Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

पुनर्योजी चिकित्सा के लिए लिपोएपएपएट्स का यांत्रिक माइक्रोनाइजेशन

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58765
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम यांत्रिक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से वसा ऊतक से stromal नाड़ी अंश प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, जो पायसीकरण और कई केंद्रापसारक शामिल हैं.

Abstract

Stromal संवहनी अंश (SVF) विभिंन रोगों के लिए एक पुनर्योजी उपकरण बन गया है; हालांकि, कानून कड़ाई से कोलेसेनाज़ का उपयोग कर सेल उत्पादों के नैदानिक अनुप्रयोग को विनियमित करता है । यहाँ, हम एक विशुद्ध रूप से यांत्रिक प्रक्रिया द्वारा वसा ऊतक से SVF कोशिकाओं और देशी extracellular मैट्रिक्स का एक इंजेक्शन मिश्रण उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश. लिपोस्पार्ट्स को सेंट्रीफ्यूज में डाल दिया जाता है और 3 मिनट के लिए १,२०० x g पर काता जाता है । मध्य परत एकत्र की है और दो परतों में विभाजित (उच्च घनत्व वसा नीचे और कम घनत्व वसा शीर्ष पर) । ऊपरी परत सीधे 6 x से 8x के लिए 20 मिलीलीटर/s की दर से, intersyringe शिफ्टिंग द्वारा इमल् सीफाइड है । इमल् सीफाइड फैट 3 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक है, और तेल की परत के तहत चिपचिपा पदार्थ एकत्र और extracellular मैट्रिक्स (ecm) के रूप में परिभाषित/ ऊपर की परत पर तेल एकत्र किया जाता है । लगभग 5 मिलीलीटर उच्च घनत्व वसा के 15 मिलीलीटर और intersyringe स्थानांतरण द्वारा इमल् सीफाइड, 6x से 8x के लिए 20 मिलीलीटर/s की दर से जोड़ा जाता है । इमल् सीफाइड फैट को 3 मिनट के लिए २,००० x g पर सेंट्रीफ्यूज्ड किया जाता है, और चिपचिपा पदार्थ भी ECM/svf-gel है । नग्न चूहों में ECM/SVF-gel के प्रत्यारोपण के बाद, भ्रष्टाचार काटा और histologic परीक्षा द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । परिणाम से पता चलता है कि इस उत्पाद को सामांय वसा ऊतक में पुनर्जीवित करने की क्षमता है । यह प्रक्रिया एक सरल, प्रभावी यांत्रिक वियोजन प्रक्रिया के लिए SVF पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए अपने प्राकृतिक सहायक ECM में एंबेडेड कोशिकाओं गाढ़ा है ।

Introduction

स्टेम सेल उपचार ऊतक की मरंमत और पुनर्जनन के लिए एक प्रतिमान बदलाव प्रदान करते है ताकि वे विभिंन रोगों के लिए एक वैकल्पिक चिकित्सीय आहार की पेशकश कर सकते है1। स्टेम सेल (जैसे, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं) महान चिकित्सकीय क्षमता है, लेकिन सेल विनियमन और नैतिक विचारों के कारण सीमित हैं । एक ही प्रतिबंध के अधीन नहीं है और lipoaspirates से प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं, एक प्रकार का पनीर (ASCs) इस प्रकार, यह व्यावहारिक पुनर्योजी चिकित्सा2के लिए एक आदर्श कोशिका प्रकार बन गया है । इसके अलावा, वे नॉनइम्यूनोजेनिक हैं और ऑटोलॉजिस्ट फैट3से प्रचुर मात्रा में संसाधनों है ।

वर्तमान में, ASCs मुख्य कोलेरेन्ज़ द्वारा प्राप्त कर रहे हैं-वसा ऊतकों की मध्यस्थता पाचन. वसा ऊतक के stromal संवहनी अंश (SVF) ASCs शामिल हैं, endothelial जनक सेल, pericytes, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं । हालांकि SVF/ASCs के एक उच्च घनत्व प्राप्त करने के लिए लाभदायक प्रभाव है दिखाया गया था, कई देशों में कानून कड़ाई से सेल के नैदानिक आवेदन-आधारित उत्पादों कोलेसेनाज़4का उपयोग नियंत्रित करता है । एसडब्ल्यूएफ कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 30 मिनट के लिए कोलेजेनएज के साथ वसा ऊतक पचाने की तैयारी और जैविक संदूषण में दोनों बहिर्जात सामग्री का खतरा बढ़ जाता है । आसंन संस्कृति और ASCs की शुद्धि, जो सप्ताह के लिए दिन लेता है, विशिष्ट प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है । इसके अलावा, ज्यादातर अध्ययनों में, SVF कोशिकाओं और ASCs निलंबन में उपयोग किया जाता है । बाह्य मैट्रिक्स (ECM) या किसी अन्य वाहक के संरक्षण के बिना, मुक्त कोशिकाओं को कमजोर कर रहे हैं, इंजेक्शन के बाद एक गरीब सेल प्रतिधारण कारण, और उपचारात्मक परिणाम5समझौता. इन कारणों के सभी स्टेम सेल थेरेपी के आगे आवेदन सीमा ।

कोलेसेनाज के बिना वसा ऊतक से ascs प्राप्त करने के लिए-mediated पाचन, कई यांत्रिक प्रसंस्करण प्रक्रियाओं, केंद्रापसारक सहित, यांत्रिक काट, shredding, pureeing, और mincing, विकसित किया गया है6,7 , 8 , 9. इन विधियों यंत्रवत् परिपक्व adipocytes और उनके तेल युक्त vesicles बाधित द्वारा ऊतक और ascs गाढ़ा करने के लिए सोचा जाता है । इसके अलावा, इन तैयारियों, ascs के उच्च सांद्रता युक्त, पशु मॉडल8,9,10में पुनर्योजी दवा के रूप में काफी चिकित्सकीय क्षमता दिखाया ।

में २०१३, tonnard एट अल. nanofat कलम बांधने तकनीक है, जो intersyringe प्रसंस्करण11द्वारा इमल् सीफाइड लिपोसटेट उत्पादन शामिल शुरू की । एक साथ intersyringe स्थानांतरण द्वारा बनाई गई बाल काटना बल चुनिंदा परिपक्व adipocytes तोड़ सकते हैं । उनके निष्कर्षों के आधार पर, हम एक विशुद्ध रूप से यांत्रिक प्रसंस्करण विधि विकसित की है कि लिपिड के सबसे हटा और lipoaspirates में तरल पदार्थ, केवल SVF कोशिकाओं और fractionated ECM, जो ECM है जा/ इसके साथ ही, हम मानव व्युत्पन्न वसा ऊतक की यांत्रिक प्रक्रिया के विवरण का वर्णन करने के लिए ECM/SVF-जेल का उत्पादन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस शोध को नानफांग अस्पताल, गुआंगज़ौ, चीन में एथिकल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । स्वस्थ दानदाताओं से वसा ऊतक एकत्र किया गया था जिसने अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित सूचित सहमति दी थी । सभी पशु प्रयोगों को नानफांग अस्पताल संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और राष्ट्रीय स्वास्थ्य एवं चिकित्सा अनुसंधान परिषद (चीन) के दिशा-निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

1. ECM/SVF-जेल तैयारी

  1. फसल वसा ।
    1. सक्शन दबाव के ०.७५ एटीएम में, व्यास में 1 मिमी के कई तेज पक्ष छेद शामिल हैं, जो एक 3 मिमी बहुद्वारक प्रवेसूल, के साथ एक मानव पर लिपोसक्शन प्रदर्शन.
    2. एक बाँझ बैग में लिपोसएट्स की २०० मिलीलीटर लीजिए ।
  2. कोलमैन फैट तैयार करें ।
    1. ४ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में lipoaspirates हस्तांतरण और काटा वसा 10 मिनट के लिए अभी भी खड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. स्थानांतरण करने के लिए एक व्यापक टिप पिपेट का उपयोग करके २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में शीर्ष परत पर वसा ले लीजिए, और नीचे की परत पर तरल भाग त्यागने ।
    3. ५० मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग करना, 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर १,२०० एक्स जी पर वसा परत केंद्रापसारक ।
    4. ऊपरी परत (लगभग ८० मिलीलीटर) को कोलमैन फैट के रूप में परिभाषित करें ।
    5. एक चौड़े टिप पिपेट का उपयोग करके एक 20 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोलमैन फैट के ऊपरी 2/3 स्थानांतरण, और कम घनत्व वसा के रूप में इस हिस्से को परिभाषित ।
    6. एक चौड़े टिप पिपेट का उपयोग करके एक और 20 मिलीलीटर ट्यूब के लिए कोलमैन फैट के निचले 1/3 हस्तांतरण, और उच्च घनत्व वसा के रूप में इस हिस्से को परिभाषित ।
  3. कम घनत्व वसा से ECM/SVF-gel का उत्पादन ।
    1. एक महिला से महिला Luer-लॉक कनेक्टर से जुड़े २ २० मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना (२.४ मिमी के एक आंतरिक व्यास के साथ) कम घनत्व वसा के 20 मिलीलीटर इंटरशिफ्ट करने के लिए ।
    2. स्थानांतरण गति स्थिर रखें (20 मिलीलीटर/s पर) और 6x से 8x के लिए दोहराएं ।
    3. 3 मिनट के लिए RT पर २,००० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक ।
    4. आगे उपयोग के लिए RT पर एक चौड़े टिप पिपेट का उपयोग करके एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में शीर्ष पर तेल भाग लीजिए ।
    5. मध्यम परत में चिपचिपा पदार्थ लीजिए, जो एक चौड़े टिप पिपेट का उपयोग करके ECM/SVF-gel (चित्रा 1A) है, और नीचे की परत पर द्रव को त्यागें ।
  4. उच्च घनत्व वसा से ECM/SVF-gel का उत्पादन ।
    1. उच्च घनत्व वसा के 15 मिलीलीटर के लिए तेल की 5 मिलीलीटर (कदम 1.3.4 से एकत्र) जोड़ें ।
    2. सीरिंज 6x से 8x के बीच मिश्रित वसा को तब तक इंटरशिफ्ट करें जब तक कि पायस के भीतर एक फलोकुलेट न हो जाए ।
    3. 3 मिनट के लिए RT पर २,००० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक ।
    4. शीर्ष पर तेल भाग छोड़ें ।
    5. एक चौड़े टिप पिपेट का उपयोग करके मध्यम परत (ECM/SVF-gel) में चिपचिपा पदार्थ ले लीजिए और नीचे की परत पर द्रव त्याग ।
    6. मिक्स चरण 1.3.5 और 1.4.5 से ECM/SVF-जेल ।

2. नग्न माउस ECM/SVF-जेल Graft मॉडल

  1. Anesthetize नग्न चूहों (8 सप्ताह पुराना, महिला) isoflurane के साथ (1%-3%) एक पशु आपरेशन कमरे में साँस लेना संवेदनाहरण ।
  2. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज करने के लिए ECM/SVF-जेल स्थानांतरण ।
  3. 1 मिलीलीटर सिरिंज एक कुंद घुसपैठ प्रवेसूल के साथ कनेक्ट करें ।
  4. प्रवेक्षण को माउस के प्रत्येक पार्श्व में सम्मिलित करें ।
  5. ईएसएम/एसडब्ल्यूएफ-जेल की ०.३ मिलीलीटर सुई ।

3.3, 15 पर ऊतक संचयन, और ९० दिनों के बाद ECM/SVF-gel Injection)

  1. आइसोफ्लुर्न के साथ चूहों को एनस्थेटाइज़ (1%-3%) साँस लेना संवेदनाहरण.
  2. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था विधि द्वारा चूहों बलिदान ।
  3. शल्य कैंची के साथ माउस की पृष्ठीय त्वचा की मिडलाइन पर एक चीरा बनाओ ।
  4. माउस के दोनों किनारों पर वसा grafts काटना और फसल. में फैट grafts एंबेड 4% paraformaldehyde RT पर रातोंरात ।
  5. इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में ऊतक Dehydrate: ७०% इथेनॉल, दो परिवर्तन, 1 एच प्रत्येक; ८०% इथेनॉल, एक परिवर्तन, 1 एच; ९५% इथेनॉल, एक परिवर्तन, 1 एच; १००% इथेनॉल, तीन परिवर्तन, १.५ एच प्रत्येक; xylene, तीन परिवर्तन, १.५ एच प्रत्येक ।
  6. पैराफिन मोम (५८-६० डिग्री सेल्सियस), दो परिवर्तन, 2 एच प्रत्येक के साथ ऊतक घुसपैठ ।
  7. पैराफिन ब्लॉकों में ऊतक एंबेड । के बारे में 4 μm की मोटाई में काट वर्गों और उंहें स्लाइड पर डाल दिया ।

4. Hematoxylin और Eosin धुंधला करना

  1. उंहें xylene मैं, द्वितीय, और III (10 मिनट प्रत्येक) में भिगोने से पैराफिन ब्लॉक स्लाइड प्रस्थान ।
  2. उंहें कम सांद्रता (१००%, १००%, ९५%, ८०%, ७०%) के माध्यम से पारित करके ऊतक वर्गों Rehydrate 3 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल स्नान की ।
  3. डिस्टिल्ड पानी (5 मिनट) में ऊतक वर्गों कुल्ला ।
  4. 5 मिनट के लिए hematoxylin में ऊतक वर्गों दाग ।
  5. 20 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में ऊतक वर्गों कुल्ला । 1% एसिड अल्कोहल में Decolorize (७०% शराब में 1% एचसीएल) 5 एस के लिए नल का पानी चलाने में कुल्ला जब तक वर्गों नीले फिर से कर रहे हैं ।
  6. पिपेट द्वारा स्लाइड पर सीधे Eosin Y डाई के दो से तीन बूंदें जोड़ें, और डाई 10 मिनट के लिए निर्धारित करते हैं ।
  7. 1-5 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड धो लें ।
  8. सांद्रता बढ़ाने में स्लाइड् स को डिहाइड्रेट करें (७०%, ८०%, ९५%, १००%, १००%) 3 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल की ।
  9. xylene मैं और द्वितीय में 5 मिनट प्रत्येक के लिए स्लाइड स्पष्ट करें ।
  10. बढ़ते मीडिया में स्लाइड् स माउंट ।

5. इमयूनोफ्लोरोसेंट अभिरंजक

  1. xylene मैं, द्वितीय, और III (5 मिनट प्रत्येक) में ऊतक वर्गों प्रस्थान ।
  2. विभिन्न सांद्रता (१००%, १००%, ९५%, ९५%, ७०%) के माध्यम से उन्हें पारित करके ऊतक वर्गों को पुनः हाइड्रेट करना 3 मिनट प्रत्येक के लिए शराब स्नान की ।
  3. एक 3% एच2ओ2 में मेथनॉल में समाधान के लिए 10 मिनट के लिए आर टी में वर्गों इनसेबेट ।
  4. आसुत पानी, 5 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड 2x कुल्ला ।
  5. स्लाइड् स को स्लाइड बास्केट में छोड़ें । 10 मिमी साइट्रेट बफर (पीएच ६.०) के ३०० मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए ९५-१०० डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड इनसेट ।
  6. आरटी में 20 मिनट के लिए स्लाइड कूल ।
  7. फास्फेट के साथ स्लाइड 2x कुल्ला-buffered खारा (PBS), 5 मिनट प्रत्येक ।
  8. स्लाइड पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के १०० μL जोड़ें और 1 एच के लिए आरटी में एक humidified चैंबर में सेते ।
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (गिनी पिग एंटी-माउस पेरिलिपिन, 1:400) के साथ अनुभागों को रातोंरात 4 ° c पर सेते हैं ।
  10. PBS 3x, 5 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड कुल्ला ।
  11. आर टी पर 2 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी गिनी पिग-४८८ IgG) के साथ वर्गों इनसेबेट ।
  12. PBS 3x, 5 मिनट प्रत्येक के साथ स्लाइड कुल्ला ।
  13. साफ ऊतक कागज के साथ खंड के चारों ओर पानी पोंछ ।
  14. ड्रॉप 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और Alexa Fluor ४८८-संयुग्मित आइसोलेक्टिन वृत्त में स्लाइड पर अनुभाग को कवर करने के लिए ।
  15. coverslips माउंट और उंहें अंधेरे में सूखी ।
  16. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड निरीक्षण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ECM/SVF-gel के लिए कोलमैन फैट संसाधित करने के बाद, त्याग तेल की मात्रा अंतिम मात्रा का ८०% लेता है, और तेल परत के तहत संरक्षित वसा ऊतक के केवल 20% ECM/SVF-जेल (चित्रा 1ए) के रूप में माना जाता है । ECM/SVF-gel एक चिकनी तरल की तरह बनावट है कि यह एक 27 जी ठीक सुई के माध्यम से जाने के लिए सक्षम बनाता है; हालांकि, कोलमैन फैट बड़े फाइबर के साथ एक अभिन्न वसा संरचना के शामिल है और केवल एक 18 ग्राम प्रवेशनी (चित्रा 1बी) के माध्यम से जा सकते हैं ।

प्रत्यारोपण के बाद 3 दिन पर, कई intracellular लिपिड बूंदों के साथ छोटे आकार के preadipocytes की बड़ी संख्या, व्यापक अच्छी तरह से संयोजी ऊतक vascularized, और घुसपैठ भड़काऊ कोशिकाओं दिखाई दिया । 15 दिन की शुरुआत में, भड़काऊ कोशिकाओं की संख्या धीरे से कम हो जाना शुरू कर दिया, और adipocytes परिपक्व करने के लिए शुरू किया । दिन ९० तक, grafts में vascularized संयोजी ऊतक के अधिकांश परिपक्व adipocytes द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था (चित्रा 2, ऊपरी पैनल).

ECM/SVF-gel grafts कुछ perilipin-सकारात्मक adipocytes, प्रत्यारोपण के बाद 3 दिन निहित । कई intracellular लिपिड बूंदों के साथ छोटे आकार के preadipocytes 15 दिन पर प्रदर्शित करने के लिए शुरू किया । दिन ९० पर ecm/svf-जेल भ्रष्टाचार वर्गों के प्रत्येक क्षेत्र में कई perilipin-सकारात्मक adipocytes और नव गठित रक्त वाहिकाओं (चित्रा 2, कम पैनल) दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1 : ECM/SVF-gel की छवियां । अपकेंद्री कोलमैन फैट और ECM/SVF-gel (A) संसाधित करने के बाद । ECM/SVF-gel को आसानी से एक 27 ग्राम सुई के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है; हालांकि, कोलमैन फैट केवल एक 18 ग्राम कैंला (बी) के माध्यम से पारित कर सकते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रत्यारोपण के बाद ECM/SVF-जेल में Histological परिवर्तन । ECM/SVF-gel व्यापक अच्छी तरह से vascularized संयोजी ऊतक और 3 दिन पर भड़काऊ कोशिकाओं घुसपैठ दिखाया । बाद में, vascularized संयोजी ऊतक के अधिकांश परिपक्व adipocytes (ऊपरी पैनल) युक्त एक संरचना द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था । इमयूनोफ्लोरोसेंट धुंधला करने से पता चलता है कि ऊतक के अधिकांश दिन 3 पर पेरिलिपिन नकारात्मक क्षेत्र के शामिल है । 15 दिन तक, पेरिलिपिन + एडिपोसाइट्स का एक बड़ा हिस्सा दिखाई दिया । ९० दिन (लोअर पैनल) के बाद कई पेरिलिपिन पॉजिटिव एडिपोसाइट्स पाए गए । स्केल सलाखों = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्टेम सेल आधारित पुनर्योजी चिकित्सा विभिन्न रोगों में एक महान संभावित लाभ दिखाया गया है. ASCs बकाया चिकित्सकीय उंमीदवारों क्योंकि वे प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे है और ऊतक की मरंमत और उपंयास ऊतक15के उत्थान के लिए क्षमता है । हालांकि, वहां अपनी नैदानिक आवेदन के विस्तार की सीमाएं हैं, क्योंकि यह जटिल प्रक्रियाओं के लिए कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता है और6प्रसंस्करण के लिए collagenase । इस प्रकार, यह एक सरल तकनीक का विकास करने के लिए आवश्यक है के लिए कोलेज्नेस के उपयोग के बिना स्टेम सेल प्राप्त करते हैं ।

इस अध्ययन में, हम वसा ऊतक के एक विशुद्ध यांत्रिक प्रक्रिया प्रस्तुत SVF कोशिकाओं है, जो देशी वसा ECM द्वारा संरक्षित कर रहे हैं प्राप्त करने के लिए । इसके अलावा, इस प्रक्रिया कोलेलेनज़ मुक्त है । एक पिछले अध्ययन के विभिंन intersyringe प्रसंस्करण टाइंस की तुलना में और पता चला है कि 10 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर 1 मिनट के लिए मानक कोलमैन फैट के intersyringe प्रसंस्करण (ECM/SVF-gel12के उत्पादन के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल है । intersyringe स्थानांतरण का उपयोग करके, lipoaspirates में सबसे adipocytes SVF कोशिकाओं और संरक्षित ECM के अधिकांश के साथ नष्ट कर रहे हैं । इस प्रकार, intersyringe शिफ्टिंग पूरी प्रक्रिया का महत्वपूर्ण कदम है । intersyringe बदलने की गति और समय बिताने का आयोजन पर खर्च के लिए वसा ऊतकों के विनाश के स्तर का निर्धारण क्योंकि intersyringe प्रक्रिया के द्वारा बनाई गई शीरिंग बल स्थानांतरण गति के साथ जुड़ा हुआ है । हमारा सुझाव है कि शिफ्टिंग की गति 20 मिलीलीटर पर स्थिर होनी चाहिए । अपर्याप्त विनाश की ओर जाता है, जबकि शेष SVF कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने में परिणाम overdestruction अवांछित adipocytes, । इस प्रोटोकॉल के उत्पाद ECM/SVF-जेल के रूप में परिभाषित किया जा सकता है केवल अगर यह निंनलिखित मानदंड तक पहुंच: 1) इसकी अंतिम मात्रा ~ प्रारंभिक मात्रा का 20% है; 2) यह आसानी से एक 27 ग्राम सुई के माध्यम से इंजेक्शन है । पिछले अध्ययन में यह दर्शाया गया है कि ECM/SVF-gel में CD45-/CD31-/CD34 + ASCs और SVF सेल घनत्व दोनों के उच्च घनत्व हैं, > 4.0 x 105 सेल/एमएल12।

ECM/SVF-gel बनाने की प्रक्रिया के दौरान, सेंट्रीफ्यूगेशन 2x आयोजित किया गया था, पहले और बाद में intersyringe शिफ्टिंग. intersyringe स्थानांतरण से पहले, हम "ग्रेडेड घनत्व" वसा के बनाने के लिए केंद्रापसारक का उपयोग करें । यह एक महत्वपूर्ण कदम है । यह साबित हो गया है कि उच्च घनत्व वसा परत नीचे, केंद्रापसारक के बाद, गाढ़ा ecm में समृद्ध है, लेकिन कम तेल है, जबकि शीर्ष पर कम घनत्व वसा परत अधिक तेल लेकिन कम ecm फाइबर16,17है । इस प्रकार इन दोनों परतों को दो भिन्न तरीकों से संसाधित किया जाना चाहिए । कम घनत्व वसा सीधे intersyringe प्रसंस्करण से गुजरना करने के लिए adipocytes को नष्ट कर सकते हैं । हालांकि, उच्च घनत्व वसा नीचे की परत में अतिरिक्त तेल की आवश्यकता को adipocytes के विनाश की सुविधा । जोड़ा तेल उच्च घनत्व वसा के घनत्व में कमी कर सकते हैं, बहुत आसान स्थानांतरण कर रही है । इसके अलावा, तेल की मदद कर सकते है टूटे adipocytes से अधिक तेल निकालने; हालांकि, जलीय तरल नहीं कर सकते । इस प्रकार, हम उच्च घनत्व वसा के लिए अतिरिक्त तेल जोड़ा । intersyringe स्थानांतरण के बाद केंद्रापसारक को SVF कोशिकाओं और ECM से तेल भाग अलग है । तेल अंतिम उत्पाद में परहेज करना चाहिए ।

ECM/SVF-gel का प्रत्यारोपण एक महान अवधारण दर के परिणामस्वरूप हुआ । जैसा कि हम ऊपर उल्लेख किया है, ECM/SVF-जेल के प्रसंस्करण के महत्वपूर्ण कदम intersyringe स्थानांतरण है, जो adipocytes के अधिकांश नष्ट कर देता है । इस प्रकार, छोटे adipocytes ECM/SVF-जेल में बने रहे । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, एक छोटा सा perilipin-सकारात्मक क्षेत्र 3 दिन पर प्रत्यारोपित ecm/svf-जेल में दिखाई दिया । हालांकि, 15 दिनों के बाद, प्रीलिपिन के बहुत-से पॉजिटिव एडिपोसाइट्स दिखाई दिए और ९० दिनों के बाद परिपक्व हो गए । पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि ECM/SVF-जेल प्रेरित मेजबान सेल-mediated वसा ऊतक पुनर्जनन के प्रत्यारोपण14। विरोधी मानव ल्यूकोसैट प्रतिजन का उपयोग करने के लिए नवगठित adipocytes के मूल की पहचान, हमें पता चला कि, हालांकि SVF में कोशिकाओं के अधिकांश graft-व्युत्पंन थे, नवगठित वसा ऊतक के सबसे मेजबान था व्युत्पंन । ECM/SVF-gel एक महान पुनर्योजी समारोह है, जैसा कि हम पहले की सूचना दी । इस उत्पाद घाव भरने12में महान उपचारात्मक प्रभाव था । इसके अलावा, यह एक चूहे के मॉडल में मुक्त प्रालंब के जीवित रहने की दर में सुधार करने के लिए10angiogenesis की गति से मदद की ।

SVF-जेल एक ऑटोलॉजिकल इंजेक्शन युक्त देशी ECM और कार्यात्मक सेलुलर घटकों है । उत्पाद एक सरल यांत्रिक प्रक्रिया है, जो आसानी से किसी भी विनियामक मुद्दों के बारे में चिंताओं के बिना प्रदर्शन किया जा सकता द्वारा lipoaspirate से उत्पंन होता है । हालांकि, ECM/SVF-gel का पुनर्योजी प्रभाव अस्पष्ट रहता है । बेहतर ECM/SVF-जेल के लाभकारी प्रभाव की विशेषता के लिए, आगे की जांच ECM/SVF-जेल के पुनर्योजी प्रभाव के अंतर्निहित आणविक तंत्र की विशेषता के लिए रास्ते पर हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (८१४७१८८१, ८१६०१७०२, ८१६७१९३१), चीन के गुआंगडोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2014A030310155) द्वारा समर्थित किया गया था, और Nanfang अस्पताल के प्रशासक फाउंडेशन (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016Z010) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 Molecular Probes I21411
guinea pig anti-mouse perilipin Progen GP29
DAPI Thermofisher D1306
wide tip pipet Celltreat 229211B
Confocal microscope  Leica  TCS SP2
nude nice  Southern Mdical University /
light microscope  Olympus /
50 mL tube Cornig 430828
sterile bag Laishi /
microtome Leica  CM1900
centrifuge Heraus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

Tags

दवा मुद्दा १४५ वसा व्युत्पंन स्टेम सेल यांत्रिक प्रक्रिया lipoaspirates फैट grafting स्टेम सेल थेरेपी stromal नाड़ी अंश जेल
पुनर्योजी चिकित्सा के लिए लिपोएपएपएट्स का यांत्रिक माइक्रोनाइजेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F.,… More

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F., Cai, J. Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (145), e58765, doi:10.3791/58765 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter