via la protéine marqueur de sénescence/SMP-30 SOURIS KO12. Il est crucial d'effectuer une méthode de fixation pulmonaire qui peut correctement visualiser ce modèle d'emphysème doux par l'exposition à la fumée de cigarette.
Diverses méthodes de fixation pulmonaire ont été établies13. Cependant, il n'existe pas de méthode standard d'or de fixation des tissus pulmonaires pour évaluer l'emphysème14. Plusieurs études de ce laboratoire ont montré que le système de fixation présenté ici est utile en créant une condition stable pour l'évaluation de l'emphysème12,15,16,17,18. Le principal avantage du système actuel est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois sans effondrement pulmonaire ou la déflation. Le système actuel de fixation pulmonaire utilise un équipement spécial qui permet de gonfler les échantillons pulmonaires à une pression constante appropriée pendant une période donnée. Cet équipement spécial se compose de trois pièces, y compris un conteneur inférieur, conteneur supérieur, et la pompe. Les échantillons pulmonaires sont placés dans le récipient inférieur qui est relié à des agents de fixation sous pression, ce qui entraîne une différence de pression de 25 cmH2O dans le niveau d'agents entre les contenants supérieurs et inférieurs19.
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Protocol
Les méthodes suivantes ont été approuvées par les comités de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine de l'Université de Juntendo. Les Lignes directrices pour une bonne conduite des expériences animales, Conseil des sciences du Japon, 1er juin 2006 ont été suivies. Il y a trois étapes principales dans cette méthode : 1) dissection de souris, 2) exsanguination de poumon, et 3) fixation des tissus de poumon assistés par l'équipement spécialisé. Typiquement, les spécimens de poumon sont traités à l'intégration après 48 h de fixation12,15,16,17,18.
1. Dissection de souris
- Mesurez le poids corporel de la souris, puis déterminez la quantité de pentobarbital à administrer.
- Injecter pentobarbital intraperitoneally à une dose de 70 mg/kg de poids corporel et confirmer l'anesthésie par l'absence de réaction à la pincée d'orteil.
- Injectez l'aiguille à un angle de 45 degrés jusqu'à ce qu'elle pénètre dans la peau et le muscle. Dessiner le piston et confirmer un aspirateur à air, puis injecter le pentobarbital.
- Confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe.
REMARQUE : L'utilisation de la souris anesthésiée par opposition à une souris euthanasiée est recommandée pour l'exsanguination entièrement pulmonaire. - Couper la peau de la souris et le muscle abdominal à la ligne médiane, visant la zone céphalique.
- Couper latéralement pour fournir un espace de travail plus large.
2. Exsanguination pulmonaire
- Exposer la couche de diaphragme et la perforer avec des forceps.
- Ouvrez l'espace thoracique et coupez la zone sternale, permettant aux poumons et au cœur d'être vus clairement.
- Couper le cœur dans l'oreillette gauche et le ventricule droit.
- Insérer une canule (24 G) dans la zone du ventricule droit et la diriger vers la zone céphalique jusqu'à ce qu'elle atteigne l'artère pulmonaire, comme le montre la figure 1.
- Allumez la pompe et laissez circuler la saline (PBS) tamponnée par le phosphate 1x (environ 200 ml/h) jusqu'à ce que tous les tissus pulmonaires changent pour devenir de couleur blanche.
3. Fixation du tissu pulmonaire
- Enlever la trachée, les poumons et le cœur.
- Libérez les trois organes en coupant les tissus conjonctifs environnants.
- Attachez la bronche principale droite avec un fil de suture et coupez tous les lobes du poumon droit.
- (Facultatif) : les lobes du poumon droit se composent de quatre parties. Couper ces parties de la bronche principale droite et diviser les parties pour le traitement en tant qu'échantillons de tissus congelés.
- Insérez le cœur et les lobes du poumon gauche dans des agents de fixation, situés à l'intérieur d'une seringue de 10 ml.
CAUTION: Les agents de fixation sont dangereux. Portez un équipement de protection approprié (p. ex., de longs gants en caoutchouc) et travaillez dans une pièce bien aérée. - Créer une condition de vide à l'aide d'une seringue de 10 ml pour gonfler le poumon, comme le montre la figure 2.
- Insérer une canule (20 G) dans la trachée et nouer un noeud.
- Gonflez le poumon avec des agents de fixation pour vérifier les fuites, à l'aide d'une seringue de 1 ml.
- Transfert à l'équipement de pression de fixation pulmonaire, comme illustré à la figure 3.
- Après les périodes de fixation, retirez l'échantillon de poumon liant la trachée avec un noeud.
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Representative Results
Tel que décrit précédemment, l'équipement spécialisé, qui génère une pression constante prolongée, peut être divisé en trois parties (figure 3A). La partie inférieure est le point où insérer l'échantillon pulmonaire (Figure 4A). Le poumon est relié par une canule (20 G) à la pointe de l'écoulement formalin à l'aide d'une bite d'arrêt à trois voies (Figure 4B). La pression est générée à partir des différents niveaux de surface des agents de fixation entre les conteneurs inférieurs et supérieurs (figure 5). La différence de pression est de 25 cmH2O; cependant, à l'aide du bouton d'ajustement de hauteur, la pression peut être ajustée dans la plage de 25 à 30 cmH2O (Figure 5). Une pompe relie les contenants inférieurs et supérieurs par l'intermédiaire de tubes (Figure 3A),préservant une différence de 25 cm dans la fixation de la hauteur de surface de l'agent. La direction du flux d'agent est décrite à la figure 3B.
Présenté ensuite est un résultat représentatif des résultats histologiques dans le poumon, suivant 48 h de fixation. Des souris mâles de six mois de SMP30-KO ont été exposées à la fumée de cigarette ou à l'air frais (comme commande) pendant 8 semaines. Les deux spécimens de tissu ont été souillés avec l'hématoxylin et l'éosine. Figure 6 A montre les résultats histologiques des souris exposées à l'air, qui n'ont pas montré l'élargissement marqué de l'espace aérien. En revanche, la figure 6B révèle un élargissement important de l'espace aérien et la destruction des parois alvéolauriennes chez les souris qui ont été exposées à la fumée chronique de cigarette.
Les interceptions linéaires moyennes (MLI) ont été déterminées selon la méthode décrite par Thurlbeck et al. 20 pour accéder à la taille de l'espace aérien. L'indice destructeur (DI) a été déterminé pour évaluer la destruction de la paroi alvéolifère selon la méthode décrite par Saetta et al. 21. Ces examens morphométriques du spécimen pulmonaire ont révélé que le DI et le MLI étaient significativement plus élevés chez les souris SMP30-KO exposées à la fumée que chez les souris exposées à l'air(figure 6C,D).
Figure 1 : Exsanguination pulmonaire. Une canule a été insérée à l'endroit du ventricule droit et dirigée à l'artère pulmonaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Inflation pulmonaire des seringues à vide. État de vide à l'intérieur de la seringue de 10 ml contenant des agents de fixation pour gonfler les poumons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Matériel de fixation pulmonaire. (A) L'équipement en acrylique a permis à une différence de pression de 25 cmH2O de gonfler les poumons en continu pendant 48 h, à l'aide d'une pompe. (B) La direction du flux de l'agent de fixation est indiquée par des flèches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Conteneur inférieur. (A) Le spécimen de poumon de souris a été placé à l'intérieur des agents de fixation dans le récipient inférieur. (B) À l'intérieur du contenant inférieur, il y a une boîte de placement d'échantillon, au sommet de laquelle la formaline coule à travers un robinet d'arrêt à trois voies et la canule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Bouton d'ajustement du récipient supérieur et de la hauteur. Le conteneur supérieur a généré une pression de 25 cmH2O. Il y a deux paires de boutons d'ajustement de hauteur qui peuvent être employés pour ajuster la hauteur du récipient supérieur ; par conséquent, la pression générée peut être fixée dans la fourchette de 25 à 30 cmH2O. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Résultats histologiques et morphométriques de poumon de souris. Images histologiques représentatives des sections de poumon des souris SMP30-KO exposées à la fumée de cigarette de 8 semaines ou exposées à l'air (6 mois, mâle), tachées d'hématoxylin-éosine. Barre d'échelle de 100 m. (A) Le groupe exposé à l'air n'a pas montré d'élargissement significatif ou d'autres résultats. (B) Le groupe exposé à la fumée de cigarette a montré l'élargissement marqué de l'espace aérien et la destruction des murs alvéolaux. (C) Les interceptions linéaires moyennes (MLI). Dans les poumons des souris exposées à la fumée de cigarette, mLI était sensiblement plus grand que les souris air-exposées ('p 'lt; 0.001). (D) L'indice destructeur (DI). Dans les poumons des souris exposées à la fumée de cigarette, le DI a été sensiblement augmenté par rapport aux poumons des souris exposées à l'air (p 'lt; 0.001). Les valeurs sont présentées comme moyennes et SD (n ' 6 pour chaque groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La procédure de fixation pour les poumons de rongeurs présentée ici n'est pas nouvelle; cependant, ce système présente plusieurs avantages. Tout d'abord, il peut fixer de nombreux poumons (maximum de 20) avec la même condition à la fois. La Society of Toxicologic Pathology affirme que la pression pour l'instillation de la gravité varie de 22 à 25 cmH2O22. Notamment, plusieurs études ont effectué la fixation pulmonaire à une pression de 25 cmH2O13,19,23,24,25,26,27 , qui a été adopté dans notre laboratoire en utilisant le système actuel12,15,16,17,18.
Deuxièmement, il peut fixer les tissus pulmonaires à une pression constante pendant diverses périodes de temps. Dans notre laboratoire, les échantillons de poumon sont habituellement fixés pour 48 h. Beaucoup d'investigateurs emploient une période relativement courte de temps (par exemple, 5-20 min)13,28,29,30,31,32, puis attacher le poumon gonflé et immerger dans formaline pendant de longues périodes comme désiré. Il n'y a pas de données ou de recherche indiquant une norme d'or pour la durée de la fixation pulmonaire. Toutefois, la déclaration de l'American Thoracic Society (ATS)/European Respiratory Society (ERS) décrit la « norme d'argent », dans laquelle la pression d'inflation des voies respiratoires doit être maintenue pendant au moins 24 h14. La Société japonaise de pathologie a également recommandé des temps de fixation de pas plus d'une semaine pour produire des diapositives immunohistochimiques cohérentes; bien que leur recommandation soit fondée sur l'analyse à l'aide de spécimens humains33. Les périodes de fixation relativement courtes peuvent ne pas s'appliquer au système actuel, car chaque échantillon est censé être placé individuellement dans le conteneur inférieur. Il s'agit d'une limitation du système actuel. En conclusion, la durée appropriée de la fixation du poumon de la souris demeure inconnue.
Les étapes critiques de cette méthode sont liées au risque de fuite de formaline pulmonaire pendant le processus de fixation formaline. Les fuites de formaline pulmonaire peuvent entraîner un rétrécissement de la taille pulmonaire. Ce risque peut être divisé en deux parties. La première partie se produit pendant l'étape de sacrifice. Lors de l'ouverture de la cage thoracique, il est important de ne pas causer de blessures à la surface pulmonaire. La clé de la prévention est d'aborder cela à partir du diaphragme et de continuer à couper la cage thoracique thoracique après que le poumon est détaché de la pleura pariétale. Cette méthode évite les lésions pulmonaires causées par l'équipement chirurgical. Une autre étape clé se produit lors de l'attachement de la bronche principale droite. Il est important d'identifier les lobes droits de la souris. Placer les poumons dans une position où ils peuvent être vus à partir d'une vue dorsale permet d'identifier plus facilement l'emplacement des poumons.
La deuxième partie est pendant le processus de fixation pulmonaire à l'aide d'équipement spécialisé. Une étape critique se produit lors de l'insertion du spécimen pulmonaire dans le port de formaline du conteneur inférieur. Il convient de confirmer que l'insertion est étroitement fixée pour empêcher le détachement de spécimen de poumon du port de formalin pendant le processus constant de pressurisation. Un autre aspect à mettre en évidence est la connexion de tubes entre les trois parties de l'équipement spécialisé (conteneur inférieur, conteneur supérieur, et la pompe). Toutes les connexions de tube doivent être étroitement reliées. En cas de fuite, le volume de formaline dans le récipient supérieur diminuera, réduisant ainsi la pression constante.
Selon les recommandations de la Société de pathologie toxicologique, l'instillation intratrachéale de la formaline présente des avantages pour le modèle pulmonaire des rongeurs, qui l'emporte sur ses inconvénients22. Ils ont suggéré l'utilisation d'une méthode de fixation formaline intratracheal en effectuant des études quantitatives de la morphométrie pulmonaire alvéolaire. L'instillation intratrachéale des poumons présente deux avantages, dont la préservation des voies respiratoires et de la paroi alvéolifière, ainsi que la visualisation du parenchyme pulmonaire22. Une étude de Braber et coll. a révélé que la méthode d'instillation de formaline intratrachéale est supérieure en termes de préservation de la structure pulmonaire par rapport à l'inflation sous vide et aux méthodes de perfusion du corps entier13. La méthode actuelle utilise l'instillation intratrachéale dans un modèle de souris pour optimiser la visualisation de la zone alvéolaire.
En ce qui concerne les agents de fixation, 10% de formaline, qui contient du formaldéhyde, est traditionnellement utilisé. Le formaldéhyde est largement utilisé comme agent de fixation pour les études immunopathologiques, car il ne détruit pas complètement l'immunogénicité des protéines. Toutefois, l'énoncé ATS/ERS ne recommande pas la fixation de la formaline, car il ne stabilise pas adéquatement la structure tissulaire14. Le glutaraldéhyde est recommandé pour l'instillation des voies respiratoires à la place; cependant, il est sujet à détruire l'immunogénicité de protéine, qui a comme conséquence un agent fixant inadapté pour l'immunohistochimie. Plusieurs éléments de preuve ont indiqué que les poumons fixes peuvent être fournis pour l'évaluation morphométrique (p. ex., interceptions linéaires moyennes, surface interne et indice destructeur) après fixation formaline à l'aide du système de fixation actuel12 , 15 Annonces , 16 Annonces , 17 Annonces , 18. Certes, le glutaraldéhyde peut être adopté pour le système actuel; ainsi, les chercheurs peuvent choisir les deux agents dans le système actuel en fonction des besoins expérimentaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont pas d'intérêts concurrents à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) et l'Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception des méthodes actuelles et dans l'écriture du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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