Summary
ここでは、一連の機械的なプロセス、乳化および複数の遠心を含む脂肪組織から間質血管の一部を取得するためのプロトコルを提案する.
Abstract
様々 な疾患の再生ツールとなっている間質血管分数 (SVF)しかし、法律は厳密にコラゲナーゼを使用して細胞製品の臨床応用を調整します。ここでは、純粋に機械的なプロセスによって、脂肪組織から SVF 細胞と細胞外マトリックスのネイティブの注射混合物を生成するためのプロトコルを提案する.成人は遠心分離機に入れ、3 分間 1,200 x gでスピンします。中間層の収集し、二層 (下部に高密度脂肪) と上に低密度脂肪に分かれています。上位層を直接 8 x 6 x 用 20 mL/秒のレートで intersyringe シフトすることによって乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、油の層の下に粘着性物質が収集され、細胞外マトリックス (ECM) として定義されている/SVF ゲル。最上層に油が収集されます。約 5 mL のオイルは、高密度脂肪 15 mL に追加され、intersyringe シフト、6 x 8 x に 20 mL/秒のレートで乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、粘着性物質も ECM/SVF-ゲルです。ECM/SVF-ゲルのヌードマウスへの移植後、移植、収穫、組織検査によって評価。結果は、このプロダクトに通常の脂肪組織に再生成する可能性があることを示しています。この手順は、再生のための自然な支援の ECM に埋め込まれた SVF 細胞を凝縮して、シンプルで効果的な機械的解離プロシージャです。
Introduction
幹細胞療法は、様々 な疾患1の代替治療を提供することがありますので、組織の修復・再生のためのパラダイム シフトを提供します。幹細胞 (例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞) は偉大な治療可能性を秘めているが、携帯規制と倫理的配慮により制限されます。脂肪由来間葉系間質/幹細胞 (Asc) は成人と同じ制限を受けないを入手しやすいしたがって、実用的な再生医療2理想的なセルタイプをなっています。加えて、彼らは nonimmunogenic して自家脂肪3から豊富な資源があります。
現在、Asc は、脂肪組織のコラゲナーゼを介した消化によって主に得られます。脂肪組織の間質の血管分数 (SVF) には、Asc、内皮前駆細胞、血管、免疫細胞が含まれています。有益な効果があることが示された酵素によって SVF/Asc の高密度を取得、いくつかの国の法律は厳密にコラゲナーゼ4を使用してセル ベースの製品の臨床応用を調整します。SVF のセルを取得する 1 時間 30 分のコラゲナーゼと脂肪の消化準備し、生物学的汚染両方の外因性物質のリスクが高まります。付着性文化と日を週には、Asc、精製特定の検査機器が必要です。さらに、ほとんどの研究では、懸濁液中の SVF セルと Asc が使用します。細胞外マトリックス (ECM) または別のキャリアの保護がなければフリー セルを受けます、注入後、不良セルの保持を引き起こす、治療結果5を危険にさらします。これらすべての理由は、幹細胞療法のそれ以上の適用を制限します。
コラゲナーゼを介した消化せず脂肪組織から Asc を取得、遠心分離、まな板、破砕、pureeing、ミンチ、機械を含むいくつかの機械的処理は開発6,7をされています。,8,9します。 これらのメソッドは、成熟脂肪細胞とその油を含む小胞を機械的に破壊して組織と Asc を凝縮すると考えられています。また、動物における再生医療モデル8,9,10として、Asc の高濃度を含むこれらの準備はかなり治療の可能性を示した。
2013 年には、Tonnardらは接木処理11intersyringe による乳化成人の生産を含む nanofat を導入しました。Intersyringe シフトによって作成された剪断力は選択的に成熟脂肪細胞を破ることができます。彼らの調査結果に基づいて、我々 SVF 細胞と ECM/SVF-ゲル12分別された ECM だけを残して、成人の脂質と流体のほとんどを削除する純粋に機械的処理方法を開発しました。ここで、ECM/SVF-ゲルを生成するひと由来脂肪組織の機械的なプロセスの詳細について述べる。
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Protocol
この研究は、南方病院、広州、中国の倫理審査委員会によって承認されました。脂肪組織は健康なドナーから与えたインフォームド コンセントを書かれて、研究に参加する収集されました。すべての動物実験は南方病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、国民の健康および医学研究評議会 (中国) のガイドラインに従って実行されます。
1. ECM/SVF-ゲル作製
- 脂肪を収穫します。
- -0.75 で直径 1 mm のいくつかの鋭い側面穴を含む 3 mm のマルチポート カニューレと人間に脂肪吸引を行う吸引圧の atm。
- 滅菌バッグで成人の 200 mL を収集します。
- コールマン脂肪を準備します。
- 4 つの 50 mL チューブに、成人を転送でき、10 分のためにまだ立って収穫された脂肪。
- 転送する広い先端のピペットを使用して、最上位のレイヤーに 2 つの 50 mL チューブに脂肪を収集し、底層の液体の部分を破棄します。
- レイヤーを使用して 50 mL チューブ、centrifugate 脂肪 1,200 x g (RT) 室温で 3 分間。
- コールマン脂肪として上位層 (約 80 mL) を定義します。
- 全体チップ ピペットを用いて 20 mL チューブにコールマン脂肪の上部の 2/3 を転送し、低密度脂肪としてこの部分を定義します。
- 広い先端のピペットを使用して、別の 20 mL チューブにコールマン脂肪の下の 1/3 を転送し、高密度脂肪としてこの部分を定義します。
- 低密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。
- 低密度脂肪の 20 mL を intershift に (2.4 mm の内部の直径) とメス-メス ルアーロック コネクタによって接続されている 2 つの 20 mL の注射器を使用しています。
- (20 mL/秒) で安定したシフトの速度を維持し、8 x 6 x を繰り返します。
- Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。
- 10 mL チューブで上油部分を収集するには、さらに使用するため常温広い先端のピペットを使用します。
- ECM/SVF-ゲル (図 1A)、広い先端のピペットを使用して、中間層の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。
- 高密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。
- 高密度脂肪の 15 mL に 5 mL のオイル (ステップ 1.3.4 採集) を追加します。
- 注射器 6 間混合脂肪を intershift x 8 x までエマルジョン内で、くず繭を観察します。
- Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。
- 上にオイルの部分を破棄します。
- 広い先端のピペットを使用して中間層 (ECM/SVF-ゲル) の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。
- 1.3.5 と 1.4.5 の手順から ECM/SVF-ゲルを混ぜます。
2. 裸 ECM/SVF-ゲル移植モデルマウス
- 裸のマウスの麻酔 (8 週古い、女性) とイソフルレン (1%-3%)動物の手術室で麻酔します。
- ECM/SVF-ゲルを 1 mL の注射器に転送します。
- 鈍的浸潤カニューレを 1 mL 注射器を接続します。
- マウスの各側面にカニューレを皮下挿入します。
- ECM/SVF-ゲルの 0.3 mL を注入します。
3. 組織 ECM/SVF-ゲル注入後 3、15、および 90 日の収穫
- イソフルラン (1%-3%) を持つマウスを麻酔します。吸入麻酔。
- 頚部転位法によるマウスを犠牲に。
- マウスの皮膚の正中線を手術用はさみで切開を行います。
- 解剖、マウスの両側に脂肪質の接木を収穫します。一晩常温 4% パラホルムアルデヒドで脂肪質の接木を埋め込みます。
- エタノール濃度の増加のティッシュの水分を取り除く: 70% のエタノール、2 つの変更、1 h は、それぞれ;80% エタノール, 1 つの変更, 1 h。95% のエタノール、1 つの変化、1 h。100% エタノール, 3 つの変更、1.5 h 各;キシレン、3 つの変更、1.5 h。
- パラフィン ワックス (58-60 ° C)、2 つの変更、2 h で組織に潜入します。
- 組織をパラフィン ブロックに埋め込みます。約 4 μ m の厚さでセクションをカット、スライド上に置きます。
4. ヘマトキシリン ・ エオシン染色
- I、II、および III (各 10 分)、キシレンでそれらを浸すことによってパラフィン ブロック スライドを deparaffinize します。
- 濃度 (100%、100%、95%、80%、70%) の減少を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間エタノール風呂。
- 蒸留水 (5 分) の組織切片をすすいでください。
- 5 分のヘマトキシリンで切片を染色します。
- 1% アルコールに酸 20 分 Decolorize 水道の流水で切片をリンス (1% 70% アルコールで HCl) セクションが再び青になるまで水道水を実行している 5 s. リンス。
- ピペットでスライドに直接染料をエオシン Y の 2 〜 3 滴を追加し、10 分間設定染料。
- スライドを 1-5 分の水道水で洗ってください。
- (70%、80%、95%、100%、100%) 濃度の増加でスライドを脱水します。3 分間のエタノール。
- 5 分の I および II のキシレンのスライドをオフします。
- メディアのマウントのスライドをマウントします。
5. 免疫蛍光染色
- キシレンで切片を deparaffinize I、II、および III (5 分)。
- 異なる濃度 (100%、100%、95%、95%、70%) を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間アルコール風呂。
- 10 分間常温メタノール 3% H2O2ソリューションのセクションを孵化させなさい。
- スライド 2 を洗い 5 分蒸留水 x。
- スライド バスケットのスライドを削除します。300 mL の 10 mM クエン酸バッファー (pH 6.0) を追加し、95 から 100 ° c 10 分のスライドを孵化させなさい。
- RT の 20 分間のスライドをクールします。
- スライド 2 をすすぎリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、5 分で x。
- スライド上に 10% 牛胎児血清の 100 μ L を追加し、1 時間室温で加湿チャンバーで孵化させなさい。
- 4 ° C で一次抗体溶液 (モルモット抗マウス Perilipin、1: 400) でセクションを一晩インキュベートします。
- PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。
- 二次抗体の解決セクションを孵化させなさい (ヤギ反ギニア豚 488 IgG) 室温 2 時間
- PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。
- きれいなティッシュ ペーパーのセクションの周りの水を拭き取る。
- スライドのセクションをカバーするサークルに 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と Alexa Fluor 488 共役 isolectin をドロップします。
- Coverslips をマウントし、暗闇の中で乾燥させます。
- スライドを蛍光顕微鏡で観察します。
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Representative Results
ECM/SVF-ゲルにコールマン脂肪を処理した後破棄された石油の量は最終巻の 80% とオイルの層の下で保持される脂肪の 20% だけは ECM/SVF-ゲル (図 1A) とみなされます。ECM/SVF-ゲルは 27 G 針; を通過することができます滑らかな液体のような質感しかし、コールマン脂肪は大規模な繊維と一体脂肪構造で構成されています、18 G カニューレ (図 1B) を通過することができますのみ。
移植後 3 日目、複数の細胞内脂肪滴、豊富な血管に富んだ結合組織浸潤炎症細胞と脂肪細胞を小型の多数に出演。15 日以降は、徐々 に減少に開始された炎症細胞の数と脂肪細胞が成熟し始めた。90 日でグラフト血管の結合組織のほとんどは、成熟脂肪細胞 (図 2、上部のパネル) に置き換えられていた。
ECM/SVF-ゲル移植は、移植後 3 日数 perilipin 正脂肪細胞を含まれています。複数の細胞内脂肪滴脂肪細胞を小型が 15 日に現れはじめた。ECM/SVF-ゲルの各フィールドは、多数の perilipin 正脂肪細胞と新しく形成された血管 (図 2、下部のパネル) を示した 90 日のセクションを移植します。
図 1: ECM/SVF-ゲルの画像。遠心のコールマン脂肪と ECM/SVF-ゲル (A) を処理した後。ECM/SVF-ゲルは 27 G の針を通して簡単に注入できます。しかし、コールマン脂肪はだけ 18 G カニューレ (B) を通過できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ECM/SVF-ゲル移植後の組織変化します。ECM/SVF-ゲルは、広範な血管に富んだ結合組織と 3 日目の炎症細胞の浸潤を示した。その後、血管の結合組織のほとんどは、成熟脂肪細胞 (上部パネル) を含む構造体に置き換えられました。免疫蛍光染色ショー組織のほとんどは 3 日目 perilipin 負領域の構成されます。15 日で perilipin + 脂肪細胞の大部分が登場しました。(下段) の 90 日後多数 perilipin 正脂肪細胞が見つかりました。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
幹細胞を用いた再生治療法は、さまざまな病気に大きな潜在的な利点を示しています。簡単に取得し、組織の修復と15新しい組織の再生能力を持っているので、Asc、卓越した治療候補です。ただし、セルおよび6を処理するコラゲナーゼを分離する複雑な手続きを必要とするので、臨床応用を拡大する制限があります。したがって、コラゲナーゼを使用せず幹細胞を取得する単純な手法の開発が不可欠です。
本研究ではネイティブ脂肪 ECM によって保護されている SVF のセルを取得する脂肪組織の純粋に機械的なプロセスを提案します。さらに、このプロセスは、コラゲナーゼ無料です。前研究と比較して異なる intersyringe 回を処理および 10 mL/秒の流量で 1 分は ECM/SVF-ゲル12を製造するための最適なプロトコル、標準コールマン脂肪の intersyringe 処理がわかった。Intersyringe シフトを使用することにより、成人のほとんどの脂肪細胞は、SVF 細胞と ECM 保存のほとんど破棄されます。したがって、シフト intersyringe は、全体のプロセスの重要なステップです。Intersyringe 変速とシフトの実施時間は、intersyringe プロセスによって作成された sheering 力シフトの速度と関連付けられるため脂肪組織の破壊レベルを決定します。シフト速度は 20 mL で安定している必要があります/overdestruction 結果 SVF 細胞の損傷で米が不足して破壊残りの不要な脂肪につながることをお勧めします。このプロトコルの製品は以下の基準に達した場合にのみ、ECM/SVF-ゲルとして定義できます: 1)、最終巻は最初のボリュームの ~ 20%2) 27 G 針によって注入されます簡単に。以前研究示した両 CD45 の高密度を含む ECM/SVF-ゲル/CD31-/cd34 Asc と SVF の細胞密度は > 105セル/mL12× 4.0。
ECM/SVF-ゲルを作成する過程で、遠心分離は実施 2 x、前に、intersyringe シフト後だったシフト intersyringe、前に遠心分離を使用して、脂肪の「傾斜密度」を作成します。これは、別の重要なステップです。それは、遠心分離後、下部に高密度脂肪層は凝縮した ECM が豊富ですより少ないオイルは、低密度脂肪質の層の上には多くの石油が ECM 繊維16,17以下に実証されています。したがって、これらの 2 つのレイヤーに 2 つの異なる方法で処理されます。低密度脂肪は、脂肪細胞を破壊する intersyringe 処理を直接受けることができます。ただし、底層高密度脂肪脂肪細胞の破壊を容易にする追加のオイルが必要です。追加オイルは、はるかに簡単にシフトを作る高密度脂肪の密度を減らすことができます。さらに、油は、壊れた脂肪細胞; からより多くのオイルを抽出を助けることができます。ただし、水性液はできません。したがって、我々 は高密度脂肪に余分な油を追加しました。シフト intersyringe 後遠心分離は、SVF 細胞と ECM から油部分を分離することです。最終製品で油は避けるべき。
ECM/SVF-ゲルの移植は、大きな保持率で起因しました。我々 は上記、ECM/SVF-ゲルの処理の重要なステップは、intersyringe シフト、脂肪細胞のほとんどを破壊します。したがって、小さな脂肪細胞は ECM/SVF-ゲルに残った。図 2のように、小さな perilipin 正領域は 3 日目に移植された ECM/SVF ゲルで登場。ただし、15 日後 perilipin 正脂肪細胞の多くは登場、90 日後に成熟したなった。以前の研究では、ホスト細胞性脂肪組織再生14を ECM/SVF-ゲルの移植に誘導を示しています。抗ひと白血球抗原を使用すると、新たに形成された脂肪細胞の起源を識別するために、我々 は、SVF で細胞のほとんどが移植から派生したものの、新たに形成された脂肪のほとんどが宿主由来を発見しました。ECM/SVF-ゲルは、我々 は以前報告した偉大な再生機能。この製品は、創傷治癒の12の素晴らしい治療効果を持っていた。さらに、それは血管新生10を加速することによってマウス モデルにおける遊離皮弁の生存率を改善するために助けた。
SVF ゲルは、ネイティブの ECM と機能的な細胞成分を含む自己注射です。製品は、規制の問題について心配することがなく簡単に実行できる、単純な機械のプロセスによって lipoaspirate から生成されます。ただし、ECM/SVF-ゲルの再生の効果は不明します。ECM/SVF-ゲルの有益な効果を特徴付けるより、ために ECM/SVF-ゲルの再生効果の分子メカニズムを特徴付けるためのより詳しい調査は方法にあります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は (81471881、81601702、81671931) 中国の国家自然科学基金、中国の広東省 (2014A030310155) の管理者南方病院財団 (2014B009、自然科学財団によって支えられました。2015Z002、2016Z010、2016B001)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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