Summary
Un protocole d’enquêter sur les premiers effets de β amyloïde (Aß) dans le cerveau est présenté ici. Cela montre que le bêta-amyloïdes induit endocytose clathrine et effondrement des cônes de croissance axonale. Le protocole est utile dans l’étude des effets précoces de bêta-amyloïdes sur les cônes de croissance axonale et peut-être faciliter la prévention de la maladie d’Alzheimer.
Abstract
Β amyloïde (Aß) provoque des troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer (ma). Bien que thérapeutique ont été montré pour réduire les concentrations de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de ma, ceux-ci ne s’améliorent pas les fonctions de mémoire. Regroupe les bêta-amyloïdes dans le cerveau avant l’apparition de troubles de la mémoire, ciblage Aβ peut être inefficace pour le traitement des patients atteints de ma qui présentent déjà des déficits de mémoire. Par conséquent, signalisation en aval en raison des dépôts de Aβ doit être bloquée avant le développement de l’AD. Aβ induit une dégénérescence axonale, conduisant à la perturbation des réseaux de neurones et de troubles de la mémoire. Bien qu’il existe beaucoup d’études sur les mécanismes de toxicité Aβ, la source de bêta-amyloïdes toxicité reste inconnue. Pour aider à identifier la source, nous proposons un protocole novateur qui utilise la microscopie, transfection du gène et imagerie afin d’étudier les changements précoces causées par les bêta-amyloïdes dans les cônes de croissance axonale des neurones en culture de cellules vivantes. Ce protocole a révélé que Aβ induite par endocytose clathrine dans les cônes de croissance axonale suivie d’effondrement de la croissance de cône, ce qui démontre que l’inhibition de l’endocytose empêche toxicité Aβ. Ce protocole sera utile pour étudier les premiers effets de la bêta-amyloïdes et peut conduire à un traitement plus efficace et préventif AD.
Introduction
Dépôts d’amyloïde-β (Aβ) sont trouvent dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (ma) et sont considérés comme une cause essentielle de AD1 qui perturbent les réseaux neuronaux, conduisant à une déficience de mémoire pour2,3,4. De nombreux candidats-médicaments cliniques montrent à prévenir efficacement la production de β amyloïde (Aß) ou éliminer les dépôts de bêta-amyloïdes. Toutefois, aucun ont réussi à améliorer la fonction de mémoire dans AD patients5. Aβ est déjà déposé dans le cerveau avant l’apparition de déficiences de mémoire6; par conséquent, baisse des niveaux de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients présentant troubles de la mémoire peuvent être inefficaces. Dépôts d’Aβ sont présent dans Alzheimer préclinique ; Toutefois, ces patients présentent rarement neuronale dégénérescence et la mémoire déficits6. Il y a un décalage entre les dépôts de bêta-amyloïdes et troubles de la mémoire. Par conséquent, une stratégie essentielle pour la prévention des AD bloque toxicité Aβ signalisation durant les premiers stades de l’AD, avant l’apparition de déficits de mémoire. Dépôts d’Aβ induit axon dégénérescence7,8,9,10,11,12,13, qui peut conduire à une perturbation du réseaux de neurones et une déficience permanente d’une fonction mémoire. De nombreuses études ont étudié les mécanismes de la toxicité de l’Aß ; par exemple, les axones dégénérées de cerveaux de souris ont démontré avoir augmenté autophagie14. Activation de la calcineurine a été signalée comme un éventuel mécanisme de la dégénérescence axonale induite par l’Aß15; Cependant, la détente directe d’une dégénérescence axonale reste inconnue.
Cette étude se concentre sur l’effondrement des terminaisons axonales appelé cônes de croissance. L’effondrement des cônes de croissance axonale peut être causée par les répulsifs croissance axonale, type sémaphorine-3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Terminaisons axonales dystrophiques effondrement semblable ont été observées dans le cerveau des AD patients21,22. En outre, une défaillance du fonctionnement de cône de croissance peut provoquer une dégénérescence axonale23. Cependant, on ne sait pas si Aβ induit effondrement de cône de croissance. Par conséquent, cette étude présente un nouveau protocole pour observer les premiers effets de la bêta-amyloïdes dans les neurones en culture et enquêter sur effondrement de cône de croissance induite par l’Aß.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire au Campus de l’Université de Toyama Sugitani et ont été approuvés par le Comité pour animalier et Use of Laboratory Animals au Sugitani Campus de la Université de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. effondrement Assay
- Revêtement poly-D-lysine
- Enrober les lames de 8 puits de culture avec 400 ml de 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Enlever la solution de la PDL et laver les puits 3 fois avec de l’eau distillée.
- Neurone culture24
- Émincer fraîchement isolées des cortex cérébraux de souris de ddY (E14) 14 de jour embryonnaire avec microciseaux dans le milieu de culture de neurones contenant 12 % de sérum de cheval, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (A moyen). N’ajoutez pas d’antibiotiques.
Remarque : Dans le présent protocole, la souris ddY est utilisée. Il s’agit d’une souche non consanguine couramment utilisée au Japon. Ce protocole de culture de neurones peut être également appliqué pour rat neurones corticaux7,25. - Centrifuger les tissus à 87 g pendant 3 min.
- Retirez le surnageant. Puis au culot, ajouter 2 mL de trypsine de 0,05 % et incuber pendant 15 min à 37° C. Mélanger en tapant toutes les 5 min.
- Ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
- Centrifuger les tissus à 178 x g pendant 3 min.
- Retirez le surnageant et incuber les tissus avec 600 U/mL DNase I et inhibiteur trypsique du soja 0,3 mg/mL dissous dans du PBS pendant 15 min à 37 ° C. Mélanger en tapant toutes les 5 min.
- Après incubation, ajouter 4 mL de milieu A et mélanger en tapotant.
- Centrifuger les tissus à 178 x g pendant 3 min.
- Après avoir retiré le surnageant, ajouter 4 mL de milieu A et triturer les tissus avec une pipette Pasteur polie.
- Filtrer les tissus triturés avec une maille de pores de 70 µm. Après filtration, calcul de la densité des cellules avec un hémocytomètre.
- Culture les cellules dans la culture de 8 puits glissant à 0,8 x 104 cellules/puits avec support A et leur maintiennent dans un incubateur à CO2 avec une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C.
- Après 4 h de culture, remplacer le milieu de culture pour un supplément de 2 % contenant de culture neuronale, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (moyen B).
NOTE : La pureté des neurones était d’environ 75 %, comme décrit plus haut26.
- Émincer fraîchement isolées des cortex cérébraux de souris de ddY (E14) 14 de jour embryonnaire avec microciseaux dans le milieu de culture de neurones contenant 12 % de sérum de cheval, 0,6 % de glucose et 2 mM de L-glutamine (A moyen). N’ajoutez pas d’antibiotiques.
- Effondrement de dosage27
- Dissoudre commercialement obtenu pleine longueur amyloïde β1-42 (Aβ1-42) dans l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après l’incubation, stocker la solution Aβ1-42 agrégée dans un congélateur à-30 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : Cette incubation est nécessaire pour l’agrégation et la toxicité de l’Aß27,28,29,30. - Après 4 jours de culture neuronale, traiter les puits avec 100 μL de nouveau moyen B, contenant 0,5 μM agrégées Aβ1-42 ou véhicule solution (eau distillée) pendant 1 h.
NOTE : Effets de Aβ1-42 ont été manière dose-dépendante a augmenté de 0,1 à 5 μM et a atteint 0,5 μM comme décrit plus haut27. Des résultats similaires peuvent être observés lorsque par traitement Aβ1-42 pendant 1 h après 3 jours de culture neuronale31. - Enlever le milieu de culture et immédiatement fixer les neurones avec 4 % de paraformaldéhyde contenant 4 % de sucrose dans du PBS pendant 1 h à 37 ° C sur une plaque chauffante.
- Après fixation, laver les neurones 3 fois avec du PBS et fixez-les avec un milieu de montage aqueux. Sécher le milieu de montage à 4 ° C pendant 2 à 4 jours.
- Capturez toute la zone (7,8 x 9 mm2) de chaque puits avec un 20 X objectif sec sur un microscope inversé.
- Classer les neurites plus longues de chaque neurone dans étape 3 ou 4 selon les axones, comme décrit précédemment32,33.
- Classer les cônes de croissance selon les critères suivants : les cônes de croissance 1) axonale manque lamellipodia ou 2) possédant moins de trois filopodes sont considérés comme s’est effondré de cônes de croissance, comme décrit plus haut17.
Remarque : Les cônes de croissance saine sont marqués comme point 0 ; cônes de croissance réduite sont marqués comme 1 point. Veux dire effondrement scores sont calculés pour chaque traitement.
- Dissoudre commercialement obtenu pleine longueur amyloïde β1-42 (Aβ1-42) dans l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après l’incubation, stocker la solution Aβ1-42 agrégée dans un congélateur à-30 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. amyloïdes β Immunostaining
- La culture de neurones corticaux de souris pendant 3 jours, tel que décrit à l’étape 1.2.
- Traiter avec agrégées Aβ1-42 (5 μM) ou d’un véhicule pendant 4 h à 37 ° C dans un incubateur à CO2 .
- Sans enlever le support, ajouter un volume égal de 4 % de paraformaldéhyde contenant 4 % de sucrose dans du PBS à chaque puits et maintenir la culture à 37 ° C sur une plaque chauffante pendant 5 min.
- Remplacer la solution avec 400 ml de paraformaldéhyde à 4 % contenant 4 % de sucrose dans du PBS et maintenir à 37 ° C sur la plaque chauffante pendant 1 h. Ce protocole de fixation a été modifié d’un précédent rapport34.
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
- Bloc avec 5 % de sérum de chèvre normal dans du PBS.
- Incuber les neurones avec l’immunoglobuline anti-amyloide β souris G (IgG) (01:50) et 1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS à 4 ° C jusqu’au lendemain.
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
- Incuber les neurones avec un anticorps secondaire conjugué fluorescence (1 : 400) et 1 % d’albumine sérique bovine dans du PBS à température ambiante pendant 2 h.
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS et fixez-les avec un milieu de montage aqueux.
- Capturer des images de fluorescence et des images de champ lumineux avec éclairage oblique en utilisant une lentille d’objectif sec 40 X microscope inversé B.
3. axones Immunostaining27
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS après fixation des neurones cultivés, comme indiqué au point 1.3.3.
- Incuber les neurones avec souris anti-tau-1 IgG (1/500), protéine associée de anti-microtubules lapin 2 (MAP2) IgG (1/500) à 5 % de sérum de chèvre normal et 0,3 % t- octylphenoxypoly-éthoxyéthanol dans du PBS à 4 ° C durant la nuit.
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS.
- Incuber les neurones avec l’anticorps secondaires conjugué à fluorescence (1 : 400) et 0,3 % t- octylphenoxypolyethoxyethanol dans du PBS à température ambiante pendant 2 h.
- Laver les neurones 3 fois avec du PBS et monter à l’aide d’un support de montage aqueux.
- Capturer des images de contraste (DIC) interférences fluorescence et différentiel en utilisant un objectif de 20 × sec a microscope inversé.
4. vivre la cellule imagerie27
- Enrober les plats à base de verre avec 500 μL de PDL (5 μg/mL), comme indiqué au point 1.1.1.
Remarque : Dans le présent protocole, des plats à base de verre ont été utilisés. Plats à base de verre disponibles dans le commerce utilisable aussi pour l’imagerie live. Des plats à base de verre ont été établis comme suit : 1) faire un trou environ 1,4 mm de diamètre dans le centre d’un plat de 35 mm avec un coup de main et 2) Fixez une lamelle de verre (diamètre de 22 mm) à l’arrière du plat avec du silicone. - Laver les plaques avec de l’eau distillée, comme indiqué au point 1.1.2 et la culture des neurones corticaux dans le plat à base de verre à 3 x 104 cellules/plat avec A moyen, tel que décrit à l’étape 1.2.
- Après 4 jours de culture cellulaire, remplacer le support avec 2 mL de milieu nouveau B et le transfert le plat au microscope Maintain a inversé la culture dans une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C.
5. l’endocytose Experiment
- La culture des neurones corticaux de souris comme indiqué au point 1.2.
- Quatre jours plus tard, remplacez le support par 100 μL de nouveau média B contenant 20 sonde de membrane de fluorescence μM pendant 1 min.
- Ajouter 1 μL de 0,05 mM agrégées Aβ1-42 (final 0,5 μM) ou solution de véhicule (eau distillée) et mélanger en pipettant également. Incuber pendant 20 min.
- Retirez le support et laver les puits deux fois avec support B qui a été préchauffé à 37 ° C.
- Difficulté, laver et monter les neurones comme décrit aux points 1.3.3 et 1.3.4.
- Capturer des fluorescentes et images DIC avec un 63 X huile objectif microscope inversé a.
- Quantifier la densité de la zone de sonde séropositifs fluorescence membranaire dans chaque cône de croissance saine à l’aide d’un logiciel d’image.
6. Transfection du gène
- Préparer les neurones corticaux tel que décrit à l’étape 1.2. Après avoir complété les étapes 1.2.1 à 1.2.10, centrifuger les neurones à 178 x g pendant 3 min.
- Retirer le surnageant, ajouter 4 mL de Ca2 +-libre et Mg2 +-gratuit solution saline équilibrée de Hanks (FMC-HBSS) et la composition de pipetage.
- Centrifuger les cellules à 178 x g pendant 3 min.
- Retirez le surnageant et ajouter 4 mL de FMC-HBSS mélanger par pipetage. Puis, calculez la densité cellulaire, comme indiqué au point 1.2.10.
- Transférer 5 x 106 cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 677 x g pendant 1 min.
- Retirez le surnageant, ajouter 100 μL de solution de transfection avec supplément et 3 μg de plasmides d’ADN codant EGFP ou EGFP-AP180 C-terminale et la composition de pipetage.
- Transférer la solution ci-dessus (point 6.6) dans une cuvette certifiée et transfecter avec un électroporateur, selon le protocole du fabricant.
- Immédiatement après la transfection, ajouter 500 μl de milieu A dans la cupule et transvaser la solution dans un tube de 1,5 mL avec une pipette certifié. Puis, calculez la densité cellulaire, comme indiqué au point 1.2.10.
- Culture de cellules d’une lame de 8 puits de culture à 0,8 x 104 cellules/puits, comme indiqué aux paragraphes 1.2.11 et 1.2.12.
- Après 4 jours de culture cellulaire, effectuer un dosage de l’effondrement comme indiqué au point 1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans ce protocole, Aβ1-42 est incubé à 37 ° C pendant 7 jours avant de l’utiliser, parce que l’incubation de Aβ1-42 était nécessaire pour produire des formes toxiques27,28,30,35. Après l’incubation, formes globales d’Aβ ont été observés (Figure 1 a). Il a été signalé que l’incubation similaire de Aβ1-42 produit la forme de fibrilles d’Aβ36. Après le traitement avec cette agrégée Aβ1-42, immunomarquage avec un anticorps pour l’oligomère toxique d’Aβ35,37 a été réalisée, et une coloration positive a été détectée sur les neurones en culture (Figure 1 b). Compte tenu de ce qui précède, le présent protocole d’incubation a produit les formes toxiques de bêta-amyloïdes.
Plusieurs jours ont été nécessaires pour l’induction de la dégénérescence axonale après exposition Aβ. Les événements antérieurs à une dégénérescence axonale demeurent incertains. Par conséquent, ce protocole a été élaboré pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. Utilisant ce protocole, les phénomènes précoces induites par le traitement de bêta-amyloïdes ont été analysés. Les neurones corticaux ont été cultivés pendant 4 jours. Les neurites plus longues dans les neurones en culture ont été identifiés comme les axones ; ceux-ci ont été confirmés par immunomarquage positif pour le marqueur axonale, tau-1 et immunostaining négatif pour le marqueur dendritique, MAP2 (Figure 2). Après 1 h de traitement de véhicule, cônes de croissance avaient réparties lamellipodia et traitées plusieurs filopodes. Ceux-ci ont été identifiés comme des cônes de croissance saine. À l’inverse, 1 h de traitement Aβ1-42 a conduit à des cônes de croissance réduite, qui ne développé aucun lamellipodia ou filopodes. Ceux-ci ont été identifiés comme des cônes de croissance s’est effondré. Effondrement a été calculé comme indiqué au point 1.3.7. Lorsque les formes des cônes de croissance ne sont pas clairs, ils ont été éliminés de l’analyse. Aβ1-42 traitement a conduit à une augmentation significative dans la partition de l’effondrement, correspondant augmenté l’effondrement de la croissance axonale, par rapport à la partition de l’effondrement des cônes de croissance imprégnées de véhicule27.
Les cônes de croissance axonale ont été observées avant et après traitement avec Aβ1-42 (Figure 3). Les cellules ont été maintenues dans le microscope inversé avec une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C. Des images ont été capturées toutes les 5 min. Tel qu’illustré à la Figure 3, les cônes de croissance s’est effondrée entre 21 et 26 min après traitement Aβ1-42. Cônes de croissance ont été exclus de l’imagerie de cellules vivantes si elles n’ont pas conservé leur forme saine pendant 1 h avant tout traitement.
Pour visualiser les premiers effets de Aβ1-42-traitement, endocytose a été utilisé que l’objectif de cette analyse, parce que les inhibiteurs de l’endocytose peuvent bloquer conique à croissance induite par l’Aβ1-42 effondrement27. Endocytose a été visualisée avec une sonde de membrane de fluorescence (i.e., un colorant fluorescent qui se lie à la membrane plasmique et est spontanément mégacaryocyte). Une étude antérieure a montré que les cônes de croissance ne pas s’effondrer à 20 min après Aβ1-42-traitement27; par conséquent, les cônes de croissance saine ont été sélectionnés par DIC imagerie en véhicule Aβ1-42-traités ou cellules après 20 min. Après Aβ1-42-traitement, nombreux examen de sonde séropositifs membranaires fluorescents ont été observés dans le cône de croissance (Figure 4). La densité de fluorescence membranaire sonde séropositifs examen dans les cônes de croissance était significativement accru27. Ceci suggère qu’endocytose de cône de croissance induite par l’Aβ1-42 se produit avant l’effondrement.
Pour confirmer le rôle de l’endocytose, un plasmide d’ADN codant EGFP-AP180 C-terminus a été transfecté dans des neurones corticaux cultivés. Les cellules exprimant l’extrémité C-terminale du AP180 sélectivement inhibées endocytose clathrine38,,39. Si expression EGFP a été observée dans le corps cellulaire dans le neurone, l’extrémité C-terminale du AP180 était censé être exprimée dans le cône de croissance axonale du neurone. Transfection du AP180 C-terminus bloqué la croissance induite par l’Aβ1-42 cône effondrement (Figure 5)27.
Figure 1 : Incubation des A Β1-42 agrégats Aβ. (A) Aβ1-42 a été dissous dans l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incubés à 37 ° C pendant 7 jours (après incubation) ou conservés à-30 ° C sans incubation (pas d’incubation). Chaque solution Aβ a été diluée à 0,1 mM ; puis, 10 μL de chaque solution diluée était tombé sur lames de verre et recouvert de lamelles couvre-objet. Images de champ lumineux avec éclairage oblique ont été capturés à l’aide de microscope inversé B. échelle bar = 20 μm. (B) le traitement groupé Aβ1-42 ou véhicule sur des neurones cultivés pendant 4 h. Après le traitement, les neurones ont été fixés et immunocolorées pour des oligomères bêta-amyloïdes toxiques. Images de fluorescence (rouge) et des images de champ lumineux avec éclairage oblique (gris) sont indiqués. Echelle = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : A Effondrement de cône de croissance axonale induite par β1-42. Après Aβ1-42 - ou véhicule-traitement, neurones ont été fixés et immunomarquage pour tau-1 (rouge) et les microtubules associated protein 2 (MAP2, vert). Fluorescence et différentiel interférences contraste (DIC) images sont affichées. Vue agrandie des régions d’intérêt (ROI, rectangles) figurent ci-dessous leurs images correspondantes. Blanc de barreaux d’échelle = 50 μm ; échelle noire = 10 μm. Ce chiffre a été modifié de Kuboyama et al., 201527. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Live imagerie cellulaire avant et après une Traitement β1-42. Après 4 jours de culture, les cellules sont transférées à un microscope inversé et DIC images ont été capturées chaque 5 min. Time-lapse images sont affichées. Les chiffres représentent les minutes : secondes après l’application d’agrégés Aβ1-42 (concentration finale, 0,5 μM). Echelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vingt minutes de A Traitement β1-42 induite par endocytose. Les neurones corticaux sont cultivés pendant 4 jours et traitement avec une sonde de membrane de fluorescence. Ensuite, les neurones ont été traités pendant 20 min avec Aβ1-42 ou véhicule. Image de fluorescence des cônes de la croissance sont affichées. Les lignes en pointillés jaunes représentent les contours des cônes de la croissance. Echelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expression du terminus AP180-C bloque effondrement induite par Aβ1-42. Quatre jours après la transfection d’EGFP (A, B) ou EGFP-AP180 C-terminale (C, D) ; Aβ1-42 (B, D) ou un véhicule (A, C) a été ajouté à des neurones corticaux pendant 1 h. DIC (panneaux supérieurs) et images de fluorescence (panneaux inférieurs) sont affichées. Les flèches indiquent les cônes de croissance. Barreaux de l’échelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le protocole décrit dans la présente étude a permis l’observation de phénomènes précoces dans les cônes de croissance axonale après traitement Aβ1-42. Aβ1-42 induite par endocytose dans les cônes de croissance axonale dans les 20 min et effondrement de cône de croissance a été observée dans 1 h de traitement. Cette endocytose a été probablement véhiculée par la clathrine. En utilisant ce protocole, l’inhibition de l’endocytose clathrine a été confirmée pour empêcher l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-42 et la dégénérescence axonale dans les neurones en culture27. En outre, l’inhibition de l’endocytose clathrine atténuée Aβ1-42-induit une dégénérescence axonale et déficits de la mémoire en vivo27. Ces résultats indiquent qu’endocytose clathrine est une thérapeutique prometteuse pour la prévention de l’AD.
Ce protocole a été mis au point de s’effondrer dosages pour les répulsifs croissance axonale, tels que sémaphorine 3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Essais de l’effondrement ont été utilisés dans les études évaluant le développement des réseaux neurones. J’ai montré que ce protocole peut être appliqué à des analyses pathologiques, en particulier celles impliquant des mécanismes d’AD ; Toutefois, une limite peut être qu’environ 40 % des cônes de croissance s’est effondrée dans l’état sain. Ce pourcentage est plus élevé que les résultats de neurones des ganglions spinaux cultivées, qui sont plus couramment utilisés dans l’effondrement dosages16,17,18,19,20. Par conséquent, la différence de types de cellules pourrait être liée aux différences dans les ratios de l’effondrement. Les ratios de l’effondrement constatés dans cette étude étaient conformes à ceux trouvés dans les études antérieures sur les neurones corticaux cultivés normal40,41. En outre, Aβ1-42 induit des niveaux similaires de l’effondrement de cône de croissance par rapport aux autres facteurs de l’effondrement, comme sémaphorine 3 a et éphrine-A527. Par conséquent, ce protocole est valable pour la quantification de l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-42. Ce protocole de fixation est important pour conserver la forme des cônes de croissance. Si les cellules ont été conventionnellement fixées avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante, les cônes de croissance plus peuvent se sont effondrées en raison de la procédure de fixation (données non présentées). Alternativement, glutaraldéhyde et fixation tampons sont disponibles pour la fixation rigide, comme décrit précédemment42; Toutefois, le glutaraldéhyde pièces autofluorescence, qui est un obstacle important pour l’imagerie de fluorescence.
Une étude récente avec le même protocole a montré que l’eau extrait de Radix Polygalae (racines de Polygala tenuifolia) inhibe l’endocytose Aβ1-42-induit dans les neurones en culture a empêché une dégénérescence axonale et réduit les déficits de mémoire dans un modèle de souris transgénique de AD31. Un candidat pour la prévention de l’AD a été trouvé avec ce protocole. Une combinaison de transfection du gène et l’imagerie de cellules vivantes dans le présent protocole peut faire apparaître les autres événements cellulaires trouvés dans les axones et leurs terminaux, avant et après traitement de bêta-amyloïdes, telles que Ca2 + imagerie dynamique des microtubules et dynamique d’adhérence cellulaire, qui sont la croissance auraient été liés à axonale43,44,45. Ce protocole peut aider à révéler plus détaillée des mécanismes de toxicité Aβ et peut aider à mener à la prévention et/ou le traitement de la ma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement pris en charge par des subventions de recherche du JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japon, Takeda (FNS), le Japon et Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P.
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
