Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58664
Automatic Translation
1, 1,2
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

Burada biz akciğer ifade değerlendirmek için bir yöntem tarif tahmin edilmektedir miRNAs inflamatuar genler düzenleyen fare kullanarak ozon için maruz veya hava estrous döngüsünün farklı aşamalarında filtre.

Abstract

MikroRNA (miRNA) profil oluşturma biyoloji ve tıp çeşitli araştırma alanlarında çalışan araştırmacıların ilgi haline gelmiştir. Mevcut çalışmalar tanı ve akciğer hastalıkları Bakımı miRNAs kullanarak gelecekteki bir umut verici göster. Burada, biz miRNA inflamatuar bir ozon kaynaklı hava yolu iltihabı fare modeli akciğer dokusundan genlerinde düzenleyen tahmin miRNAs bir grup göreli bolluk ölçmek için profil oluşturma için bir iletişim kuralı tanımlar. Çünkü seks hormon düzeyleri dolaşan akciğer doğuştan gelen bağışıklık dişilerde Yönetmeliği etkileyebilir gösterilmiştir, bu yöntemin amacı protokolü dikkate alındığında estrous döngüsü dişi farelerde profil oluşturma bir enflamatuar miRNA tarif etmektir Her hayvan ozon pozlama zaman aşaması. Biz de limma, bir R/Bioconductor yazılım kullanarak miRNA bulma ve hedef tanımlama yöntemleri uygulanabilir Biyoinformatik yaklaşımlar adresi ve biyolojik bağlam ve yolları anlamaya fonksiyonel analiz yazılımı ile ilişkili fark miRNA ifade.

Introduction

mikroRNA (miRNAs) çoğu kısa (19-25 nukleotid), doğal olarak meydana gelen, kodlamayan RNA molekülleri. MiRNAs dizisi evrimsel türlerin fizyolojik fonksiyonları1düzenlenmesinde miRNAs önemini telkin, karşıdan karşıya korunmuş. mikroRNA ifade profil oluşturma işlemleri, bağışıklık yanıtı, hücre farklılaşması, gelişimsel süreçleri ve Apoptozis2de dahil olmak üzere çeşitli Yönetmelikte önemli miRNAs belirlemek için yardımcı olmak için kanıtlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, miRNAs potansiyel kullanımları hastalığı teşhis ve tedavi için kabul edilmiştir. Özellikle miRNA bilgi mRNA profil oluşturma ve diğer genom ölçekli veri3ile birleştirildiğinde gen düzenlemesi mekanizmaları eğitim araştırmacılar için miRNA ifade ölçme sistemleri düzey modelleri düzenleyici işlemlerin aydınlatmak olabilir. Öte yandan, miRNAs mRNA'ların örnek türleri bir dizi daha kararlı olmak da gösterilmiş ve aynı zamanda protein4' ten büyük hassasiyetle ölçülebilir. Akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli moleküler tanı uygulamaları için biyolojik olarak miRNAs gelişiminde büyük ilgi yol açmıştır.

Akciğer miRNAs gelişimsel süreçleri ve homeostasis bakımında önemli rol oynarlar. Ayrıca, onların anormal ifade gelişme ve ilerleme çeşitli göğüs hastalıkları5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hava kirliliği tarafından indüklenen inflamatuar akciğer hastalığı büyük önem ve hormonlar ve estrous döngüsü akciğer doğuştan gelen bağışıklık ve miRNA ifade yanıt çevre sorunları olarak düzenleyen gösteren dişilerde yoksul prognoz göstermiştir 6. bu protokol için biz edinilmiş bağışıklığın yokluğunda oluşur dişi farelerde akciğer iltihabı şeklinde ikna etmek için hava kirliliği önemli bir bileşenidir, ozon pozlama kullanın. Ozon kullanılarak, hava yolu epitel hücre hasarı ve nötrofil artış ve proksimal airways7inflamatuar aracılar ile ilişkili hava yolu hyperresponsiveness gelişimi inducing. Şu anda değil karakterize ve ozon günese maruz kalan farelerde estrous döngüsü boyunca miRNAs analiz için iyi tarif protokolleri vardır.

Aşağıda, estrous döngüsü aşamaları ve ozon için maruz dişi farelerin akciğer dokusunda miRNA ifade tanımlamak için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca miRNA bulma ve hedef tanımlama, İşlemsel Biyoloji üzerine vurgu ile etkili Biyoinformatik yaklaşımlar ele. Biz limma, gen ifade deneyler8verileri analiz etmek için tümleşik bir çözüm sağlar bir R/Bioconductor yazılım kullanarak Mikroarray veri analiz. Analizini PCR dizi verileri limma diziler/örnekler az sayıda ifade karşılaştırmak için kullanırken t-test dayalı prosedürleri güç açısından avantaj vardır. MiRNA ifade sonucu biyolojik bağlamında anlamak için o zaman fonksiyonel analiz yazılımını kullanmıştır. Transkripsiyon değişiklikleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için ve olası sonuçları tahmin etmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı miRNA-ifade veri kümeleri ve bilgi edebiyat9birleştirir. Bu sadece miRNAs kümeleri için üst üste yapılan istatistiksel zenginleştirme arayın yazılım ile karşılaştırıldığında bir avantajdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Penn State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirilmesi

  1. Düzgün bir erkek C57BL/6 fare (8 – 9 haftalık) kullanarak Machholz ve ark.10içinde açıklanan tek el fare kısıtlama tekniği dizginlemek.
  2. Steril plastik pipet 10 μL ultra saf su ile doldurun.
  3. Plastik pipet ucu vajina içine tanıtmak.
  4. Yavaşça sıvı 4-5 kez sifonu örnek toplamak için.
  5. Bir cam slayt üzerinde vajinal sıvı içeren son floş yerleştirin.
  6. 20 x amacı ile hafif bir mikroskop altında günahı vajinal floş gözlemlemek.
    Not: Pseudopregnancy ya da diğer sebepler nedeniyle normal döngüsü gösterme hayvanlar deneyden dışlanmaları gerekir. Bu endüstriyel onaylamak en az üç ardışık döngüleri için günlük vajinal salgılar gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

2. Ozon maruz

  1. En fazla 4 fareler iki 1,2 L cam kaplar tel kafes kapakları ve su ile ad libitum yerleştirin.
  2. Ozon odası ve diğer filtre uygulanmış hava pozlama odasında bir cam kap koymak.
  3. Ozon konsantrasyonu 2 ppm ve monitör ozon seviyelerine düzenli olarak ayarlayın.
    Not: Ozon aparatı düzenlenmiş bir hava akımı sağlar (> 30 hava değişiklikleri/h) ile (% 50) sıcaklığı (25 ° C) ve bağıl nem kontrollü. Sistem tarafından izlenen ve11daha önce açıklandığı gibi bir ultraviyole ozon analizörü ve kitle akış kontrolcüler, tarafından kontrol edilen bir elektrik deşarj ozonizer ozon üretir.
  4. Cam kaplar ozon/filtre hava pozlama 3 h sonra kaldırın. Hayvan yatak, gıda ve su ad libitum ile kafes dönmek.

3. akciğer koleksiyonu

  1. 4 h pozlama sonra bir ketamin/xylazine kokteyl (90 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine) mayi bir enjeksiyon hayvanlarla anestezi.
    Not: Anestezi uygun bir düzeyde onaylamak için kontrol edin bir pedal için fare (firma ayak tutam) refleks ve anestezi gerektiği gibi ayarlayın.
  2. % 70 etanol ile fare cildinizi nemlendirin.
  3. Vena kava ortaya çıkarmak için bir işletim makas ve cerrahi Cımbız kullanarak bir 2 cm ensizyon olun.
  4. Fareler tarafından vena kava ve aort transeksiyon kurban. Gerekirse, kan kan kaybı önce toplamak için böbrek damarları yukarıda vena kava 21 G gauge iğne takın. Alternatif olarak, kan yolu ile kalp ponksiyon standart protokolleri takip toplamak.
  5. Cerrahi makas karın kesip ve cilt/üst kas, yukarı doğru kaburga hareket kaldırmak için kullanın.
  6. Cerrahi makas diyafram ponksiyon için kullanın.
    Not: Akciğerler uzak diyafram çökecek.
  7. Kalp ve akciğerler duyurmak cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi kes gitsin.
  8. Forseps kullanarak, 1.5 mL microcentrifuge tüp RNase free al ve sıvı azot tüpü doldurmak için daldırın.
    Not: Sıvı azot işlemek için gözlük ve koruyucu eldiven kullanın.
  9. Akciğerleri kaldırmak, onları RNase free microcentrifuge 1,5 mL tüpler ek-doku dondurmak için sıvı azot ile dolu içine koyun ve sıvı buharlaşarak kadar birkaç saniye bekleyin.
  10. Tüp kapağını kapatın ve-80 ° C'de doku kullanmak kadar saklamak.

4. RNA hazırlık

  1. Tüm akciğer bir paslanmaz çelik dokusu Montaj cihazları-Pulverizatör kullanarak ezmek.
    Not: Doku Montaj cihazları-Pulverizatör sıvı azot içinde kullanmak için önceden yerleştirilmesi gerekiyor. Montaj cihazları-Pulverizatör RNAse çözümü ile her kullanımdan sonra temiz.
  2. Toz akciğerler bölünmüş ve iki 1,5 mL tüpler (yarım her akciğer) içine yerleştirin.
  3. Guanidinium thiocyanate örnek tüp başına 500 µL ekleyip karıştırın.  18 G, 21 G ve 23 G iğneler, sırasıyla kullanarak her örnek lunaparkçı.
    Not: Örnekleri 5,6 x 108 kopya küçük RNA spike bileşenini denetimden (farklı bir tür) çıkarma işlemine devam etmeden önce ile çivili.
  4. Her örnek ve 15 için girdap etanol 500 µL eklemek s.
  5. Yük karışımı bir spin sütunundaki bir koleksiyon tüp ve 1 dk. 12.000 x g , santrifüj atmak akışı aracılığıyla.
  6. DNaz için ben tedavi (içinde sütun);
    1. RNA yıkama arabellek ve santrifüj 400 µL 12.000 x g 1 dk. için ekleyin.
    2. RNase free tüp içinde 5 ekleyin µL DNaz, ben ve DNA sindirim x 1 75 µL tampon ve karıştırın. Mix doğrudan sütun matris ekleyin.
    3. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  7. Sütun ve 1 dk. atma akışı üzerinden 12.000 x g , santrifüj 400 µL RNA prewash çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin.
  8. 700 µL RNA yıkama arabelleği sütun ekleyin ve 1 dakika süreyle santrifüj 12.000 x g de atın akışı aracılığıyla.
  9. 12.000 x g kalan arabellek kaldırmak 2 min için de santrifüj kapasitesi. Sütun bir RNase free tüp içine aktarın.
  10. RNA elute sütun matris ve 12.000 x g , santrifüj 1,5 dk 35 µL DNaz/RNase-ücretsiz su ekleyin.
  11. Ölçmek toplam RNA konsantrasyonu (260 nm) ve saflık bir spektrofotometre kullanarak. RNA miktar bir 1,5 µL örnekte aliquot gerçekleştirmek için yönergeleri izleyin. DNaz/RNase-ücretsiz su elüsyon için kullanılan ile araç boş.
    Not: ~2.0 260/280 oranında genellikle "gibi saf" RNA için kabul edilir. Tipik RNA konsantrasyonu genellikle 750 ve 2500 ng/µL arasında değişmektedir.
  12. Mağaza-80 ° C'de

5. miRNA profil oluşturma

  1. Küçük RNA'lar, kullanım 200 ng toplam RNA'ın Retro uyarlamak için.
    1. (Toplam reaksiyon başına 20 µL birimdir) buz üzerinde ters transkripsiyon tepki karışımı hazırlayın. Her reaksiyon için 4 µL 5 x arabellek, nükleotit mix 10 x 2 µL, ters transkriptaz 2 µL ve 2 µL RNase free su ekleyin. Mix tüm bileşenleri ve aliquot 600 µL RNAse free Plastik tüpler (Mix tepki başına 10 µL).
      Not: Ters transkripsiyon ana şablon RNA dışında ilk iplikçikli cDNA sentezi için gerekli tüm bileşenleri içermektedir.
      Not: Aşırı cilt (% 10) ana karışımı hazırlarken hesaplayın.
    2. RNA şablonu ekleme (200 ng 10 µL) Ters transkripsiyon ana karışımı içeren her tüp için. Mix, santrifüj 15 1000 x g, s ve buza thermocycler veya kuru blok yerleştirme kadar saklayabilirsiniz.
    3. 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya
    4. 95 ° C'de 5 min için kuluçkaya ve tüpler buza koyun.
    5. CDNA her 20 µL Ters transkripsiyon tepki 200 µL RNase free su ekleyerek sulandırmak.
  2. Gerçek zamanlı PCR fare inflamatuar yanıt ve otoimmünite miRNA PCR dizi kullanarak gerçekleştirin.
    1. Bir reaksiyon mix (Toplam hacim 1100 µL) hazırlamak: 550 µL 2 x PCR ana Mix, 10 evrensel astar mix x 110 µL, 340 µL RNase free su ve şablon cDNA (adım 5.1.5 seyreltilmiş reaksiyon) 340 µL her tepki için ekleyin.
    2. Reaksiyon Mix 10 µL PCR çok kanallı bir pipettor kullanarak dizi önceden yüklenmiş miRNA her şey için ekleyin.
    3. MiRNA PCR dizi plaka optik yapıştırıcı film ile kapatın.
    4. 1 dk 1000 x g kabarcıklar kaldırmak için oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
    5. Program gerçek zamanlı cycler, PCR ilk harekete geçirmek için 95 ° C'de 15 dakika, adım 3-adım Bisiklete binme içeren denatürasyon 15 94 ° C'de 30 için TAV, s s 55 ° C ve uzantısı için 30 s 40 70 ° C'de devir sayısı.
      Not: Takip üreticisinin Bisiklete binme talimatları kadar gerçek zamanlı cycler ayarlamak için koşullar. Gerçek zamanlı cycler yazılımı yerleşik ayrılma eğrisi adımı gerçekleştirin.
    6. Veri çözümlemesi gerçekleştirin.

6. veri analizi

  1. CT değerleri bir analiz yazılımı her örnek için gerçek zamanlı PCR yazılım ayıklayın.
    Not: 34 A Ct değerini kesme kabul edilir. Örnekleri spike denetimi (örneğin, cel-mir-39) içeriyorsa, ani artış her örnek için denetimi için Ct değerleri normalize. Eşik değerleri el ile ayarlamanız gerekebilir. Temel değerlerini otomatik olarak ayarlanır.
  2. Altı miRNA temizlik denetimleri ortalama ct ct değerleri normalize: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, aşağıdaki denklemi kullanarak:
    ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =
  3. Kat için hesaplamaları değiştirebilir, belirli bir örnek göreli ifade denklem12kullanarak denetimi kullanarak ΔΔCt değerleri hesaplamak:
    miRNA göreli ifade:
    2-∆∆Ct, nerede - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontrol]
    Not: 200 kat değişimine kesim kabul edilir.
  4. İhracat kat Bioconductor8' limma paketi kullanarak r istatistiksel analiz gerçekleştirmek için ifade değerleri değiştirin.
  5. 13Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltin.
    Not:  R senaryonun bir kopyasını elde edilebilir vasıl: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Veri kümeleri ve analiz veri are da elde edilebilir, gen ifade Omnibus numarası GSE111667 altında https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. veri analizi: Fonksiyonel analiz yazılımı

  1. Veri kümesi düzenleyin. MiRNAs ile onların anılan sıraya göre ifade Günlük oranları ve p-değerleri içerir. Belirli veri kümesi biçimlendirmek için bkz: Tablo 1 .
  2. Açık fonksiyonel analiz yazılımı (sürüm 01-10).
  3. Aşağıdaki biçimi kullanarak veri kümesi upload: dosya biçimi: "Esnek Format", sütun üstbilgisi içerir: "Evet", tanımlayıcı türünü seçin: "miRBase (Olgun)", deneyler için kullanılan dizi platformu: dizi platform seçebilir.
    Not: Dosya biçimleri .txt kabul edilmektedir (sekmeyle sınırlandırılmış metin dosyaları), .xls (excel dosyaları) ve .diff (cuffdiff dosyaları).
  4. "Sonucuna gözlemler" seçin ve deney grubu etiketleme doğru olduğundan emin olun.
  5. "Veri kümesi eşlenen ve eşlenmemiş miRNAs toplam miktarını gözden geçirmek için Özet" için gidin.
  6. Üst "yeni" düğmesine tıkladığınızda program yaptı. "Yeni mikroRNA hedef filtresi" seçin ve mikroRNA veri kümesi yükleyin.
    1. Ayarlanmış kaynak: TarBase, marifet uzmanlar bulgular, miRecords.
    2. Güven ayarla: deneysel olarak gözlenen veya yüksek (tahmin).
    3. "Eklemek çeşitli türler, hastalıklar, dokular, yollar ve daha fazla gibi hedefleri hakkında biyolojik bilgiler eklenecek sütunları" seçin.
    4. İfade deneyinde değişti hedeflerine odaklanmak için seçin "Ekle / mRNA veri kümesini değiştirmek". "Eşleştirme ifade" mikroRNA'lar aynı veya farklı ifade düzeyleri ile bulmak için kullanın.
      Not: Filtre analiz mikroRNA adları ve semboller, mRNA hedefleri, hedef ilişki ve tahmin edilen ilişki (Şekil 2) güven düzeyini tanımlayan kaynak sağlar.
  7. "Eklemek için My filtre uygulanmış veri kümesi bir yolu tuvale göndermek ve daha fazla biyolojik ilişkileri keşfetmek için yolu"'ı tıklatın.
  8. Yol bir yayın kalitesinde model mikroRNA efektleri oluşturmak için Designer'ı kullanın.
  9. Diğer bir seçenek bir çekirdek analiz oluşturmaktır.
    1. Temel analiz türü için "İfade analizi" seçin.
    2. Ölçüm türü için "Expr günlük oranı" seçin.
    3. Analiz filtre Özeti: yalnızca molekülleri ve/veya ilişkileri düşünün nerede: (tür fare =) ve (güven deneysel olarak gözlenen =) ve (veri kaynakları = "Marifet uzman bulgular", "Marifet ExpertAssist bulgular", "miRecords", "TarBase", veya " TargetScan insan").
    4. P-değeri bir kesim seçin = 0,05.
    5. Analizi yap.
      Not: Rapora dahil edilir: kanonik yolları, ters yönde düzenleyiciler analiz, hastalıklar ve işlevler, düzenleyici etkileri, ağlar, moleküller ve daha fazlası.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Smear içinde gözlenen farklı hücre tipleri fare estrous döngüsü aşamasını (Şekil 1) tanımlamak için kullanılır. Bunlar hücre morfolojisi tarafından tanımlanır. Proestrus sırasında neredeyse sadece kümeleri yuvarlak şekilli, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücresi (Şekil 1A) hücrelerdir. Fare estrus aşamasında olduğunda, cornified skuamöz epitel hücreleri, yoğun paketlenmiş kümelerinde (Şekil 1B) mevcut hücrelerdir. Metestrus sırasında cornified epitel hücreleri ve polimorfonükleer lökositler görülür (Şekil 1 c). Diestrus, lökosit (küçük hücreleri) genellikle daha yaygın (Şekil 1 d) vardır.

Daha önce açıklanan protokol sonrası dört fare akciğerlerden RNA çıkarılan. Nükleik asit konsantrasyonu (ng / µL) 1197.9 ve ortalama 1583.1 ± 215 (Tablo 1) ile 2178.1 arasında değişmektedir. A260/A280 oranı ortalama 2,010 ortalama 2.016 ± 0,002 ile 2.020 dalgalanma. Öte yandan, gözlenen A260/A230 oranları 2.223 ortalama 2.179 ± 0,018 ile arasındaki 2.139 salınımlı.

Tablo 2 limma R. Tarih ile elde edilen fark ifade sonuçlarını gösterir Fareler arasında en iyi differentially ifade miRNAs proestrus (komut toptable kullanarak)14havada sıralamadıysanız veya filtre için ozon maruz hesaplanır. İlk sütun ozon ve filtre uygulanmış hava maruz hayvanlar arasında miRNA ifadesinde log2 kat kat değişim değeri verir. Sütun t orta t-istatistik her miRNA karşılaştırma için hesaplanan temsil eder. Sütun p.value ve adj.p.value ilişkili p-değerleri her karşılaştırma için birden çok test ayarlamasından önce ve sonra sırasıyla temsil eder. Birden fazla karşılaştırmalar için ayarlama yanlış bulma oranı15denetlemek için Benjamini ve Hochberg'ın yöntemiyle yapıldı. B sütununu temsil miRNA differentially olduğunu günlük oran8dile getirdi.

Zenginleştirme yolu analizi içerir miRNA hedef filtre ve çekirdek çözümleme yapılır. P-değeri ve 14 miRNAswith önemli ifade kütük oran listesi yükledikten sonra hepsini miRNA hedef filtresiyle (Tablo 3) eşleştirilmiş. Sonuçları filtre ve bu durumda bazı yollar "Hücresel immün yanıt" almak için sıralanır. Temel analiz kurallı yolları, hastalıklar ve fonksiyon, düzenleyiciler ve ağlar (Tablo 4) hakkında bilgiler. Fonksiyonel analiz yazılımı miRNAs ilgi ve diğer moleküller (Şekil 3) arasındaki ilişkiyi gösterir bir ağ analizi üretti.

Figure 1
Şekil 1: estrous döngüsü aşamaları tanımlaması. (A)Proestrus (ağırlıklı olarak çekirdekli epitel hücreleri); (B) estrus (ağırlıklı olarak anucleated cornified hücre); (C) metestrus (üç tür hücreler); ve (D) diestrus 2 (lökosit çoğunluğu). Ölçek çubuğu 100 µm. büyütme = 20 x =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: fonksiyonel analiz yazılım temsilcisi sonuçları: miRNA hedef filtresi. MiRNAs estrous döngüsünün farklı aşamalarında kapsamlı profil. MiRNA filtre gerçekleştirdikten sonra yazılımı genler ve hastalıklar ve Filtre Uygula ve Sırala "Hücresel immün yanıt" Bu durumda bazı yollar için almak için olabilir diğer fenotipleri karıştığı bileşikler detaylı listesi sunar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: fonksiyonel analiz yazılım temsilcisi sonuçları: ağlar. Filtre uygulanmış hava veya ozon pozlama dişilerde estrous döngüsünün farklı aşamalarında etkilenen ağlar karşılaştırılması. MiRNAs proestrus(a)veya sigara proestrus aşamaları (B) Ozon vs filtre uygulanmış hava maruz dişi farelerin akciğerlerde ile ilgili biyolojik ağların diyagramı. Bu rakam Fuentes vd.6' dan değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

KİMLİĞİ Nükleik asit (ng/µL) A260/A280 A260/A230
Örnek 1 1197.930 2.015 2.192
Örnek 2 1355.703 2.018 2.223
Örnek 3 2178.104 2.020 2.163
Örnek 4 1600.837 2,010 2.139
Ortalama 1583.144 ± 215 2.016 ± 0,002 2.179 ± 0,018

Tablo 1: örnek RNA konsantrasyonları ve absorbans oranlarıyla 260, 230 ve 280 nm dört fareler gelen arıtılmış akciğer doku örneklerinden. Konsantrasyonları bir Spektrofotometre ile ölçüldü.

logFC t P.Value ADJ. P.Val B
MMU-miR-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0.759
MMU-miR-9-5 p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
MMU-miR-221-3 p 0.385 3.106 0.003014 0.075361 -1.982
MMU-miR - 181d - 5p 0.597 2.891 0.005516 0.103424 -2.526
MMU-miR-98-5 p 0.558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
MMU-miR-712-5 p 0.667 2.563 0.013169 0.164609 -3.299
MMU-miR-106a - 5p -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

Tablo 2: Limma ozon için maruz dişilerde differentially ifade miRNAs için analiz sonuçları vs . hava proestrus aşamasında filtre.

miRNAs kimliği Gözlem 1 Gözlem 1 Gözlem 2 Gözlem 2
Expr günlük oranı P değeri Expr günlük oranı P değeri
MMU-miR-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
MMU-miR-9-5 p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004997439
MMU-miR-221-3 p 0.385 0.003014
MMU-miR - 181d - 5p 0.597 0.005516 0.342276659 0.106467657
MMU-miR-98-5 p 0.558 0.009243 0.455392799 0.034724699
MMU-miR-712-5 p 0.667 0.013169
MMU-miR-106a - 5p -0.528 0.019278

Tablo 3: olgu biçimi çok gözlem upload fonksiyonel analiz yazılımı için veri kümeleri için. Birden çok deneysel fark ifade tek bir elektronik tabloya toplanabilir ve yükledi ve gerektiği gibi çok sayıda gözlemler eklenebilir. Sütunlar: 1) miRNAs kimliği; 2) Gözlem 1: Expr günlük oranı; 3) Gözlem 1: P değeri; 4) gözlem 2: Expr günlük oranı; 5) gözlem 2: P değeri.

Sigara-proestrus Proestrus
A. tarafından differentially hedef genlerin miRNAs dile getirdi.
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
ARABALAR PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 AVEN HMBS TRIM71
HMGN2 PNP TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A DEĞİŞİKLİK1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. farklılıklar üst hastalıklar ve biyo
Hastalıkları ve bozuklukları P değeri Hastalıkları ve bozuklukları P değeri
İnflamatuar hastalık 3.84E-02 - 3.84E-05 Organizma yaralanma ve anormallikler 4.96E-02 - 2.77E-14
İnflamatuar yanıt 3.84E-02 - 3.84E-05 Üreme sistemi hastalığı 2.15E-02 - 2.77E-14
Organizma yaralanma ve anormallikler 4.17E-02 - 4.17E-05 Kanser 4.96E-02 - 1.27E-10
C. üst moleküler ve hücresel işlevler
Moleküler ve hücresel işlevler P Değer Moleküler ve hücresel işlevler P Değer
Hücresel geliştirme 2.05E-02 - 5.26E-07 Hücresel hareketi 3.77E-02 - 4.47E-07
Hücresel uzlaşma 3.75E-04 - 3.75E-04 Hücresel ölüm ve kalım 4.91E-02 - 5.61E-06
Hücre döngüsü 2.62E-03 - 2.62E-03 Hücresel geliştirme 4.97E-02 - 1.38E-06
Ö. top fizyolojik sistem geliştirme ve işlevi
Geliştirme ve işlevi P Değer Geliştirme ve işlevi P Değer
Organizma geliştirme 4.17E-02 - 1.31E-03 Embriyonik gelişim 3.30E-02 - 2.12E-05
Embriyonik gelişim 1.29E-02 - 1.29E-02 Bağ dokusu geliştirme ve işlevi 1.79E-02 - 6.10E-05
Bağ dokusu geliştirme ve işlevi 1.93E-02 - 1.93E-02 Doku morfoloji 7.88E-05 - 7.88E-05
E. Top ilişkili ağ işlevleri
İlişkili ağ işlevleri Puan İlişkili ağ işlevleri Puan
Hücresel geliştirme, inflamatuar hastalık, inflamatuar yanıt Organizma yaralanma ve anormallikler, üreme sistemi hastalığı, kanser
6 19

Tablo 4: fonksiyonel analiz yazılımı Özet olmayan-proestrus proestrus aşamaları vs ozon maruz kadın. Fonksiyonel analiz yazılımı en iyi kurallı yolları, ters yönde düzenleyiciler, hastalıkları & işlevleri, ilk işlevleri, regülatör etkisi ağlar ve daha fazla analiz sağlar. Bu tablo Fuentes vd.6' dan değiştirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MikroRNA profil oluşturma hastalık tanı ve mekanik araştırma için avantajlı bir tekniktir. Bu makale, ozon için farklı estrous döngüsü aşamaları içinde maruz dişi farelerin akciğerlerde inflamatuar genler düzenleyen tahmin edilmektedir miRNAs ifade değerlendirmek için bir protokol tanımlı. Yöntemleri gibi görsel algılama yöntemi, estrous döngüsü belirlenmesi için açıklanan16olmuştur. Ancak, bu tek seferlik ölçümler güveniyor ve bu nedenle güvenilir değildir. Doğru bir şekilde tüm estrous döngüsü aşamaları içinde düzenli olarak döngüsü dişi tanımlamak için burada açıklanan yöntemi önerilir. Ayrıca, bu basit protokolü de dolaylı olarak farelerde günlük hormonal dalgalanmaların tahmin etmek için kullanılabilir. Sadece bir kere her gün yapılması gereken örnekleme vajinal irritasyon nedeniyle istenmeyen inflamatuar yanıt aktivasyonu önlemek için. Döngüsü uzunluğu ve etkileri konut değişkenlik nedeniyle döngüsü aşamasını dikkate alınarak bir deney hayvanları kullanmadan önce 2-3 tam döngüleri için protokol işlemi yapılması önemlidir.

Akciğer dokusundan RNA'ın başarılı çıkarma için doğru bir yordam önemlidir. Bu iletişim kuralı RNA yüksek kaliteli RNA verimleri akciğer dokusundan izole etmek için bir günlük yöntemi açıklanır. Değişiklikler üreticinin iletişim kuralı için verimli bir şekilde RNA akciğerlerden ayıklamak için gerekli idi. Biz mümkün olduğunca fazla arabellek çıkarmak için yıkama tampon eklenmesiyle sonra bir ek Santrifüjü adım ekledi. Biz de su DNaz/RNase-alerjik, 35 µL ile yüksek konsantrasyon düzeyleri sağlamak 1,5 dk için sütun centrifuging RNA eluted. Spectrofluorometer sonuçları bizim RNA ayıklama Protokolü etkinliğini doğruladı. 260 ve 280 nm (A260/280 oranı) absorbans oranı RNA hazırlıklar saflığı değerlendirmek için sık kullanılır. Nükleik asitler için maksimum absorbans 260 ve 280 nm, sırasıyla var. Oranı yaklaşık 2.017ise bu "saf" RNA için kabul edilir. Aynı şekilde, A260/A230 kirlenme absorbans oranı için saflık için 2.0-2.218aralıkta değerlerdir. Bu çalışmada gözlenen ortalama A260/A280 ve A260/A230 oranları 2.016 0,002 ve 2.179 ± ± 0,018, sırasıyla edildi (Tablo 1). Bu nedenle, bizim RNA ayıklama protokolü başarılı olmuştur. Kullanılan iletişim kuralı bir diğer avantajı DNaz tedavi eklenmesidir. Bu genomik DNA kirlenme19önlemek önemlidir. Atık atmak için arıtma sütunları kullanımını bu RNA izolasyon protokol kısıtlamasıdır düşük verimleri bazı akciğer enkaz membran kısmen veya tamamen engel çünkü alkol kullanarak yağış ile sonuçlanan. Homojenizasyon adım dikkatle gerçekleştirilmez, Ayrıca, akciğer RNA büyük miktarlarda kolayca kayıp bozulmuş veya. Düşük RNA verimleri elde edilen RNA yeniden saflaştırılmış ve küçük bir hacim içinde eluted. Alternatif olarak, RNA zarlarını gecede aşağıdaki yayımlanmış protokolleri20olabilir.

MiRNA profil oluşturma için uygulanan Mikroarray teknolojileri birçok araştırma alanları gelecek vaat eden araçlardır. Bizim çalışmada, biz21miRNA sonda tabanlı diziler gibi sağlayan yüksek algılama eşik ve normalleştirme stratejileri avantajı diğer teknolojileri vs differentially ifade miRNAs tespiti için PCR dizileri kullanılır. Bu iletişim kuralı bir sınırlama RNA malzeme ve astar miRNAs RNAseq gibi kullanılabilir diğer teknikleri aksine ilgi için belirli kümelerini kullanılabilirliği başlayan bir minimum tutar gerektirmesidir. PCR tabanlı diziler bir diğer avantajı kullanımının miRNA başvuru genler (küçük genelde RNA'ların veya SNORDs gibi) qPCR normalleştirme için miRNAs fark ifadesi hesaplamak için seçenektir. Son olarak, PCR dizileri kullanarak gerçek zamanlı PCR fark ifade olsa algılamak için geleneksel yöntemler için üreticileri tarafından sağlanan çevrimiçi araçlar arasında değişen veri analizi için çeşitli seçenekler sunar. Limma ile istatistiksel analiz microarrays ve PCR tabanlı diziler için uygundur ve ampirik yönetilir Bayes f- statisitcs22kullanır. İşte, hem p ve q-değerleri (birden çok test etmek için ayarlanabilir) yanlış bulma oranı eşik ayarlama komutu toptable ile elde edilebilir ve differentially tanımlayan ifade miRNAs göstermektedir.

Fonksiyonel analiz yazılımı yol bağlamda veri analizi için web tabanlı bir uygulamadır. Yazılım araştırmacılar çerçeve veri kümeleri veya belirli hedefleri bağlamında, biyolojik önemi daha büyük bir resim içinde yardımcı olabilir güçlü arama yetenekleri sağlar. Yazılım ortamı analizi farklı türleri için esnek olmasına rağmen (yani, metabolomics, SNPs, proteomik, mikroRNA, toksikoloji, vb), amacımız burada miRNA analiz yönlerini vurgulamak olmaktır. P-değerleri ve önemli ifade günlüğü-döner sermayeyle 14 miRNAs listesini yükledikten sonra tüm yazılım tarafından eşleştirilmiş. Biz zenginleştirme yolu analiz içeren miRNA hedef filtre ve çekirdek, çözümlemenin. Ancak, bu tür analizleri için 14 miRNAs hedef ve miRNAs kendileri için öngörülen genler düşünün. Sonuçları bölümü çıkışları gibi listeler: kanonik yolları, hastalıklar ve işlevi, differentially ifade miRNAs, fizyolojik sistem geliştirme, düzenleyiciler ve ağlar (Tablo 4) hedef genlerin. Yolu görselleştirme nerede miRNAs ve moleküller faiz (Şekil 3) gene ile ilişkili bilgileri ile bağlantılı tıklanabilir düğümleri olarak gösterilen Ağ sekmesinin altında gösterilir. Hem deneysel olarak doğrulanmış ve tahmin edilen etkileşimler de dahil olmak üzere yüksek kaliteli miRNA ile ilgili bulgular fonksiyonel analiz yazılımı bir avantajdır. Fonksiyonel analiz yazılımı veritabanları içerir: deneysel olarak doğrulanmış mikroRNA-mRNA etkileşimleri veritabanları23,24, tahmin edilen mikroRNA-mRNA etkileşimi veritabanı (örneğin, dışlanan düşük güven etkileşimleri Hedef tarama)25, deneysel olarak doğrulanmış insan, sıçan ve fare mikroRNA-mRNA etkileşimleri veritabanları (örneğin, miRecords)26ve edebiyat bulgular (el ile Yayınlanan Edebiyat küratörlüğünü örneğin, mikroRNA ile ilgili bulgular bilimsel uzmanlar tarafından). Etkinliği ve kullanılabilirlik miRNA ifade ile ilişkili yolları analiz etmek için Biyoinformatik araçlarını ve karşılaştırma diğer çalışmalar bu yazılım27etkinliğini desteklemektedir. Genel olarak, hesaplama yöntemleri maliyet-etkin, daha az zaman alıcı ve moleküler yöntemlerle kolayca doğrulanabilir. Sürekli büyüme ve Biyomedikal veri birikimi ile Biyoinformatik yöntemleri miRNA aracılıklı mekanizmalar hastalığı ve biyolojik süreçlerin keşfi giderek daha güçlü hale gelecek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Acknowledgments

Bu araştırma hibe NIH K01HL133520 (PS) ve K12HD055882 (PS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Joanna Floros ozon pozlama deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 143 hava kirliliği akciğer miRNome bronchoalveolar lavaj akciğer iltihabı cinsiyet hormonları PCR diziler estrous döngüsü vajinal smear
Akciğer mikroRNA profil oluşturma arasında Estrous döngüsünde ozon maruz fareler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fuentes, N., Silveyra, P. Lung… More

Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter