Summary
本文介绍了一种研究淀粉样蛋白β (Aβ) 在脑内早期作用的实验方案。 这表明 Aβ诱导网格蛋白介导的内吞和轴突生长锥的崩溃。该协议有助于研究 Aβ对轴突生长锥的早期影响, 并可促进预防阿尔茨海默病。
Abstract
淀粉样蛋白β (Aβ) 导致阿尔茨海默病 (AD) 的记忆力受损。虽然治疗已被证明减少 Aβ水平在 AD 患者的大脑, 这些不改善记忆功能。由于 Aβ在大脑出现记忆障碍之前聚集在脑中, 针对 Aβ可能对已经出现内存不足的 AD 患者的治疗效率低下。因此, 在 AD 开发之前, 应阻止 Aβ沉积引起的下游信令。Aβ诱导轴突变性, 导致神经元网络的中断和记忆障碍。虽然对 Aβ毒性机理有许多研究, 但 Aβ毒性的来源尚不得而知。为了帮助识别来源, 我们提出了一种新的协议, 使用显微学, 基因转染和活细胞成像来研究 Aβ在培养神经元轴突生长锥中引起的早期变化。该协议揭示了 Aβ诱导网格蛋白介导的内吞在轴突生长锥后的生长锥塌陷, 表明抑制内吞可防止 Aβ毒性。该协议将有助于研究 Aβ的早期影响, 并可能导致更有效和预防性的广告治疗。
Introduction
淀粉样β (Aβ) 沉积在阿尔茨海默氏病患者的大脑中被发现, 并且被认为是 ad1破坏神经元网络的一个关键原因, 导致记忆障碍2,3,4。许多临床药物候选者已被证明有效地防止淀粉样β (Aβ) 生产或去除 Aβ沉积物。然而, 没有人成功地改善了 AD 患者的记忆功能5。Aβ在记忆障碍发生前已经存入大脑6;因此, 降低记忆力受损患者大脑中的 Aβ水平可能无效。Aβ沉积在临床前 AD 患者中存在;然而, 这些患者很少出现神经元变性和记忆缺陷6。Aβ沉积与记忆损伤之间存在时间滞后。因此, 防止广告的关键策略是在广告的早期阶段阻断 Aβ毒性信号, 在内存赤字发展之前。Aβ沉积诱发轴突变性7,8,9,10,11,12,13, 这可能导致中断神经网络和记忆功能的永久性损伤。许多研究已经研究了 Aβ毒性的机制;例如, AD 小鼠大脑的退化轴突已被证明有增加自噬14。钙调素激活已被报告为 Aβ诱发的轴突变性15的可能机制;然而, 直接触发轴突变性仍然未知。
这项研究的重点是轴突末端称为生长锥的崩溃。轴突生长锥的崩溃可能是由轴突生长驱蚊引起的, 如 semaphorin-3A 和 ephrin-A516、17、18、19、20。在 AD 患者的大脑中观察到类似塌陷的营养不良轴突结局21,22。此外, 生长锥功能的失败可能引发轴突变性23。然而, Aβ是否诱发生长锥塌陷尚不得而知。因此, 本研究提出了一种新的实验方案, 观察 Aβ在培养神经元中的早期作用, 研究 Aβ诱导的生长锥塌陷。
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Protocol
所有实验均按照富山大学杉谷校区的实验室动物照料和使用指导方针进行, 并由杉谷校区动物护理和实验室动物使用委员会批准。富山大学 (A2014INM-1, A2017INM-1)。
1. 折叠试验
- 聚 d-赖氨酸涂层
- 大衣8井文化幻灯片与400微升5微克/毫升聚 d-赖氨酸 (PDL) 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和孵化他们在37摄氏度过夜。
- 卸下 PDL 解决方案, 用蒸馏水冲洗3次水井。
- 神经元培养24
- 从胚胎日 14 (E14) ddY 小鼠的新鲜分离的脑皮质, microscissors 在神经元培养基中含有12% 匹马血清、0.6% 葡萄糖和2毫米 l-谷氨酰胺 (中 A)。不要添加抗生素。
注意: 在本协议中, 使用 ddY 鼠标。这是日本普遍使用的炎症菌株。该神经元培养协议也可应用于大鼠皮层神经元7,25。 - 离心组织在 87 x g 3 分钟。
- 移除上清液。然后对颗粒, 添加2毫升0.05% 胰蛋白酶和孵育15分钟在37°c。每5分钟点击一次即可混合。
- 加入4毫升中 A 和混合通过攻丝。
- 离心组织在 178 x g 3 分钟。
- 除去上清液, 用600毫升 DNase I 和0.3 毫克/毫升大豆胰蛋白酶抑制剂在 PBS 中溶解15分钟, 在37摄氏度下孵育组织。每5分钟点击一次即可混合。
- 孵育后, 加入4毫升中 A 和混合通过攻丝。
- 离心组织在 178 x g 3 分钟。
- 除去上清液后, 加入4毫升中和颠倒组织与抛光巴斯德移液器。
- 用70µm 孔径网格过滤冲剂组织。过滤后, 用血细胞计数器计算细胞密度。
- 培养8井文化中的细胞在 0.8 x 104细胞/以及中等 a 和保持他们在 CO2孵化器与 10% CO2在37摄氏度的加湿气氛。
- 培养4小时后, 将培养基替换为神经元培养、0.6% 葡萄糖和2毫米 l-谷氨酰胺 (中 B) 的2% 补充剂。
注: 神经元纯度约为 75%, 如前26所述。
- 从胚胎日 14 (E14) ddY 小鼠的新鲜分离的脑皮质, microscissors 在神经元培养基中含有12% 匹马血清、0.6% 葡萄糖和2毫米 l-谷氨酰胺 (中 A)。不要添加抗生素。
- 折叠试验27
- 在蒸馏水中以 0.5 mM 的浓度溶解商业上获得的全长淀粉样β1-42 (Aβ1-42), 在37摄氏度孵育7天。孵化后, 将聚合的 Aβ1-42 溶液储存在-30 摄氏度的冰柜中, 直至使用。
注意: 这种孵化是必要的聚合和毒性的 Aβ27,28,29,30。 - 经过4天的神经元培养, 用100微升的新培养基 B 处理油井, 含有0.5 微米聚合 Aβ1-42 或汽车溶液 (蒸馏水) 1 小时。
注意: Aβ1-42 的影响是剂量依赖性从0.1 微米增加, 并在0.5 微米的峰值, 如前27所述。类似的结果可以观察时, 通过 Aβ1-42 治疗1小时后3天的神经元培养31。 - 去除培养基, 并立即修复神经元与4% 多聚甲醛含有4% 蔗糖在 PBS 1 h 在37摄氏度在一个热板上。
- 固定后, 用 PBS 洗涤神经元3次, 然后用水性安装介质安装。在4摄氏度干燥2–4天的安装介质。
- 在倒置显微镜下, 用20X 干燥物镜捕捉每个油井的整个区域 (7.8 x 9 mm2)。
- 将阶段3或4中每个神经元的最长突起分类为轴突, 如前面描述的32、33。
- 根据以下标准对生长锥进行分类: 1) 缺伪足或2的轴突生长锥被视为折叠生长锥, 如前17所述。
注: 健康生长锥评分为0分;折叠的生长锥被评分为1点。每种治疗均计算平均折叠得分。
- 在蒸馏水中以 0.5 mM 的浓度溶解商业上获得的全长淀粉样β1-42 (Aβ1-42), 在37摄氏度孵育7天。孵化后, 将聚合的 Aβ1-42 溶液储存在-30 摄氏度的冰柜中, 直至使用。
2. 淀粉样β免疫染色
- 培养小鼠皮层神经元3天, 如步骤1.2 所述。
- 使用聚合 Aβ1-42 (5 微米) 或4小时的车辆在 CO2孵化器中处理37摄氏度。
- 在不去除培养基的情况下, 在 PBS 中加入4% 多聚甲醛含有4% 蔗糖的同等体积, 并在热板上保持37摄氏度的培养基5分钟。
- 将溶液替换为400微升4% 多聚甲醛含有4% 蔗糖的 PBS, 并保持在37摄氏度的热板上 1 h。此固定协议已从上一份报告34修改。
- 用 PBS 洗涤神经元3次。
- 在 PBS 中与5% 正常山羊血清块。
- 在4摄氏度的 PBS 中, 用小鼠抗淀粉样蛋白β免疫球蛋白 G (IgG) (1:50) 和1% 牛血清白蛋白孵育神经元。
- 用 PBS 洗涤神经元3次。
- 用荧光共轭二抗 (1:400) 和1% 牛血清白蛋白在室温下孵育 2 h 的神经元。
- 使用 PBS 洗涤神经元3次, 并将其安装在水性安装介质中。
- 在倒置显微镜 B 上使用40X 干燥物镜捕捉荧光图像和具有倾斜光照的明亮场图像。
3. 轴突免疫染色27
- 在培养神经元固定后, 用 PBS 洗涤神经元3次, 如步骤1.3.3 所述。
- 用小鼠 anti-tau-1 igg (1:500)、兔抗微管相关蛋白 2 (MAP2) igg (1:500) 在5% 只正常山羊血清中孵育神经元, 在 PBS 中 0.3% octylphenoxypoly 乙醚在4摄氏度过夜。
- 用 PBS 洗涤神经元3次。
- 在室温下用荧光共轭二次抗体 (1:400) 和 0.3% toctylphenoxypolyethoxyethanol 孵育神经细胞2小时。
- 用 PBS 洗涤神经元3次, 使用水性安装介质进行安装。
- 在倒置显微镜上使用20×干物镜捕捉荧光和微分干扰对比度 (DIC) 图像。
4. 活细胞成像27
- 以500微升的 PDL (5 微克/毫升) 为基础的玻璃器皿, 如步骤1.1.1 中所述。
注意: 在本协议中, 使用了自制的玻璃基餐具。市面上可用的玻璃餐具也可用于现场成像。自制的玻璃餐具的制作方法如下: 1) 在35毫米碟的中心用手冲孔约1.4 毫米直径, 2) 用硅胶将玻璃盖玻片 (直径22毫米) 贴在盘子的背面。 - 如步骤1.1.2 所述, 用蒸馏水洗涤盘子, 并在 3 x 104细胞/盘子中以培养基 A 培养皮层神经元, 如步骤1.2 所述。
- 经过4天的细胞培养后, 用2毫升新培养基 B 取代培养基, 并将盘子转移到倒置显微镜 a. 在 10% CO2的湿化气氛中保持培养基37摄氏度。
5. 内吞实验
- 如步骤1.2 所述, 培养小鼠皮层神经元。
- 四天后, 更换培养基与100微升新培养基 B 含有20微米荧光膜探针1分钟。
- 添加1微升0.05 毫米聚合 Aβ1-42 (最终0.5 微米) 或车辆 (蒸馏水) 溶液, 并通过移液混合。孵育20分钟。
- 取出介质, 用中 B 两次洗涤水井, 预热至37摄氏度。
- 修复、洗涤和安装神经元, 如步骤1.3.3 和1.3.4 中所述。
- 在倒置显微镜 a 上用63X 油物镜捕捉荧光和 DIC 图像。
- 利用图像软件量化每个健康生长锥中荧光膜探针阳性区域的密度。
6. 基因转染
- 如步骤1.2 所述, 准备皮质神经元。完成步骤1.2.1 到 1.2.10, 离心神经元在 178 x g 3 分钟。
- 除去上清液, 加入4毫升的 Ca2 +免费和 Mg2 +免费的汉克斯 ' 平衡盐溶液 (CMF-HBSS), 并通过移液混合。
- 离心细胞在 178 x g 3 分钟。
- 除去上清液, 加入4毫升的 CMF-HBSS, 并通过移液混合。接下来, 计算单元密度, 如步骤1.2.10 中所述。
- 传输 5 x 106细胞到1.5 毫升管和离心机在 1677 x g 1 分钟。
- 除去上清液, 添加100微升的转染溶液与补充和3微克的 DNA 质粒编码 EGFP 或 EGFP-AP180 c-终点, 并通过移液混合。
- 根据制造商的协议, 将上述解决方案 (步骤 6.6) 转移到经认证的试管和转染电转化仪。
- 转染后立即将500微升培养基 A 加入试管, 并将溶液转至1.5 毫升管, 并经认证的移液器。接下来, 计算单元密度, 如步骤1.2.10 中所述。
- 按照步骤1.2.11 和1.2.12 中所述, 将8井文化中的细胞培养在 0.8 x 104细胞/井中。
- 在细胞培养4天后, 按照步骤1.3 中所述执行折叠试验。
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Representative Results
在本议定书中, Aβ1-42 在37摄氏度孵育7天前使用, 因为 Aβ1-42 的孵化需要产生有毒形式27,28,30,35。在此孵育后, 观察到 Aβ的聚合形式 (图 1A)。据报道, Aβ1-42 的类似孵化产生了 Aβ36的纤维形式。使用此聚合 Aβ1-42 治疗后, 免疫染色与 Aβ35、37的毒性低聚物抗体一起进行, 并在培养的神经元上检测到阳性染色 (图 1B)。考虑到上述情况, 这种孵化协议产生 Aβ的有毒形式。
Aβ暴露后轴突变性的诱导需要数天时间。轴突变性之前的事件仍然不清楚。因此, 已制定了这项议定书, 以进一步了解所涉及的机制。利用该协议, 对 Aβ处理引起的早期现象进行了分析。皮层神经元培养4天。培养神经元中最长的突起被确定为轴突;MAP2 (图 2) 对轴突标记、tau-1 和负免疫染色进行了阳性免疫染色确认。经过1小时的车辆处理后, 生长锥已扩散伪足并处理了几个丝状伪足。这些被确定为健康生长锥。相反, 1 小时的 Aβ1-42 治疗导致萎缩的生长锥, 发展没有伪足或丝状伪足。这些被确定为折叠的生长锥。折叠分数按步骤1.3.7 中所述计算。当生长锥的形状不清楚时, 它们被排除在分析。与车辆处理的生长锥27的折叠得分相比, Aβ1-42 处理导致了显著增加的折叠得分, 对应于轴突增长崩溃。
轴突生长锥在治疗前后观察 Aβ1-42 (图 3)。细胞在倒置显微镜下保持, 10% CO2的加湿气氛为37摄氏度。每5分钟拍摄一次图像。如图 3所示, 生长锥在 Aβ1-42 治疗后在21和26分钟之间折叠。生长锥被排除在活细胞成像, 如果他们没有保持其健康的形状在任何治疗前1小时。
为了可视化 Aβ1-42-treatment 的早期效果, 内吞被用作此分析的重点, 因为内吞抑制剂可以阻断 Aβ1-42-induced 生长锥塌陷27。内吞是用荧光膜探针(i. e., 一种与等离子膜结合的荧光染料, 自发 endocytosed) 形象化的。前一项研究表明, 生长锥在 Aβ1-42-treatment27后20分钟不会塌陷;因此, 在20分钟后, 在车辆或 Aβ1-42-treated 细胞中通过 DIC 成像选择了健康生长锥。Aβ1-42-treatment 后, 在生长锥中观察到许多荧光膜探针阳性斑点 (图 4)。在生长锥中, 荧光膜探针阳性斑点的密度显著提高27。这表明 Aβ1-42-induced 生长锥内吞发生在崩溃之前。
为了证实内吞的作用, 将 EGFP-AP180 c-终点的 DNA 质粒转染成培养的皮层神经元。表达 AP180 c-终点的细胞有选择性地抑制网格蛋白介导的内吞38、39。如果在神经元的细胞体中观察到 EGFP 表达, AP180 c-终点被认为是在神经元的轴突生长锥上表达的。转染 AP180 c-终点阻塞 Aβ1-42-induced 生长锥折叠 (图 5)27。
图 1:孵化一个β1-42 聚合 Aβ.(a) Aβ1-42 在蒸馏水中溶解, 浓度为 0.5 mM, 在37摄氏度孵育7天 (孵育后), 或储存在-30 摄氏度, 无孵育 (无孵化)。每 Aβ溶液稀释至 0.1 mM;然后, 10 微升的每一个稀释的溶液被丢弃在玻璃滑块和覆盖盖玻片。用倒置显微镜采集了带有倾斜光照的明亮场图像 b. 比例尺 = 20 微米。(B) 对培养的神经元进行4小时的聚合 Aβ1-42 或车辆处理。治疗后, 神经元被固定和免疫染色毒性 Aβ寡聚物。显示了荧光图像 (红色) 和带有倾斜光照 (灰度) 的明亮场图像。刻度条 = 20 微米。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2:一个β1-42 诱导的轴突生长锥塌陷.在 Aβ1-42 或车辆处理后, 神经元被固定和免疫染色 tau-1 (红色) 和微管相关蛋白 2 (MAP2, 绿色)。显示荧光和差分干扰对比度 (DIC) 图像。感兴趣区域的放大视图 (ROI、矩形) 显示在相应图像的下方。白色刻度条 = 50 微米;黑色刻度条 = 10 微米。此图已从 Kuboyama et al, 201527修改。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 活体细胞成像前后β1-42 治疗.经过4天的培养, 细胞被转移到倒置显微镜, DIC 图像每5分钟捕获一次. 显示延时图像。数字表示分钟: 在聚合 Aβ1-42 (最终浓度, 0.5 微米) 应用后的秒数。刻度条 = 10 微米。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 二十分钟的β1-42 治疗诱导内吞.皮层神经元培养4天, 用荧光膜探针治疗。然后, 用 Aβ1-42 或车辆治疗神经元20分钟。显示了生长锥的荧光图像。黄色虚线代表生长锥的轮廓。刻度条 = 10 微米。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: AP180-C 终点的表达 Aβ1-42-induced 塌陷.转染 EGFP (A、B) 或 EGFP-AP180 c 终点后四天 (c、D);Aβ1-42 (B, D) 或车辆 (A, C) 被添加到皮层神经元 1 h. DIC (上部板) 和荧光 (底部板) 图像显示。箭头表示生长锥。刻度条 = 10 微米。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
本研究所述的协议使 Aβ1-42 治疗后轴突生长锥早期现象的观察。Aβ1-42 诱导内吞在轴突生长锥20分钟内, 并在1小时内观察到生长锥塌陷。这个内吞可能是由网格蛋白介导的。通过使用本协议, 证实了网格蛋白介导内吞的抑制, 防止 Aβ1-42-induced 生长锥塌陷和神经元轴突变性27。此外, 抑制网格蛋白介导的内吞减弱 Aβ1-42-induced 轴突变性和记忆缺陷在体内27。这些结果表明, 网格蛋白介导的内吞是广告预防的一个有前途的治疗途径。
本协议是从轴突生长驱蚊的折叠检测中开发的, 如 semaphorin 3A 和 ephrin-A516、17、18、19、20。在评估神经元网络发展的研究中使用了折叠分析法。我已经表明, 该协议可以应用于病理分析, 特别是那些涉及广告机制;然而, 一个限制可能是大约40% 的生长锥在健康状况下崩溃。这个百分比高于培养的背根神经节神经元的结果, 这是更常用的折叠检测16,17,18,19,20。因此, 单元格类型的差异可能与折叠比率的差异相关。本研究发现的塌陷率与正常培养的皮层神经元40、41的早期研究结果一致。此外, 与其他塌陷因子 (如 semaphorin 3A 和 ephrin-A527) 相比, Aβ1-42 诱导了类似的生长锥塌陷水平。因此, 该协议适用于 Aβ1-42-induced 生长锥折叠的量化。这种固定协议对于保持生长锥的形状很重要。如果细胞在室温下通常固定在4% 多聚甲醛, 更多的生长锥可能因固定过程而坍塌 (未显示数据)。另外, 戊二醛和固定缓冲液可用于刚性固定, 如前所述42;然而, 戊二醛呈现自发荧光, 这是荧光成像的一个重要障碍。
最近的一项研究表明, 从远志 (远志远志的根) 的水提取物抑制 Aβ1-42-induced 内吞在培养神经元, 防止轴突变性, 并减少内存赤字AD31的转基因鼠标模型。本协议发现了一种新的广告预防候选方案。基因转染和活细胞成像在本协议中的结合可能显示在 Aβ治疗前后轴突及其末端发现的其他细胞事件, 如 Ca2 +成像、微管动力学和细胞粘附动力学, 这据报道与轴突生长43、44、45有关。该协议可能有助于揭示更详细的 Aβ毒性机制, 并可能有助于导致预防和/或处理广告。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自日本、武田科学基金会、日本 KAKENHI 18K07389、日本小林制药株式会社的研究资助的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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