Summary
Hier wird ein Protokoll für das schnelle zerstörungsfreie Screening von Baumwollgenotypen auf reniforme Nematodenresistenz vorgelegt. Das Protokoll beinhaltet die visuelle Untersuchung der Wurzeln von nematodeninfizierten Baumwollsämlingen, um die Infektionsreaktion zu bestimmen. Der vegetative Trieb aus jeder Pflanze wird dann vermehrt, um Pflanzen für die Saatgutproduktion zurückzugewinnen.
Abstract
Ein schnelles zerstörungsfreies Reniformnematode (Rotylenchulus reniformis) Screening-Protokoll ist für die Entwicklung von resistenten Baumwolle (Gossypium hirsutum) Sorten erforderlich, um das Nematodenmanagement zu verbessern. Die meisten Protokolle beinhalten die Extraktion von vermiformen Nematoden oder Eiern aus dem Baumwollwurzelsystem oder Blumenerde, um die Populationsdichte oder Fortpflanzungsrate zu bestimmen. Diese Ansätze sind in der Regel zeitaufwändig, wobei eine kleine Anzahl von Genotypen bewertet wird. Hier wird ein alternativer Ansatz beschrieben, bei dem das Wurzelsystem visuell auf Eine Nematodeninfektion untersucht wird. Das Protokoll beinhaltet die Impfung von Baumwollsämling 7 Tage nach der Pflanzung mit vermiformenen Nematoden und die Bestimmung der Anzahl der Weibchen, die 28 Tage nach der Impfung am Wurzelsystem befestigt sind. Die Daten werden ausgedrückt als die Anzahl der Weibchen pro Gramm frischer Wurzelgewichte, um sich an die Variation des Wurzelwachstums anzupassen. Das Protokoll bietet eine ausgezeichnete Methode zur Bewertung der Wirtspflanzenresistenz im Zusammenhang mit der Fähigkeit des Nematoden, eine Infektionsstelle zu etablieren; Resistenzen, die die Nematodenreproduktion behindern, werden jedoch nicht beurteilt. Wie bei anderen Screening-Protokollen wird häufig Variation bei Nematodeninfektionen zwischen einzelnen Genotypen innerhalb und zwischen Experimenten beobachtet. Die Daten werden dargestellt, um den Variationsumfang zu veranschaulichen, der mit dem Protokoll beobachtet wurde. Um diese Variation anzupassen, werden Kontrollgenotypen in Experimente einbezogen. Dennoch bietet das Protokoll eine einfache und schnelle Methode zur Bewertung der Wirtspflanzenresistenz. Das Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um resistente Beitritte aus dem Gzu identifizieren. Arboreum-Keimplasma-Sammlung und bewerten Segregierenpopulationen von mehr als 300 Individuen, um die Genetik der Resistenz zu bestimmen. Es wurde auch eine vegetative Vermehrungsmethode zur Rückgewinnung von Pflanzen für die Resistenzzüchtung entwickelt. Nach der Entfernung des Wurzelsystems zur Nematodenauswertung wird der vegetative Trieb nachgepflanzt, um die Entwicklung eines neuen Wurzelsystems zu ermöglichen. Mehr als 95% der Triebe entwickeln in der Regel ein neues Wurzelsystem mit Pflanzen, die reife reife werden.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford und Oliveira), gemeinhin als Reniformnematode bezeichnet, ist eine der wichtigsten parasitären Nematodenarten, die in Böden des Südostens der Vereinigten Staaten vorkommen1,2,3. Der Nematoden ist ein obligater, sessesshafter Semiendosit, der eine Wirtspflanze benötigt, um ihren Lebenszyklus abzuschließen2,4. Vermiforme präadulte weibliche Nematoden dringen in das Wirtswurzelsystem ein, um eine Futterstelle in der Stele2,3zu errichten. Wenn sich die Nematode ernährt und reift, schwillt der hintere Teil, der außerhalb der Wirtswurzel verbleibt, bei der Eiproduktion an und bildet eine charakteristische Nierenform (Abbildung 1). Rotylenchulus reniformis ist in der Lage, sich vom Wurzelsystem von mehr als 300 Pflanzenarten, einschließlich Baumwolle4, zu ernähren. Upland-Baumwolle(Gossypium hirsutum L.) wird im Südosten der Vereinigten Staaten weit verbreitet angebaut, aber das Fehlen von R. reniformis resistente Sorten behindern Nematodenmanagement2,3. Managementstrategien wie Nematizidbehandlung und Rotation mit Nicht-Wirtspflanzenarten wurden verwendet, um den Boden Rzu reduzieren. reniformis Populationsdichten5,6, aber Samen Baumwolle Ertragsverluste können in der Regel von 1 bis 5%2reichen. Symptome von R. Reniformis-Infektion kann Pflanzenstunting, unterdrücktes Wurzelwachstum, Ernährungsmängel, Obstabtreibung und verzögerte Reife2umfassen. Jedoch, Symptome können nicht aufgrund der Gleichförmigkeit der Symptome auf dem Feld offensichtlich sein; daher Ansätze zur Bewertung von R. Reniformis-Infektionen sind erforderlich, um resistente Baumwollsorten im Hochland zu identifizieren und zu entwickeln. Bewertung von R. reniformis Resistenz in Baumwolle gilt als schwierig7, weil das infizierte Wurzelsystem normal erscheinen kann, obwohl die Pflanze Symptome einer Infektion zeigen kann8.
Für die Identifizierung von Rist ein effektives Nematoden-Screening-Protokoll erforderlich. reniformis resistente Beitritte aus der Baumwollkeimplasmasammlung und zur Bestimmung der Resistenzgenetik für diese Beitritte. Ein solches Protokoll wird bei der Übertragung von Resistenzgenen auf Hochlandbaumwolle helfen. Zur Beurteilung von Rwurden verschiedene Bioassay-Methoden verwendet. reniformis Infektion in Baumwolle8,9,10,11,12,13,14,15. Im Allgemeinen wurden zwei Hauptansätze für die Identifizierung von Rverwendet. reniformis resistente Baumwollgenotypen. Der am häufigsten verwendete Ansatz beinhaltet die Extraktion von Eiern und/oder vermiformenen Nematoden aus infizierten Pflanzen oder Böden8,11,12,14,15. Die allgemeine Methodik für diesen Ansatz beinhaltet das Anpflanzen von Samen für die einzelnen Baumwollgenotypen in separaten Töpfen, so dass sich die Sämlinge für 7 bis 14 Tage entwickeln können, indem die Sämlinge durch Zugabe einer Mischung aus vermiformen Stufen von Rimpfen. Reniformis in den Boden, und so dass die Nematoden das Wurzelsystem für 30 bis 60 Tage infizieren. Als nächstes werden vermiforme Nematoden und/oder Eier aus dem infizierten Wurzelsystem jeder Pflanze oder aus dem Blumenboden extrahiert. Die Anzahl der extrahierten Nematoden oder Eier wird dann bestimmt, um die Populationsdichte und Fortpflanzungsrate zu schätzen, die mit Kontrollgenotypen verglichen werden, um resistente Genotypen zu identifizieren.
Ein alternativer Ansatz, wie hier beschrieben, beinhaltet mikroskopisch die Untersuchung des Baumwollwurzelsystems, das mit Nematoden infiziert wurde, um die Anzahl der weiblichen Nematoden zu bestimmen, die die Wurzeln parasitieren10,16. Ähnlich wie bei anderen Ansätzen werden Baumwollgenotypen in separaten Töpfen gepflanzt und ca. 7 Tage nach der Pflanzung mit vermiforderen Nematoden geimpft. Innerhalb von 30 Tagen nach der Impfung wird das Wurzelsystem von einzelnen Pflanzen entfernt und der Boden von den Wurzeln abgeführt. Als nächstes werden die Amematoden, die am Wurzelsystem befestigt sind, mit roter Lebensmittelfarbe17gefärbt, und Die Wurzeln werden mikroskopisch untersucht, um die Anzahl der Infektionsstellen mit resistenten Baumwollgenotypen zu bestimmen (identifiziert basierend auf der Anzahl der Nematoden pro Gramm Wurzel) im Vergleich zu einer anfälligen Kontrolle16. Dieser zweite Ansatz hat den Vorteil eines erhöhten Durchsatzes, indem er die Anzahl der für die Bewertung erforderlichen Tage reduziert und die Anzahl der einzelnen Genotypen erhöht, die in einem einzigen Experiment bewertet werden. Screening-Methoden, die Bevölkerungsdichte oder Reproduktionsrate bewerten, sind oft zeitaufwändiger als jene, die auf visuellen Beobachtungen von Infektionszeichen basieren7. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass die Widerstandsfähigkeit von Wirtspflanzen, die die Nematodenvermehrung gemäß der Eiproduktion behindert, nicht bewertet wird13.
Screening-Protokolle für R. Reniformis-Widerstand zerstört oft das Wurzelsystem während der Auswertung7 und beinhaltet, dass der vegetative Trieb verworfen wird. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine Methode der vegetativen Vermehrung entwickelt, um die Rückgewinnung von Pflanzen für die Saatgutproduktion zu ermöglichen18. Nach dem Entfernen des Wurzelsystems zur Nematodenbewertung wird der vegetative Trieb in Blumenerde gepflanzt, damit das Wurzelsystem nachwachsen kann. Diese Methode hat breite Anwendungen für die meisten R. reniformis Screening-Protokolle. Eine einfache und schnelle Methode der vegetativen Vermehrung ist von entscheidender Bedeutung für die Züchtung R. reniformis resistente Hochland-Baumwollsorten, bei denen die Rückgewinnung der Nachkommenschaft erforderlich ist, um resistente Genotypen auf die nächste Generation zu bringen.
Für das großflächige Screening von Baumwollgenotypen auf Reniformnematodenresistenz wird ein Protokoll vorgelegt. Ziel ist es, eine einfache und schnelle zerstörungsfreie Screening-Methode zur Bewertung von Baumwollzuchtpopulationen auf Nematodenresistenz zu entwickeln, um bei der Züchtung resistenter Hochland-Baumwollsorten zu helfen. Mit diesem Protokoll werden die Daten in der Regel innerhalb von 35 Tagen gewonnen, wobei mehr als 300 Genotypen in einem einzigen Experiment ausgewertet werden. Die Daten werden für resistente und anfällige Genotypen dargestellt, um die mit diesen Methoden häufig beobachtete Variation zu veranschaulichen.
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Protocol
1. Aufrechterhaltung einer Quelle von R. reniformis Inokulums
- Füllen Sie Terrakotta-Tontöpfe (15 cm Durchmesser, 13,5 cm Höhe) mit einer dampfpasteurisierten Mischung aus 1-teiligem Sandund und 2-teiligem Sand. Eine anfällige Tomate (Solanum lycopersicon) sorte in jedem Topf pflanzen und die Töpfe in ein Gewächshaus geben.
HINWEIS: Andere anfällige Pflanzensorten wie Baumwolle können anstelle von Tomaten verwendet werden. - Die Tomatenpflanzen mit vermiformen reniformen Nematoden impfen (siehe Schritt 3.3). Pflegen Sie die Pflanzen im Gewächshaus bei einer Temperatur von ca. 28 °C.
2. Pflanzung Baumwolle Genotypen für R. reniformis Widerstandsbewertung
- Bereiten Sie den Boden vor, indem Sie 2-teiligen feinen Sand mit 1-teiligem Sandlehm kombinieren, der vom Feld gesammelt wurde.
- Dampf pasteurisieren die Bodenmischung, um sicherzustellen, dass der Boden frei von Nematoden und bodenbedingten Pflanzenpathogenen ist.
- Fügen Sie die Bodenmischung zu konischen Kunststofftöpfen (4 cm Durchmesser, 21 cm in der Höhe) hinzu. Bevor Sie die Töpfe füllen, legen Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden des Topfes, um Bodenverlust zu verhindern. Füllen Sie die Töpfe teilweise mit Erde ca. 2 cm von der Spitze.
- Bereiten Sie einen Plastikpfahl für jeden Topf vor, um den zu pflanzenden Genotyp zu bezeichnen.
- Pflanzensamen der zur Bewertung ausgewählten Baumwollgenotypen.
- Pflanzen Sie einen einzelnen Samen in jeden Topf für die Bewertung der Segregierenden Populationen, in denen jeder Samen einen einzigartigen Genotyp darstellt.
- Für Baumwollsorten oder Keimplasma-Beitritte 2 bis 3 Samen in einem einzigen Topf pflanzen, um die Keimung von mindestens einer Pflanze mit den anderen Sämlingen, die vor der Nematodenimpfung aus den Töpfen entfernt werden, zu versichern.
Hinweis: Alternativ können Samen vor der Pflanzung für 24 bis 72 h gekeimt werden, um die Anzahl der Töpfe mit nicht lebensfähigen Samen zu minimieren.
- Pflanzensamen ausgewählter resistenter und anfälliger Kontrollgenotypen.
Anmerkung: Kontrollgenotypen werden 5 bis 10 Mal repliziert, um natürliche Variationen zu bewerten, die der Screening-Methodik innewohnen. - Füllen Sie Töpfe mit zusätzlichem Boden, um das Saatgut in jedem Topf zu bedecken.
- Legen Sie die Töpfe in die Wachstumskammer. Halten Sie eine konstante Temperatur von 28 °C, eine Umgebungslufttemperatur, für die Wachstumskammer. Bieten Sie künstliche Beleuchtung mit einer Mischung aus Leuchtstoff- und Glühlampen mit einer 16-Stunden-Fotoperiode.
- Legen Sie Wasserstrahler in jeden Topf und gießen Sie die Töpfe zweimal täglich mit einem automatischen Bewässerungssystem. Passen Sie das Bewässerungssystem an, um zusätzliches Wasser zu liefern, wenn die Pflanze wächst.
3. Nematode-Inokulation von Baumwollpflanzen und Vorbereitung von Wurzelproben
- Extrahieren Sie vermiforme reniforme Nematoden, die auf anfälligen Tomatenpflanzen gehalten werden (siehe Schritt 1) mit Elutriation19 und Zentrifugalflotation20 Methoden am Tag vor der Impfung. Bewahren Sie die extrahierten Nematoden bei 4 °C auf.
HINWEIS: Die Baermann-Trichterextraktion21 ist eine alternative Methode zur Nematodenextraktion. - Bestimmen Sie die Anzahl der extrahierten Nematoden, indem Sie die Anzahl der Nematoden in einer 100-L-Unterstichprobe zählen, und bereiten Sie eine Suspension von 1.000 Nematoden/ml im Leitungswasser für Impfungen vor.
- Die Baumwollsämlinge 7 d nach dem Pflanzen mit der Nematodensuspension impfen. Erstellen Sie eine kleine Depression im Boden neben der Pflanze, und Pipette 1 ml der reniformen Nematodensuspension in die Depression.
- Entfernen Sie Pflanzen aus den Töpfen 28 d nach der Impfung für die Nematodenbewertung.
HINWEIS: In diesem Stadium sind pflanzen etwa 15 cm hoch mit 4 bis 6 voll expandierten Blättern.- Entfernen Sie die meisten der vollständig expandierten Blätter aus den Pflanzen mit einer Schere, bevor Sie die Pflanzen aus den Töpfen entfernen.
- Um Pflanzen aus den Töpfen zu entfernen, drücken Sie den Topf und schieben Sie den Boden in die Hand.
- Entfernen Sie den Boden vorsichtig von den Wurzeln, indem Sie das Wurzelsystem in Leitungswasser in einem 10 L Behälter rühren. Spülen Sie das Wurzelsystem kurz in einem Behälter mit sauberem Leitungswasser ab.
- Entfernen Sie das Wurzelsystem aus der Pflanze ca. 1 cm unter der Bodenlinie mit einer Schere.
- Legen Sie das Wurzelsystem in einen 120 ml Kunststoff, nicht-sterilen Einweg-Probenbehälter zusammen mit dem Kunststoffpfahl aus dem Topf zur Identifizierung verwendet.
HINWEIS: Mehrere Proben werden verarbeitet, bevor sie mit Schritt 3.7 fortfahren. Fahren Sie mit Schritt 4 für die vegetative Vermehrung des Pflanzentriebs fort. - Bereiten Sie eine 12,5% (v/v) Lösung der roten Lebensmittelfärbung17 in Leitungswasser vor, um die am Wurzelsystem befestigten Nematoden zu färben.
- Fügen Sie der Wurzelprobe im Probenbehälter ca. 30 ml der roten Lebensmittelfärbelösung hinzu, um das Wurzelsystem vollständig abzudecken.
- Legen Sie den Probenbehälter in einen Mikrowellenherd und erhitzen Sie die Wurzelprobe, bis die Färbelösung zu kochen beginnt. Entfernen Sie die Probe aus dem Mikrowellenherd und lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur abkühlen.
- Dekantieren Sie die rote Lebensmittelfärbungslösung aus der Wurzelprobe und fügen Sie etwa 100 ml Leitungswasser in den Probenbehälter, um überschüssige Flecken zu entfernen. Legen Sie die Abdeckung auf den Probenbehälter und lagern Sie die Probe in einem Kühlschrank bei 4 °C. Fahren Sie mit Schritt 5 für die Bewertung der Wurzelinfektion fort.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, bevor Sie mit Schritt 5 fortfahren.
4. Vegetative Vermehrung zur Rückgewinnung von Pflanzen für die Saatgutproduktion
- Legen Sie eine Kugel Baumwolle in den Boden eines konischen Plastiktopfes (siehe Schritt 2.3) und füllen Sie den Topf teilweise mit Torfmoos-Topfmedien. Dann legen Sie den vegetativen Trieb in den Topf und fügen Sie fest Topfmedien hinzu, um den Topf zu füllen. Legen Sie einen neuen beschrifteten Kunststoffpfahl in jeden Topf, um den Baumwollgenotyp zu bezeichnen.
- Das Schalentablett in einen Kunststoffbehälter (73,6 cm Länge x 45,7 cm Breite x 15,2 cm Höhe) mit Wasser geben und die Pflanzen kurz gießen, um die Vergussmedien zu befeuchten. Legen Sie die Töpfe in einer Wachstumskammer mit einer konstanten Temperatur von 28 °C mit einer 16 h Photoperiode. Fügen Sie dem Kunststoffbehälter bei Bedarf zusätzliches Wasser hinzu, um die Bodenfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.
- Verpflanzen Sie die Pflanzen in größere Töpfe für die Samenproduktion nach ca. 30 d. Füllen Sie einen 6 L Kunststofftopf teilweise mit Topfmedien (siehe Schritt 4.1), entfernen Sie die Pflanze aus dem kleinen Topf, legen Sie die Pflanze in den 6 L Topf und fügen Sie die Topfmedien fest hinzu, um den Topf zu füllen.
- Legen Sie die Pflanzen in ein Gewächshaus und fügen Sie Wasser hinzu, um die Topfmedien zu befeuchten. Halten Sie die Temperatur im Gewächshaus bei ca. 28 °C (künstliche Beleuchtung ist nicht erforderlich).
- Wasserpflanzen von Hand, wie für ca. 30 d benötigt.
- Wenn etwa 75% der Pflanzen täglich bewässert werden müssen, verwenden Wasserpflanzen täglich ein automatisches Bewässerungssystem. Passen Sie das automatische Bewässerungssystem häufiger an Daswasser an, je nach Bedarf für das Pflanzenwachstum.
- Fügen Sie etwa 10 g eines langsam freisetzenden Düngers in jeden Topf vor dem Beginn der floralen Einweihung.
- Erntepflanzen bei Reife und verarbeiten sie die Baumwollsamenproben, um Samen für die weitere Bewertung zu erhalten.
- Um Baumwollsamen zu ernten, entfernen Sie die Baumwolle von Hand von den offenen Pollern auf der Pflanze und legen Sie sie in eine beschriftete Papiertüte. Die Samen werden an den Baumwollfasern befestigt, die in den folgenden Schritten entfernt werden.
- Entfernen Sie Fusselfasern aus den Samenproben mit einem 10-Säge-Labor-Gin.
- Entfernen Sie Fuzzfasern aus den Samenproben mit konzentrierter Schwefelsäure. Neutralisieren Sie Die Samenproben in einer 15%-Lösung (v/v) von Natriumcarbonat, spülen Sie die Proben mit Leitungswasser ab und trocknen Sie die Proben in einem Zwangslufttrockner.
- Legen Sie die Samenproben zur Lagerung in beschriftete Umschläge.
5. Bewertung von R. reniformis Wurzelinfektion
- Entfernen Sie die Wurzelprobe aus dem Probenbehälter und zählen Sie die Anzahl der weiblichen Nematoden, die mit einem Stereomikroskop (20X Vergrößerung) am Wurzelsystem befestigt sind.
HINWEIS: Nur weibliche reniforme Nematoden sind in der Lage, Pflanzenwurzeln zu infizieren. - Legen Sie das Wurzelsystem für ca. 10 min auf Papiertücher, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Wiegen Sie das Wurzelsystem, um das frische Wurzelgewicht zu bestimmen.
- Geben Sie die Nematodenanzahl und die datenfrischen Stammgewichte in ein Computertabellenprogramm ein und berechnen Sie die Anzahl der Weibchen pro Gramm Root.
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Representative Results
Rotylenchulus reniformis Infektion des Wurzelsystems für zwei Sorten ist in Abbildung 1dargestellt. Relativ weniger weibliche reniforme Nematoden sind in der Lage, eine Futterstelle für den resistenten Baumwollgenotyp im Vergleich zum anfälligen Genotyp zu etablieren. Unterschiede im Wurzelwachstum sind zwischen den Beitritten üblich, wie in Abbildung 2dargestellt. Diese Variation, gemessen am frischwurzelgewichtigen Gewicht, kann auch zwischen Pflanzen desselben Genotyps beobachtet werden (Tabelle 1). Gossypium arboreum genotypes zeigen häufig niedrigere Wurzelwachstumsraten als Hochland-Baumwollgenotypen. Um diese Variation auszugleichen, werden Daten über frische Wurzelgewichte gesammelt, die verwendet werden, um die Anzahl der weiblichen reniformer Nematoden pro Gramm Wurzelgewebe für jeden Genotyp zu berechnen. Die Anzahl der weiblichen reniformen Nematoden pro Gramm Wurzel für resistente Genotypen ist im Allgemeinen kleiner als 10, während anfällige Genotypen in der Regel mehr als 30 Nematoden pro Gramm Wurzel aufweisen.
Eine Herausforderung für das Screening von Baumwollgenotypen für R. reniformis-Resistenz ist die potenzielle Variation, die innerhalb und zwischen Experimenten auftreten kann. Um diese Variation zu bewerten und anzupassen, werden resistente und anfällige Baumwollgenotypen als Kontrollen einbezogen und in jedem Experiment repliziert. Tabelle 1 enthält Daten für zwei Genotypen, die als Steuerelemente in zwei getrennten Experimenten mit dem oben beschriebenen Protokoll verwendet werden. Die Genotypen wurden 10 Mal repliziert und 7 Tage nach der Pflanzung mit 1.000 vermiformenen Nematoden geimpft, dann wurden Wurzelsysteme 28 Tage nach der Impfung geerntet, um Nematoden zu zählen, die an den Wurzeln befestigt waren. Da die Experimente zu unterschiedlichen Zeiten durchgeführt wurden, war die Quelle der Nematoden, die für Impfungen verwendet wurden, unterschiedlich; Andernfalls waren alle anderen Parameter ähnlich. Diese Daten veranschaulichen die Variationen, die bei Reniformnematodenauswertungen beobachtet werden können. Die Anzahl der weiblichen Nematoden und wurzelgewichtiger Gewichte war in Experiment 1 für die beiden Kontrollen höher als bei Experiment 2, was zu einer höheren Anzahl von Weibchen pro Gramm Wurzel für Experiment 1 führte. Da die weiblichen Zahlen für Versuch 1 deutlich höher waren, verringerte der Anstieg der Wurzelgewichte die Anzahl der Weibchen pro Gramm Wurzel nicht auf die für Versuch 2 beobachteten Werte. Erhebliche Unterschiede zwischen den Replikationen einzelner Genotypen wurden ebenfalls beobachtet. Die widerstandsfähige G. Arboreum-Genotyp PI 615699 zeigte häufig deutlich niedrigere weibliche Anzahlen und eine geringere Anzahl von Weibchen pro Gramm Wurzel als die anfällige G. Hirsutum genotyp PI 529251. Die Genotypen können leicht als widerstandsfähig oder anfällig eingestuft werden, wenn diese Mittel zum Vergleich verwendet werden. Genotypen werden als resistent eingestuft, wenn die Anzahl der Weibchen pro Gramm Wurzel etwa 10% der anfälligen Kontrolle beträgt.
Eine Teilmenge der Daten aus einer segregierenden F 2-Population, die mit dem Protokoll ausgewertet wurde, wird in Tabelle 2dargestellt. Die Population umfasste 300 F2-Pflanzen, und Es werden Daten für 50 Pflanzen dargestellt, die den Variationsbereich darstellen. Bei der Population von 300 Pflanzen lag die Zahl der beobachteten Nematoden, die die Wurzelsysteme infizierten, zwischen 0 und 50, mit einem Mittelwert von 9,4. Die Wurzelgewichte reichten von 0,01-1,22 g, mit einem Mittelwert von 0,38 g. Weibliche Nematoden pro Gramm Wurzel reichten von 0-400, mit einem Mittelwert von 33,6. Die Eltern wurden in der Auswertung repliziert. Das resistente Elternteil (PI 417895) wies einen Mittelwert von 5,8 Weibchen pro Gramm Wurzel mit einem mittleren Wurzelgewicht von 0,8 g auf; Im Gegensatz dazu zeigte das anfällige Elternteil (PI 529729) einen Mittelwert von 40,8 Weibchen pro Gramm Wurzel, mit einem mittleren Wurzelgewicht von 0,35 g. Zwanzig Pflanzen zeigten keine Nematodeninfektion und wurden als resistent eingestuft, aber dies kann Fluchten darstellen. Sowohl diese Pflanzen als auch Pflanzen mit schlechtem Wurzelwachstum werden in der Regel aus der Datenanalyse entfernt. Dieser Bereich in Variation für Wurzelwachstum und Nematodeninfektion der Wurzelsysteme werden häufig für Nematodenbewertungen beobachtet; So kann die Fähigkeit, eine große Anzahl von Pflanzen in einem einzigen Experiment zu überprüfen, diese Variation minimieren und eine genaue Beurteilung der Genetik des Widerstands ermöglichen. Die Population zeigte quantitative Variationen für Nematodeninfektionen, und Pflanzen wurden als resistent eingestuft, basierend auf den Daten des anfälligen Elternteils, was darauf hindeutete, dass die Resistenz durch zwei rezessive Gene für diese Population verliehen wurde. Darüber hinaus wurde das oben beschriebene vegetative Vermehrungsprotokoll erfolgreich verwendet, um Pflanzen aus dieser Population zurückzugewinnen. Die Bewertung der F 3-Nachkommen, die aus einzelnen F 2-Pflanzen abgeleitet wurden, entsprach häufig der Bewertung der F 2-Pflanze.
Abbildung1: Rotylenchulus reniformis infizierte Wurzelproben. Die Wurzelprobe eines resistenten Baumwollgenotyps (unten links) zeigt eine einzelne weibliche Nematode, die an der Wurzel befestigt ist, während der anfällige Genotyp (oben rechts) mehrere Weibchen zeigt, die an der Wurzel befestigt sind. Der schwarze Balken stellt eine Skala von 0,1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Veränderung beim Wurzelwachstum bei zwei Baumwollgenotypen beobachtet. Die Wurzelsysteme für zwei reniformnematodenresistente G.arboreum-Beitritte werden vorgestellt, um die Variation zu veranschaulichen, die für das Wurzelwachstum beobachtet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Variation, die bei der Reaktion auf reniforme Nematodeninfektion bei zwei Baumwollgenotypen beobachtet wurde, die als Kontrollen enthalten sind. Diese Daten veranschaulichen die Variationen, die innerhalb und zwischen Experimenten für den anfälligen G.hirsutum Genotyp PI 529251 und resistentes Gauftreten können. Arboreum-Genotyp PI 615699; Die Datenmittel unterschieden sich jedoch erheblich, so dass die Genotypen leicht als resistent oder anfällig eingestuft werden konnten.
| Genotype-Bezeichnung | Frauen | Wurzelgewicht (g) | Weibchen/g Wurzel | klassifizierung |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | widerstandsfähig |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | widerstandsfähig |
| 75 | 2 | 1,05 | 1.9 | widerstandsfähig |
| 298 | 2 | 0,58 | 3.4 | widerstandsfähig |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | widerstandsfähig |
| 208 | 1 | 0,21 | 4.8 | widerstandsfähig |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | widerstandsfähig |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | widerstandsfähig |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | widerstandsfähig |
| 267 | 2 | 0,18 | 11.1 | Mäßig widerstandsfähig |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Mäßig widerstandsfähig |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Mäßig widerstandsfähig |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Mäßig widerstandsfähig |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Mäßig widerstandsfähig |
| 79 | 11 | 0,84 | 13.1 | Mäßig widerstandsfähig |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Mäßig widerstandsfähig |
| 114 | 9 | 0,64 | 14.1 | Mäßig widerstandsfähig |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Mäßig widerstandsfähig |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Mäßig widerstandsfähig |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Mäßig widerstandsfähig |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Mäßig widerstandsfähig |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Mäßig anfällig |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Mäßig anfällig |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Mäßig anfällig |
| 253 | 2 | 0,08 | 25,0 | Mäßig anfällig |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Mäßig anfällig |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Mäßig anfällig |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Mäßig anfällig |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Mäßig anfällig |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Mäßig anfällig |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Mäßig anfällig |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Mäßig anfällig |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Mäßig anfällig |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | leicht zu beeindrucken |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | leicht zu beeindrucken |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | leicht zu beeindrucken |
| 334 | 4 | 0,09 | 44,4 | leicht zu beeindrucken |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | leicht zu beeindrucken |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | leicht zu beeindrucken |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | leicht zu beeindrucken |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | leicht zu beeindrucken |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | leicht zu beeindrucken |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | leicht zu beeindrucken |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | leicht zu beeindrucken |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | leicht zu beeindrucken |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | leicht zu beeindrucken |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | leicht zu beeindrucken |
| 272 | 3 | 0,03 | 100,0 | leicht zu beeindrucken |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | leicht zu beeindrucken |
| 286 | 3 | 0,01 | 300,0 | leicht zu beeindrucken |
Tabelle 2: Reniformnematoden-Infektionsreaktion, die in einer Teilmenge von 50 Genotypen aus G. Arboreum F2 Population. Diese Daten veranschaulichen den Variationsbereich, der bei der Trennung von Populationen beobachtet werden kann. Wurzelgewichte, Nematodenzahlen und anzahl der Weibchen pro Gramm Wurzel werden für jeden Genotyp dargestellt, wobei Pflanzen als resistent, mäßig resistent, mäßig anfällig oder anfällig eingestuft werden.
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Discussion
Für 1) die Identifizierung von Rist ein effektives Screening-Protokoll erforderlich. reniformis resistente Baumwollgenotypen, um die Genetik der Resistenz und 2) die Züchtung resistenter Sorten zu bewerten. Die meisten Protokolle bewerten R. reniformis Populationsdichten oder Reproduktionsraten durch Extraktion von vermiformenen Nematoden oder Eiern aus dem Baumwollwurzelsystem oder Blumenerde8,11,12,14,15 . Diese Ansätze sind oft zeitaufwändiger, und die Ergebnisse sind in der Regel innerhalb und zwischen Experimenten unterschiedlicher. Darüber hinaus können Baumwollgenotypen häufiger in nicht replizierten Gewächshausexperimenten mit diesen Protokollen falsch klassifiziert werden11. Dennoch können ähnliche Ergebnisse für die verschiedenen Protokolle oder Parameter erzielt werden,die 9,13ausgewertet wurden.
Es wird ein alternatives Screening-Protokoll vorgestellt, in dem das Screening von Baumwollgenotypen durchgeführt wird, indem die Anzahl der weiblichen reniformen Nematoden bewertet wird, die das Wurzelsystem parasitieren. Resistente und anfällige Baumwollgenotypen können zunächst eine ähnliche Anzahl weiblicher Nematoden zeigen, die innerhalb von 16 Stunden nach der Impfung in die Wurzelsysteme eindringen, aber innerhalb von 36 Stunden beginnen resistente Genotypen deutlich weniger angehängte weibliche Nematoden und Nematodenentwicklung behindert 9 . Somit bietet dieses Screening-Protokoll eine direktere Messung der Nematodeninfektion des Baumwollwurzelsystems im Vergleich zu Protokollen, die auf der Extraktion von Nematoden oder Eiern aus dem Wurzelsystem oder dem Blumenboden beruhen. Die Methode der Baumwoll-Sämling-Impfung mit vermiformenen Nematoden ist unter den Ansätzen ähnlich. Impfungen werden in der Regel 7 bis 14 Tage nach der Pflanzung durchgeführt, aber der Zeitpunkt der Impfung ist weniger kritisch, da Samen auch direkt in reniformnen Nematoden befallenen Boden gepflanzt werden können. Impfungen werden mit 1.000 Vermiformnematoden durchgeführt, aber das Protokoll kann geändert werden, um die Anzahl der für die Impfung verwendeten Impfungen zu erhöhen oder zu verringern, oder zwei Impfungen können 7 und 14 Tage nach der Pflanzung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass genügend weibliche Nematoden für eine Wurzelinfektion vorhanden sind. Bei Sojabohnen hatte die Anzahl der Nematoden, die zur Impfung verwendet wurden, keine signifikanten Auswirkungen auf die Eimasse 21 Tage nach der Pflanzung; obwohl, höhere Bewertungen wurden in der Regel bei der höheren Nematoden Bevölkerungsdichtebeobachtet 22. Das Protokoll kann optimiert werden, um die minimale Nematodendichte für die Impfung zu bestimmen.
Die Nematodeninfektion des Wurzelsystems wird 28 Tage nach der Impfung für dieses Protokoll bewertet, das im Allgemeinen früher als in anderen Protokollen ist. Dies ist ein wichtiger Schritt im Protokoll, da Bewertungen vor der Eiluke durchgeführt werden. Eine erhebliche Verzögerung bei der Ernte von Wurzelproben kann zu einer zweiten Infektionsrunde führen. Diese frühere Bewertung hat jedoch den Vorteil, dass der Durchsatz erhöht wird. Für das vorgestellte Protokoll werden Baumwollgenotypen in eine Mischung aus Sand und Boden gepflanzt, was für die einfache und schnelle Entfernung des Wurzelsystems aus dem Topf entscheidend ist. Der Einsatz eines automatischen Bewässerungssystems ist bei der Verwendung kleiner Töpfe mit Sand- und Bodenmischung unerlässlich, um ein Austrocknen der Töpfe zu verhindern. Rote Lebensmittelfärbung wird verwendet, um die Nematoden am Wurzelsystem befestigt zu färben, die eine einfache und sichere Methodeist 17. Sobald die Wurzelsysteme gefärbt sind, können sie in Leitungswasser bei 4 °C gespeichert werden, bevor die Anzahl der Nematoden gezählt wird, die am Wurzelsystem befestigt sind; So kann eine größere Anzahl von Baumwollgenotypen in einem einzigen Experiment bewertet werden, da vor der Bewertung der Nematodenanzahl keine zusätzliche Verarbeitung der Proben erforderlich ist. Auch ist es vorteilhaft, die Wurzelproben mehrere Tage lang in Leitungswasser zu speichern, was es ermöglicht, Wurzeln zu entfärben, was das Zählen erleichtert.
Das beschriebene Protokoll ermöglicht das Screening größerer Populationen, um die Umweltschwankungen zwischen den Experimenten zu verringern. Mit einer 900 m2-Pflanzenwachstumskammer, die mit einem automatischen Bewässerungssystem ausgestattet ist, können Populationen von 480 Einzelpflanzen bewertet werden. Das Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Segregation von Populationen von 300 oder mehr Individuen zu bewerten, um die Genetik des Widerstands10,18zu charakterisieren. Diese Populationen zeigten, dass quantitative Variation für Nematodeninfektion und Resistenz in G. Arboreum kann häufiger mit mehreren rezessiven Genen in Verbindung gebracht werden; daher sind größere Populationen für genetische Studien erforderlich. Darüber hinaus wird quantitative Variation bei der Trennung von Populationen beobachtet, unabhängig vom verwendeten Protokoll, um die Nematodeninfektionsreaktion zu bewerten.
Wirt-Pflanzen-Resistenz in Baumwolle kann die Fähigkeit des Nematoden behindern, das Wurzelsystem zu infizieren und eine Futterstelle zu etablieren, aber es kann auch die Fortpflanzungsfähigkeit des Nematoden beeinträchtigen. Das beschriebene Screening-Protokoll bewertet die Anzahl der Nematoden, die in der Lage sind, eine Futterstelle auf dem Baumwollwurzelsystem einzurichten. Die Nematod-Reproduktion, gemessen an der Eiproduktion, wurde in diesem Protokoll nicht bewertet, was eine wichtige Einschränkung darstellt. Nichtsdestotrotz kann das Protokoll geändert werden, um diese Art von Daten zu sammeln. Alternativ kann eine andere Methodik verwendet werden, um diese Daten zu sammeln, nachdem resistente Genotypen identifiziert wurden, was die Notwendigkeit reduziert, eine große Anzahl von Personen zu untersuchen.
Daten aus Nematodenauswertungen einzelner Genotypen können innerhalb und zwischen Experimenten variabel sein, was ein häufiges Problem bei allen Screening-Protokollen ist, die zur Beurteilung von Rverwendet werden. Reniformis-Resistenz für Baumwollgenotypen. Die Verwendung eines experimentellen Entwurfs mit mehrfachen Replikationen für das Screening von Keimplasma-Beitritten wird bei der Beurteilung dieser Variation zur Identifizierung resistenter Genotypen helfen. Darüber hinaus ist das Einschließen der gleichen resistenten und anfälligen Kontrollgenotypen zwischen Denexperimenten hilfreich, um diese Variation zu bewerten und die Ergebnisse mehrerer Experimente zu vergleichen. Diese Kontrollen werden auch verwendet, um den Erfolg der Nematodenimpfung zu überwachen. Darüber hinaus werden Datenmittel aus diesen Kontrollen verwendet, um Genotypen als resistent oder anfällig zu klassifizieren10,16. Baumwollgenotypen werden in der Regel als resistent eingestuft, wenn sie weniger als 10% der Infektion zeigen, die bei der anfälligen Kontrolle beobachtet wurde16,23. Wurzelwachstum ist ein weiterer Faktor, der zu der Variation beiträgt, die in den Daten mit dem Protokoll beobachtet wird, da Pflanzen mit einer Hahnwurzel mit weniger lateralen Wurzeln weniger Standorte für Infektionen bieten, was zu weniger Nematoden pro Gramm Wurzel führen kann.
Die Schwierigkeit, neue Hochland-Baumwollsorten zu entwickeln, die andere Baumwollarten als Quelle von Resistenzgenen verwenden, erfordert ein vegetatives Vermehrungsprotokoll, um die Zuchtlinien zur nächsten Generation für weitere Selektionen oder zusätzliche zucht. Ein einfaches vegetatives Vermehrungsprotokoll, wie beschrieben, wurde entwickelt, um Pflanzen nach Nematodenauswertung zurückzugewinnen. Das Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Pflanzen aus großen Populationen zu erholen18. In der Regel wird das Wurzelsystem innerhalb von 30 Tagen nach dem Pflanzendestauchtrieb wiederhergestellt. Die Überlebensraten liegen häufig über 95 %. Pflanzen mit schlechter Kraft können verloren gehen, wenn sie eine große Anzahl von Pflanzen vermehren. Im Allgemeinen zeigten weniger als 1% der Pflanzen kein Wurzel- oder Triebwachstum. Das Protokoll kann leicht geändert und mit anderen Nematoden-Screening-Protokollen verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten, Agricultural Research Service, finanziert. Die Erwähnung von Handelsnamen und kommerziellen Produkten in diesem Artikel dient ausschließlich dem Zweck der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlungen oder Empfehlungen des US-Landwirtschaftsministeriums. USDA ist ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären. Technische Hilfe leistete Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
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