Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن، وجعل، وتنقية عدة بورات التوكسينات الناقلين بالتماثل للأسرة الناقل SLC4 باستخدام الخميرة. كما يصف لنا مقايسة cross-linking كيميائية لتقييم البروتينات هوموميريك المنقي للجمعية مولتيميريك. هذه البروتوكولات يمكن تكييفها للبروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Abstract
الأسرة المذاب الناقل 4 (SLC4) من البروتينات يسمى الناقلين بيكربونات ويشمل البروتين التوراتية شاردة مبادل 1 (AE1، يعرف أيضا باسم الفرقة 3)، بروتين غشائي الأكثر وفرة في خلايا الدم الحمراء. الأسرة SLC4 مثلى مع الناقلين بورات، التي اتسمت في النباتات والفطريات. ما زال تحديا تقنيا كبيرا للتعبير عن وتنقية البروتينات الغشاء النقل إلى التجانس بكميات مناسبة لدراسات هيكلية أو وظيفية. هنا نحن تصف الإجراءات المفصلة ل overexpression الناقلين بورات في Saccharomyces cerevisiae، والعزلة الأغشية الخميرة، سولوبيليزيشن من البروتين من المنظفات، وتنقية بورات الناقل هومولوجس من س. سيريفيسيا، أعطيت التمويل، و أرز. ونحن أيضا بالتفصيل glutaraldehyde التجربة الاعتداء مولتيميريزيشن الناقلين هوموميريك العابرة للربط. إجراءاتنا المعمم يمكن تطبيقها على جميع البروتينات الثلاثة، وقد تم تحسين كفاءة. ويمكن استخدام العديد من الاستراتيجيات الموضوعة هنا لدراسة البروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Introduction
وتظل صعوبة الحصول على كميات كافية من البروتين غشاء المنقي زجاجة في السعي لتحقيق دراسات الهيكلية والوظيفية للمستقبلات وقنوات أيون والناقلين. توجد العديد من البروتوكولات لخطوط الأنابيب الإنتاجية متوسطا للشاشة والعثور على بروتينات الغشاء المرشحة التي تعبر عن جيدا بما يكفي لتمكين اللاحقة في المختبر الدراسات1،2،3،4 . عادة، يتم المفتاحية البروتينات بروتين N أو ج-طرفية أخضر نيون (التجارة والنقل)، ويتم رصد مستويات التعبير بالأسفار بهلام أو بالأسفار-الكشف عن حجم الاستبعاد اللوني (فسك)5. تمكين هذه النهج فرز المرشحين بروتين الغشاء في البروتينات وإذ تعرب عن عالية، معتدلة أو منخفضة معربا عن البروتينات، أو البروتينات التي تعبر عن شكل سيء أو قد لا تعمل على الإطلاق. يعمل هذا الأسلوب أيضا عند التصميم التجريبي التحقيق في عدد كبير من الجينات المرشحة قصد تحديد أيهما البروتين تعرب عن الأفضل. ومع ذلك، في بعض الحالات، يستند نهج تجريبي دراسة بروتين غشاء خاص، التي يمكن أن تكون صعبة عندما تكون مستويات البروتين هذا التعبير في نطاق معتدلة أو منخفضة. بالإضافة إلى ذلك، في بعض الأحيان وفي هذه الحالات، مستويات التعبير يمكن فقط الحد الأدنى زيادة بتغيير بنية عن طريق ترونكيشنز أو الطفرات ثيرموستابيليزينج كودون الأمثل. ولذلك، في بعض الأحيان ضرورية لتحسين غشاء بروتين البروتوكولات التعبير وتنقية للبروتينات الغشاء تعبر فقط معتدلة جيدا.
وتشمل الأسرة SLC4 من الناقلين الناقل بيكربونات شاردة مبادل 1 (يعرف أيضا باسم الفرقة 3) وبروتين غشائي الأكثر وفرة في خلايا الدم الحمراء6، ومحرك رئيسي للتنفس الخلوي. الأسرة SLC4 مثلى مع الناقلين بورات، وحاسمة في النباتات وقد ثبت أن يحمل بنية مماثلة إلى شاردة مبادل 1 وكذلك إلى جانب الصوديوم SLC4 الناقلين7،،من89 ،10. هنا نحن تقرير البروتوكولات التعبير وتنقية البروتين الأمثل باستخدام S. cerevisiae لتنقية ثلاث ناقلات بورات مختلفة موجودة في الخميرة والنباتات. نسلط الضوء في التفصيل الخطوات الرئيسية أخذنا إلى تحسين الغلة وكفاءة تنقية للتجانس. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تقرير مقايسة cross-linking كيميائية باستخدام جلوتارالديهيدي لرصد الجمعية مولتيميريك لمتعهدي النقل هذه في سياق معقد البروتين-المنظفات-الدهن المنقي. التجربة كروسلينكينج يمكن أن تساعد في تقييم مدى ملاءمة هومولوج والمنظفات بتقييم حالة الناقلين oligomeric مولتيميريك بعد تنقية.
ويفترض هذا البروتوكول أن الناقل المطلوبة قد تم استنساخ في بلازميد 2 μ المستمدة تحت السيطرة إيندوسيبلي من المروج GAL1 للتعبير في S. cerevisiae. الحمض النووي لهذه الإجراءات، كان يستخدم ترميز طول البرية من نوع بورات الناقلين Bor1 Saccharomyces cerevisiae (ScBor1)11، التمويل نبات Bor1 (AtBor1)12، و أرز Bor3 (OsBor3)13 . ج-المحطة في كل بناء يتم إلحاق مع 10-صاحب-علامة وموقع انقسام ثرومبين إدراجها بين الناقل و 10-صاحب-العلامة لتمكين إزالتها إذا رغبت. وسيتولى البروتوكول أيضا أن بلازميد قد تحولت فعلا إلى دسي-5 التعبير سلالة من S. cerevisiae في وسائل الإعلام الانتقائي تكميلية كاملة (CSM) التي تفتقر إلى الحامض الأميني.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام وأهمية المخازن المؤقتة
- إعداد 500 مل اللبن 40% بإضافة 200 جرام من اللبن والماء المتأين الشطب إلى إجمالي حجم 500 مل. استخدام صفيحة أو الموجات الدقيقة لزيادة معدل اللبن الدخول في الحل. تصفية العقيمة مع جهاز تنقية فراغ تتألف من أعلى فلتر 0.2 ميكرون يعلق على زجاجة زجاجية معقمة.
ملاحظة: تعد جميع وسائل الإعلام عن حلول باستخدام الماء المتأين الشطب. - إعداد 500 مل السكر 40% بإضافة 200 جرام من السكر والمياه لإجمالي حجم 500 مل. اﻷوتوكﻻف لتعقيم.
- في كل من قوارير ل 2 الأربع، إضافة 0.4 غرام خليط تكملة كاملة دون الحامض الأميني (المجلس الأعلى للقضاء-صاحب)، ز 3.35 الخميرة النيتروجين قاعدة مع كبريتات الأمونيوم (YNB + النيتروجين)، و 475 مل من الماء. اﻷوتوكﻻف. إضافة 25 مل السكر 40% لتحقيق تركيز جلوكوز نهائي بنسبة 2%.
- إضافة إلى زجاجة زجاجية، 50 جرام ببتون والخميرة ز 25 استخراج والمياه إلى 375 مل. اﻷوتوكﻻف. إضافة 125 مل اللبن 40% إعطاء 5 × الحل ببتون (يب) الخميرة التي تحتوي على اللبن 10%.
- إضافة إلى قارورة 250 مل، 0.04 غ صاحب المجلس الأعلى للقضاء، 0.335 ز YNB + النيتروجين والماء إلى 47.5 مل. اﻷوتوكﻻف. إضافة 2.5 مل السكر 40% للحصول على 50 مل من المجلس الأعلى للقضاء صاحب YNB + + الجلوكوز 2%.
- تحضير 1 لتر من 1 م تريس pH 7.0 بخلط ز 121.14 من قاعدة تريس مع 800 مل من الماء. إضافة حمض الهيدروكلوريك تركيز حتى تصل إلى درجة الحموضة 7.0. إضافة المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 1 لتر ويمر عبر فلتر 0.2 ميكرون.
- إعداد 500 مل من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) pH 8.0 بخلط ز 73.06 يدتا مع 400 مل من الماء. إضافة حبيبات هيدروكسيد الصوديوم حتى قد حلت يدتا وتصل درجة الحموضة إلى 8.0. إضافة المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 500 مل ويمر عبر فلتر 0.2 ميكرون.
- تحضير 100 مل فلوريد فينيلميثانيسولفونيل 100 مم (بمسف) بخلط ز 1.74 من بمسف مع 200 دليل على الإيثانول. مخزن في-20 درجة مئوية.
- إعداد 225 مل 2 × حبة يغسل المخزن المؤقت يتكون من 50 مم تريس pH 7.0، كلوريد الصوديوم 1.4 متر، والغليسيرول 20% و 1 مم يدتا pH 8.0.
- إعداد 100 مل حجم الاستبعاد اللوني المخزن المؤقت (S200 المخزن المؤقت) تتكون من 20 مم 4-مورفولينوثانيسولفونيك هيدرات حمض (MES) الرقم الهيدروجيني 6.5، 100 ملم كلوريد الصوديوم ووالغليسيرول 2% و 0.03% n-دوديسيل-بيتا-د-مالتوبيرانوسيدي (DDM).
- تحضير 100 مل من المخزن المؤقت لاستثارة الغشاء يتكون من 50 مم تريس pH 7.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، ووالغليسيرول 10%.
- إعداد 10 مل 3 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل صبغ بخلط 3 مل 20% دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) والغليسيرول 3 مل، 2.4 مل م 1 تريس الأس الهيدروجيني 6.8، ز 0.03 بروموفينول الأزرق و 1.6 مل 2-mercaptoethanol.
2-أوفيريكسبريشن "نقل بورات" في سيريفيسيا س.
- تطعيم ثلاث مستعمرات الخميرة المحولة في 50 مل من المجلس الأعلى للقضاء صاحب + YNB + وسائط الجلوكوز 2% ويهز بين عشية وضحاها في 190 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية.
- اليوم التالي استخدم جهاز المطياف الضوئي لتحديد كثافة الضوئية على طول موجي 600 نانومتر (OD600) وتطعيم التطوير التنظيمي600 من 0.01 كل من أربع قوارير ل 2 أن تحتوي كل منها على 500 مل من المجلس الأعلى للقضاء صاحب YNB + + 2% جلوكوز وسائط الإعلام.
- هزة في 190 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية عن 30 ساعة للسماح للخلايا تستهلك الجلوكوز جميع وينمو بكثافة عالية.
ملاحظة: فترة نمو أطول النتائج في الخلية أكبر غلة، أكبر غشاء حصاد الغلة، والغلة في نهاية المطاف أكبر من البروتين المنقي. - الحث على التعبير عن طريق إضافة 125 مل 5 وسائط x YP تكملة مع اللبن 10% لتركيز التعريفي نهائي من اللبن 2%. هزة في 190 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية ح 16.
- خلايا الحصاد بالغزل في 4,000 س ز 15 دقيقة ريسوسبيند الخلايا في 100 مل من الماء البارد.
ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا قد تكون مجمدة في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى، أو قد يستمر الإعدادية في تحلل الخلية والغشاء الحصاد. ونحن عادة الحصاد ز 40-45 من الخلايا.
3-حصاد الأغشية الخميرة
- إضافة إلى استثارة الخلية 11.25 مل من م 1 تريس pH 7.0، مل 0.45 يدتا 0.5 متر، ومل 2.25 100 مم بمسف، هذا الأخير اثنين منها بمثابة مثبطات البروتياز. إضافة المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 225 مل، الذي ينتج في مخزن استثارة خلية من 50 مم تريس pH 7.0، 1 مم يدتا، و 1 مم بمسف.
ملاحظة: إذا كان استخدام تجميد الخلايا تسمح الخلايا لذوبان الجليد تماما، حوالي 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، لأنه إذا كانت لا تزال مجمدة جزئيا، أنهم سيقاومون تحلل بالضرب حبة. - إضافة تعليق خلية في اسطوانة معدنية 450 مل لحبه الضرب. أعلى مقابل حجم المتبقية مع حبات الزجاج البارد 0.5 مم.
- تجميع دائرة حبة-الضرب بالدوار وتزج في حمام الثلج. إجراء ست نبضات 1 دقيقة، مفصولة بفترات الراحة 2 دقيقة لمنع الانهاك.
- تجميع جهاز ترشيح فراغ باستخدام بلاستيك مشدود تصفية أعلى زجاجة المتاح في زجاجة زجاج. إزالة غشاء الترشيح، نظراً لأن الجهاز البلاستيك المتبقية يمكن التقاط الخرز بينما يسمح لتمرير. فصل الخرز من بصب محتويات الدائرة حبة الضرب على الجمعية العامة أثناء تطبيق الفراغ.
- أغسل قاعة الضرب حبة مع 225 مل 2 × أغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس pH 7.0، 1 مم يدتا، 1 مم بمسف وكلوريد الصوديوم م 1.4 والغليسيرول 20%. إفراغ محتويات الدائرة على الخرز غسلها.
ملاحظة: الغسيل يعطي وحدة تخزين نهائي ~ 450 مل تفكيك الخلايا وإلى حد كبير غلة غشاء المقطوع الزيادات. التركيزات النهائية هي 50 مم تريس pH 7.0، 1 مم يدتا، 1 مم بمسف، والغليسيرول 10% و 700 ملم كلوريد الصوديوم، والغرض الأساسي لرفع تركيز الملح للمساعدة على فصل البروتينات الغشاء المحيطي. - تدور أسفل الخلية لمدة 15 دقيقة في س 15,000 ز. صب المادة طافية في زجاجات البولي وتدور على ح 1 في 135,000 س ز في أولتراسينتريفوجي لجمع الأغشية.
ملاحظة: إذا لم يتوفر أولتراسينتريفوجي، قد جمعت الأغشية بالغزل ح 3 في 53,000 س ز، قوة التي يمكن تحقيقه في الكلمة نموذج أجهزة الطرد المركزي. - تجاهل المادة طافية، ووزن الزجاجات مع غشاء الكريات. ريسوسبيند غشاء الكريات في حوالي 35 مل غشاء استثارة المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس والغليسيرول pH 7.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، و 10 في المائة، وإضافة إلى دونسير زجاج. وزن أنابيب الطرد المركزي فارغة لتحديد كتلة الأغشية حصادها.
ملاحظة: في محصولاً غشاء فعالة، سوف يكون وزن الأغشية يساوي حوالي 20% من وزن الخلايا المستخدمة لذلك الحصاد الغشاء. هذا البروتوكول يعطي غلة الخلية النموذجية من 40-45 ز، وهكذا نتوقع المثل ئد أغشية ز 8-9. - دونس تجانسه بالأغشية، وقاسمه إلى 50 مل أنابيب مخروطية الشكل قد تكون مخزنة الآن إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه التجربة، عادة مختبرين اثنين مصنوعة، للسماح لتنقية البروتين منفصلة اثنين التي يتعين القيام بها من أحد إعداد الخلية الأصلي.
4-سولوبيليزاتيون وتنقية البروتين
- لكوب إضافة شريط ضجة و 150 مغ من n-دوديسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي (DDM) كل غشاء ز قيد الاستخدام. الحفاظ على البروتين على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في جميع الأوقات.
ملاحظة: DDM بلوري ويجب تخزينها في وعاء زجاجي مع ديسيككانت في-20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. أيضا، أنها نموذجية لاستخدام بين 4-5 جرام أغشية في تنقية للحصول على مبلغ ملموس من البروتين النقي. - ذوبان الجليد الأغشية وتجلب إلى حجم 15 مل في الغشاء ز في المخزن المؤقت لاستثارة الغشاء تستكمل مع بمسف 1 مم وعيار 20 ملم ايميدازول pH 8.0 نهائي. إضافة الأغشية للكأس مع DDM وآثاره ح 1 في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: سيتم تركيز DDM 1% w/v، ولكن سولوبيليزيشن البروتينات الغشاء أكثر أهمية أن يكون على بينه من الكتلة للمنظفات المضافة كل غشاء ز. - تدور لمدة 25 دقيقة في 135,000 س ز عند 4 درجة مئوية بيليه المواد غير سولوبيليزيد. تصفية المادة طافية من خلال عامل تصفية حقنه 5 ميكرومتر.
- تحميل العينة بمضخة تمعجية تعيين إلى معدل تدفق من 1 مل/دقيقة على عمود النسب نيكل المعطل تداولها 1 مل اكويليبراتيد في 20 مم تريس pH 7.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم والغليسيرول 10%، 20 مم ايميدازول pH 8.0 و 0.05% DDM.
ملاحظة: للبروتينات أقل، وإذ تعرب عن نقاء محسنة وغلة لوحظت باستخدام 1 مل بدلاً من العمود 5 مل، والنيكل بدلاً من أيونات الكوبالت للتقارب اللوني. - أغسل العمود مع 10 العمود حجم المخزن المؤقت الغسيل التي تحتوي على 20 مم تريس pH 7.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم ووالغليسيرول 10% 80 مم ايميدازول pH 8.0 0.05% DDM.
ملاحظة: تركيز ايميدازول التي يمكن استخدامها أثناء يغسل لبروتين معلم 10-صاحب أعلى مما يقدر عموما، ويؤدي إلى تحسين نقاء. - الوت البروتين في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 مم تريس pH 7.0، 200 ملم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 10%، 300 مم ايميدازول pH 8.0 و 0.05% DDM. جمع النذرة في عشر 1 مل الكسور وتشغيلها على جل تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 4-20% جنبا إلى جنب مع solubilized ليستي وغسل الكسور.
- تجمع ذروة الكسور، عادة نحو 5-6 مل، وتركيز 500 ميليلتر أو أقل حجم في مركز استقطاع كاتشين 50 في للطرد مركزي benchtop المبردة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: 500 ميليلتر وحدة تخزين الحد أقصى نموذجية حقن حجم الاستبعاد اللوني (SEC) أعمدة. عند هذه النقطة يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية البروتين أو يستمر على ثانية - تصفية البروتين من خلال عامل تصفية عمود دوران 0.2 ميكرون وحقن على حجم استبعاد عمود (مثلاً، سوبيرديكس-200) اكويليبراتيد في المخزن المؤقت S200: 20 مم مس pH 6.5، 100 ملم كلوريد الصوديوم ووالغليسيرول 2% 0.03% DDM.
ملاحظة: جلوتارالديهيدي اللاحقة العابرة للربط المقايسة، وكيل التخزين المؤقت يجب أن لا يحتوي على أمين الأولية. ثانية فرصة لتبادل المخازن المؤقتة إذا لزم الأمر، كما فعل هنا عند تبادل تريس لوضع اقتصاد السوق. - تشغيل جل الكسور الذروة في تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة 4-20%. وصمة عار للهلام وجمع الكسور ذروة نقية، والتركيز بمركز كاتشين-قطع 50 في 4 درجات مئوية.
- تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في طول موجه من 280 نانومتر، ومخزن إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
5-glutaraldehyde العابرة للربط بالانزيم
- إعداد رد فعل 10 ميليلتر بخلط 3 ميليلتر من البروتين 0.5 ملغ/مل في المخزن المؤقت S200، 5 ميليلتر S200 المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من الماء أو 20% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، تليها 1 ميليلتر من glutaraldehyde 1.5%.
ملاحظة: هذا سوف تعطي رد فعل س 1 من 0.15 مغ/مل glutaraldehyde البروتين و 0.15 في المائة. العينات التي تحتوي على معالجة المسبقة لمخزونات النشر الاستراتيجي هي عناصر سلبية هامة وينبغي مختلطة والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل إضافة جلوتارالديهيدي. - تبني رد فعل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إنهاء رد فعل عن طريق إضافة 5µL 3 س جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل صبغ، التي تحتوي على فائض في تريس المخزن المؤقت الذي يروي في جلوتارالديهيدي.
- تحميل جميع ميليلتر 15 على جل تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة 4-20%، التي سيتم تحميل البروتين 1.5 ميكروغرام لكل حارة. تشغيل الهلام 200 الخامس عن 30 دقيقة وصمة عار وتحديد مدى ديمر العابرة للربط بدليل على الفرقة التي يعمل على ضعف حجم مونومر التشويه والتحريف.
ملاحظة: دورة الوقت ومعايرة glutaraldehyde قد إجراء أولاً لإيجاد أفضل الظروف لنقل هوموميريك.
Representative Results
المواد الهلامية نموذجية للكسور التيد من أداء النيكل التقارب اللوني تظهر جميع البروتينات الثلاثة تنقيته جزئيا (الشكل 1أ). الحق في السلم هو ليساتي، أي في كل حالة لا تظهر عصابة كبيرة المقابلة للناقل بورات ونموذجي للبروتينات التي لا أوفيريكسبريس جيدا. لين أغسل 80 مم يظهر فقدان الحد الأدنى من البروتين معلم 10-له على الرغم من أن تركيز ايميدازول مرتفعة نسبيا. العصابات المقابلة للناقلين بورات بادية للعيان في التيد الكسور، والكسور يعتبر تحتوي على الجزء الأكبر البروتين التيد تتركز قبل الحقن إلى العمود S200 هلام الترشيح. في هذه المرحلة، تنقية البروتينات غير كاف للعديد من التطبيقات المصب، كما يتبين من نطاقات إضافية في العينة مركزة قبل الحقن إلى العمود S200 (الشكل 1ب). ومع ذلك، الحقن العينة على العمود حجم الاستبعاد يكشف الكسور التيد درجة نقاء عالية (الشكل 1ب-ج). وتعرض تشروماتوجرامس وهذه المواد الهلامية المقابلة لكل من الناقلين بورات. على الرغم من نقاء معتدلة من العينات عند شطف من التقارب اللوني، البروتين نقية جداً عند التينج من عمود هلام الترشيح. خطيرة، تكشف تشروماتوجرامس كل البروتين لترحيل أساسا كذروة مونوديسبيرسي واحدة مع القليل من البروتين الإبقاء على حجم الفراغ. ويعطي بروتين مستقر ومطوية عموما مونوديسبيرسي وذروة متناظرة، بينما البروتين غير مستقرة أو تجمعات أو مجمعة سيعطي عموما أما قمم متعددة غير متماثلة أو ذروة كبيرة في حجم الفراغ. ومن المعتاد للحصول على عائد نهائي من حوالي 2 مغ تنقية البروتين لكل لتر من الخميرة الثقافة ScBor1، وحوالي 1 ملغ كل المنقي AtBor1 و OsBor3 للثقافة L. هذه الأرقام هي كمية البروتين تنقيته من قاسمة واحد من 4-5 غ أغشية، الذي ينشأ من أحد نصف اعدادنا الخلية الأصلي.
التجربة cross-linking يظهر أن الناقلين المنقي هوموميريك يمكن أن يكون بها الجمعية في حل يسهل تقييم (الشكل 2). والغرض من هذه العينات التي تحتوي على معالجة المسبقة للحزب الديمقراطي الصربي لإظهار أن العابرة للربط تعتمد على دولة مطوية في الحل وأن العابرة للربط ولذلك لا تحدث عند تعطل مولتيميريزيشن بمطهر قاسية. أظهرت النتائج تميز أحد الناقلين بورات الثلاثة، ScBor1، هو لا ديميريزيد عند تنقيته في DDM في هذه الظروف، في حين تشابك الاثنان الآخران، AtBor1، و OsBor3، وإظهار ثنائي. فمن الممكن أن نرى أن ليس كل البروتين قد تشابك. في هذا المثال، كميات ضئيلة من مركب OsBor3 مرئية، بينما AtBor1 كروسلينكس للإنجاز. مدى العابرة للربط سيعتمد على عدد بقايا يسين على مقربة من بعضها البعض، ومن الممكن أن الكواشف cross-linking الأخرى قد تشابك كفاءة البروتينات الغشاء مختلفة.
الشكل 1 . النيكل تقارب وحجم الاستبعاد اللوني لتنقية لثلاثة بورات الناقلين. كل لوحة الرأسي (أ)، (ب)، و (ج) يحتوي على بيانات ل ScBor1 و AtBor1 و OsBor3. (أ) النيكل تقارب العمود. م سلم علامات الوزن الجزيئي مع الأوزان في كاتشين المحدد إلى اليسار. L هو النفط الخام ليستي، وهو ث الغسيل ايميدازول 80 مم. جميع الممرات مرقمة أخرى تتوافق مع الكسور 1 مل التيد مع ايميدازول 300 ملم. تبين أشرطة أعلاه الكسور التي اختيرت لتكون مجتمعة ومركزة لحقن على العمود. ف (ب) يشير إلى تركيز البروتين قبل الحقن إلى العمود S200. التيد ثانية الكسور الحق، مع الأقواس المستخدمة لمطابقة الممرات هلام مع كسور تشروماتوجرام بهم في (ج). حجم الفراغ فقط بعد 8 مل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . العابرة للربط المقايسة ويقيم نواقل المنقي للجمعية مولتيميريك- تتم الإشارة إلى سلم مع الأوزان الجزيئية على اليسار. وقبل كل شيء يظهر الممرات الأخرى البروتين التي هي موجودة وما إذا كان العينة glutaraldehyde المضافة أو معالجة المسبقة لمخزونات النشر الاستراتيجي قبل إضافة glutaraldehyde. تشير الأسهم إلى مواقف مونومر وديمر AtBor1 و OsBor3. هو بروتين أصغر من AtBor1 و OsBor3 ScBor1 ويعمل كما هو متوقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هنا تقاسمنا بروتوكولات مفصلة تؤدي إلى التنقية لتجانس ثلاثة متميزة بورات التوكسينات الناقلين. البروتوكولات المقدمة هنا مستقاة من البروتوكولات الأخرى للتعبير عن البروتينات الغشاء لا يتجزأ في1، S. cerevisiae14، ولدينا نتيجة لتحسين الأداء في نقاء المحسنة وتحسين المحاصيل. المعلمات الأمثل هنا تشمل حجم نمو ثقافة الخلية ومرات، وضرب حبة تحلل الإجراءات، تكوين المخزن المؤقت أثناء تحلل الخلية وتحديد تنقية البروتين، كمية من المنظفات المستخدمة لكل غرام غشاء، أيون معدني في انجذاب تطهير، حجم العمود تقارب، وتنفيذ مقايسة cross-linking لتقييم مدى ملاءمة هومولوج والمنظفات بتقييم حالة الناقلين oligomeric مولتيميريك. البروتوكولات ناجحة بالنسبة هومولوجس SLC4 متعددة من النباتات والفطريات. حد من جميع الاستراتيجيات لتنقية البروتينات الغشاء لا يتجزأ هو أنه لا يوجد أي أسلوب تنقية البروتين غشاء عالمية مضمونة للعمل. فمن الممكن أن لدينا بروتوكولات أكثر احتمالاً لتكون ناجحة للبروتينات أقرب في تسلسل الهوية وهيكل للناقلين SLC4، ومن ثم أعضاء أسر SLC4 و SLC23 و SLC26 يمكن أن تكون واعدة تستهدف15. وبالمثل، أكثر تقحم بعيدة من الناقلين بورات الناقل غشاء قد يكون، على الأرجح البروتوكول يجب أن تكون مختلفة، كما هو الحال باختلاف نظام التعبير أو المنظفات الأخرى البارامترات الرئيسية4.
البروتوكول يستفيد من علامة تقارب الأكثر استخداماً في تنقية البروتين، له العلامة. على الرغم من وجود شوائب في كسور التيد الأولية، ينتج التركيبات من تقارب النيكل والغسيل واسعة النطاق، واللاحقة ثانية تنقية البروتين المنقاة العالية. 10-صاحب-علامة يسمح ليغسل ايميدازول أكثر صرامة، وهكذا يمكن إزالة خلفية ملزم البروتينات أكثر مما يمكن إزالتها في يغسل يسمح بها 8-صاحب-أو 6-صاحب-العلامات. لدينا تحديدات للكسور نقية يخطئ الجانب المحافظ من معظم الكسور جل نقية جداً، التي تتوافق مع كسور ثانية الذروة. يمكن زيادة غلة البروتين النهائي من خلال تجميع وتركيز المزيد من الكسور، أن كان ذلك بمفاضلة بروتين النقي أقل قليلاً. الأساليب المقدمة هنا تمكين تنقية AtBor1 في الكميات التي أدت إلى تحديد هيكل الكريستال7، مع اختلافات تنقية تتكون من قطع علامة له وتبادل الناقل في مختلف المنظفات لتحسين كريستال حيود7.
ويثير لدينا بروتوكول اعتبارات هامة للاختيار هومولوجس والمنظفات المستخدمة لجعل وتنقية لها. DDM خيار أول مشترك للمنظفات لأنه معتدل نسبيا، وغالباً ما تنجح في سولوبيليزينج، وقد استخدمت في دراسات هيكلية ووظيفية لمجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء. في تحديد ما إذا كان منظفات تشكيلة فقيرة لغشاء، أسلوب مشترك لتقييم ما إذا كان البروتين يعطي ذروة مونوديسبيرسي واحد في تشروماتوجرام ثانية، بدلاً من ذروة كبيرة في حجم الفراغ أو مجموعة من قمم بوليديسبيرسي، الذي وتشير إلى البروتين تجمعات أو غير مستقرة. نظر بشكل أكثر مكرا يثير لدينا تنقية ScBor1. ينقي بكميات كبيرة وتبدو مواتية ومونوديسبيرسي في تشروماتوجرام ثانية، مما يوحي بأنه يمكن أن يكون هدفا جذاباً للدراسات الهيكلية. ومع ذلك، يكشف لدينا الإنزيم cross-linking فإن مونومر عند تنقية. وفي حين أنه من الممكن أن ScBor1 يمكن أن توجد أصلاً مونومر في الخلية، تشير الدراسات إلى أن الناقلين SLC4 وما هومولوجس من المحتمل أن dimers7،،من89،10. تنميتنا للمقايسة cross-linking حدث بعد بلورة وحل بنية AtBor1. ومع ذلك، تسنى لنا لتقييم ScBor1 بالمقارنة مع AtBor1 مع الإنزيم كروسلينكينج، جهودا قيمة الوقت والبحث قد تم إعادة توجيه إلى السعي إلى AtBor1 بدلاً من ScBor1، هذه الأخيرة في نهاية المطاف لم يكن ناجحاً في التجارب تبلور والحيود. يمكن أن يساعد هذا الإنزيم وبالتالي الباحثين التمييز بين هومولوجس أو المنظفات لاستخدامها عند متابعة الدراسات الهيكلية من أجل إعطاء الأولوية للأوضاع التي يحافظ البروتين تكيف أصلية المشتبه فيهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها في التحليل للتحقيق من الأحماض الأمينية التي هي حاسمة بالنسبة مولتيميريزيشن، بغية إيجاد بدائل من الأحماض الأمينية التي تزعزع استقرار واجهة مولتيميريزيشن وتؤدي إلى إلزام مونومرات. وقد استخدم هذا نهج للتحقيق الفنية أهمية الجمعية هوموميريك في غشاء الناقلين16،،من1718.
ميزة عامة لأسلوبنا أن الخميرة قد ثبت تمكينا للتعبير عن العديد من البروتينات الغشاء تحديا لوظيفة متنوعة1. بالإضافة إلى ذلك، عصرها منخفضة التكلفة والنمو تعزيز إمكانية الوصول إليها للعديد من الجهود البحثية التي قد تكون أقل قدرة على استخدام استراتيجيات التعبير التي تتطلب زراعة الأنسجة أو وسائط النمو باهظة الثمن. الإجراءات المعروضة هنا هي غير مكلفة نسبيا ويمكن أن يؤديها في أسبوع واحد مما يؤكد جدوى النهج. يمكن أن يساعد تنفيذ هذه البروتوكولات تمكين الدراسات الهيكلية والوظيفية للبروتينات الغشاء الصعبة الأخرى.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث أموال بدء التشغيل في كلية ديفيدسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
