Summary
여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.
Abstract
단백질의 용액 캐리어 4 (SLC4) 가족 중 탄산염 운송업 불리고 archetypal 단백질 음이온 교환기 1 (AE1로 알려진 또한 밴드 3), 붉은 혈액 세포에 가장 풍부한 막 단백질을 포함. SLC4 가족은 식물과 곰 팡이 특징 borate 전송기와 동종 이다. 그것은 표현 하 고 정화 막 수송 단백질 구조 또는 기능에 대 한 적당 한 수량에 동질성을 중요 한 기술적인 도전 남아 있습니다. 여기 우리는 세제, 그리고 붕 산 염 운송업 자 homologs 미에서에서의 정화에 의해 Saccharomyces cerevisiae, 효 모 세포 막의 분리, 단백질의 가용 화 borate 전송기의 overexpression에 대 한 자세한 절차 설명 cerevisiae, 애기 thaliana, 그리고 Oryza sativa로 구나. 우리는 또한 cross-linking multimerization homomeric 전송기의 시험 하는 실험도 선발. 우리의 일반적인된 절차 모든 3 개의 단백질에 적용할 수 있는 고 효능에 대 한 최적화 되었습니다. 여기 개발 전략의 많은 다른 도전 막 단백질의 연구에 활용할 수 있습니다.
Introduction
순화 된 막 단백질의 충분 한 수량을 얻기에 있는 어려움 수용 체, 이온 채널, 전송기의 구조 및 기능 연구의 추구에 중요 한 병목 현상에 남아 있다. 온건 하 게 높은 처리량 파이프라인 후속 생체 외에서 연구1,2,3,4 수 있도록 충분히 표현 하는 화면과 찾기 후보 막 단백질에 존재 하는 많은 프로토콜 . 일반적으로, 단백질은 N-또는 C-터미널 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 그리고 젤에 형광 또는 형광 탐지 크기 배제 크로마토그래피 (FSEC)5식 레벨 모니터링 됩니다. 이러한 접근 높은 표현 단백질, 중간 또는 낮은 단백질, 표현 또는 잘못 또는 전혀 표현 하는 단백질으로 막 단백질 후보자의 심사 가능 이 방법은 실험 설계는 최고를 표현 하는 어떤 단백질을 선택 하는 의도로 후보 유전자의 다 수를 조사 하는 경우에 잘 작동 합니다. 그러나, 어떤 경우에는 실험적인 접근 때 그 단백질의 식이 수준은 온건 하거나 낮은 범위에 도전적 일 수 있다 특정 막 단백질 공부에 입각 한입니다. 또한, 때로는 이러한 경우 식 수준은 늘릴 수 있습니다만 최소한 잘림, thermostabilizing 돌연변이, 또는 코 돈 최적화를 통해 구조를 변경 하 여. 그것은, 그러므로, 때로는 적당히 잘만 표현 하는 막 단백질에 대 한 막 단백질 표정과 정화 프로토콜을 최적화 하는 데 필요한.
전송기의 SLC4 가족 중 탄산염 운송업 자 음이온 교환기 1 (밴드 3 라고도 함), 적혈구6, 가장 풍부한 막 단백질 및 세포 호흡의 핵심 드라이버 포함 되어 있습니다. SLC4 가족은 식물에 중요 한 고 나트륨 결합 SLC4 전송기7,,89 뿐만 아니라 음이온 교환기 1 유사한 구조를 전시에 표시 되었습니다 borate 전송기와 동종 10. 여기 우리는 S. cerevisiae 정화 효 모와 식물에 있는 3 개의 다른 borate 전송기를 사용 하 여 최적화 된 단백질 표정과 정화 프로토콜을 보고 합니다. 우리는 우리가 수율 및 동질성에 담긴의 효율성을 최적화 했다 세부 주요 단계에 강조. 또한, 우리 글을 사용 하 여 순화 된 단백질-세제-지질 복합체의 맥락에서이 전송기의 multimeric 어셈블리를 모니터링 하는 화학 가교 분석 결과 보고 합니다. 가교 실험 정화 후 oligomeric 전송기의 multimeric 상태를 평가 하 여 체와 세제 적합성을 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 원하는 전송 S. cerevisiae에 표현 위한 GAL1 발기인의 유도할 수 있는 통제 2 µ 파생 된 플라스 미드로 복제 되었습니다 가정 합니다. 이 절차에 대 한 DNA 전체 길이 야생-타입 borate 전송기 Saccharomyces cerevisiae Bor1 인코딩 사용 되었다 (ScBor1)11, 애기 thaliana Bor1 (AtBor1)12및 Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . 각 구문에서 C terminus 10-그의-태그 추가 하 고 전송 10-그의-태그 경우 제거 수 있도록 사이 삽입 하는 트 롬 빈 분열 사이트 원하는. 프로토콜 또한 플라스 미드는 이미 DSY-5 식 변형 S. cerevisiae 의 완전 한 보충 선택적 미디어 (CSM)에 히스티딘 부족으로 변형 되어 가정 합니다.
Protocol
1입니다. 미디어와 중요 한 버퍼의 준비
- 갈 락 토스와 드 이온된 수 200 g 500 mL의 총 볼륨을 추가 하 여 40% 갈 락 토스의 500 mL를 준비 합니다. 핫 플레이트 또는 전자 레인지를 사용 하 여 솔루션으로 지 고 갈 락 토스의 속도를 증가. 메 마른 유리 병에 부착 된 0.2 µ m 필터 상단 구성 된 진공 여과 장치를 살 균 필터.
참고: 모든 미디어 솔루션 드 이온된 수를 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. - 500 mL의 총 볼륨에 포도와 물 200 g을 추가 하 여 40% 포도 당 500 mL를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독.
- 각 4 개의 2 L 플라스 크에 히스티딘 (CSM 그), 3.35 g 효 모 질소 (YNB + 질소), 황산 암모늄과 475 mL 물 기초 없이 완전 한 보충의 0.4 g을 추가 합니다. 오토 클레이 브. 2%의 최종 포도 당 농도 달성 하기 위해 40% 포도 당 25 mL를 추가 합니다.
- 유리 병, 50 g 펩 및 25 g 효 모 추출 물에 추가 하 고 375 mL에 물. 오토 클레이 브. 10% 갈 락 토스를 포함 하는 효 모 펩 (YP) 솔루션 x 5에 게 40% 갈 락 토스의 125 mL를 추가 합니다.
- 250 mL 플라스 크에 0.04 g 추가 CSM 그의 0.335 g YNB + 질소, 그리고 47.5 mL에 물. 오토 클레이 브. 추가 40% 포도 당 50ml CSM 그의의의 2.5 mL YNB + 2% 포도 당.
- 물 800 mL와 함께 기본 트리 스의 121.14 g을 혼합 하 여 1 M Tris pH 7.0의 1 리터를 준비 합니다. PH 7.0에 도달할 때까지 집중된 한 염 산을 추가 합니다. 물 1 L의 최종 볼륨을 추가 하 고 0.2 µ m 필터를 통해 전달.
- EDTA의 73.06 g 400 mL 물으로 혼합 하 여 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) pH 8.0의 500 mL를 준비 합니다. EDTA는 녹이 고 pH 8.0에 도달 될 때까지 수산화 나트륨 펠 릿을 추가 합니다. 물 500 mL의 최종 볼륨을 추가 하 고 0.2 µ m 필터를 통해 전달.
- PMSF의 1.74 g 200 증거 에탄올과 혼합 하 여 100 mM phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF)의 100 mL를 준비 합니다. -20 ° c.에 게
- 비드 워시 버퍼 구성 된 50 mM Tris pH 7.0, 1.4 M NaCl, 20% 글리세롤, 1 mM EDTA pH 8.0 x 2의 225 mL를 준비 합니다.
- 크기 배제 크로마토그래피 버퍼 (버퍼 S200) 20 m m 4-Morpholinoethanesulfonic 산 수화물 (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, 2% 글리세롤과 0.03 %n-라우릴-베타-D-Maltopyranoside (DDM) 구성 된 100 mL를 준비 합니다.
- 100ml 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 그리고 10% 글리세롤으로 구성 된 막 물의 resuspension 버퍼를 준비 합니다.
- 3 mL 20% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 3 mL 글리세롤, 2.4 mL 1 M Tris pH 6.8, 0.03 g bromophenol 파랑 및 1.6 mL 2-mercaptoethanol을 혼합 하 여 SDS 페이지 로딩 염색 x 3의 10 mL를 준비 합니다.
2. overexpression S. cerevisiae 에 붕 산 염 운송업 자의
- 3 변형된 효 모 식민지의 CSM 그의 50 mL에 접종 + YNB + 2% 포도 당 미디어와 동요 30 ° c.에 190 rpm에서 하룻밤
- 다음 날 600의 파장에서 광학 밀도 결정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm (OD600) 및 0.01 각 각의 CSM 그의 500 mL를 포함 하는 4 개의 2 L 플라스 크의600 세 접종 YNB + 2% 포도 당 미디어.
- 셀 모든 포도 당을 소비 하 고 높은 밀도로 성장할 수 있도록 30 h 30 ° C에서 190 rpm에 흔들.
참고: 성장 장시간 큰 셀에 결과 수율, 큰 수확된 막 수율, 고 궁극적으로 더 큰 정제 단백질 생성 합니다. - 5 x YP 미디어 2% 갈 락 토스의 최종 유도 농도 10% 갈 락 토스와 보충의 125 mL을 추가 하 여 식 유도. 16 h 30 ° C에서 190 rpm에 흔들.
- 4000 x g 15 분에 회전에 의해 수확 셀 Resuspend 100 mL 차가운 물에 셀.
참고:이 시점에서 셀 수 있습니다 동결-80 ° C에서 무기한, 또는 준비 세포 세포의 용 해와 막 수확으로 계속 수 있습니다. 우리는 일반적으로 40-45 g 셀의 수확.
3. 효 모 세포 막의 수확
- 셀 물의 resuspension 11.25 mL 1 M Tris pH 7.0, 0.5 M EDTA, 0.45 mL의 그리고 100 밀리미터 PMSF, 후자의 2.25 mL 두 protease 억제제 역할에 추가 합니다. 물 50 m m Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 및 1 밀리미터 PMSF의 셀 물의 resuspension 버퍼에 결과 225 mL의 최종 볼륨을 추가 합니다.
참고: 경우 세포를 냉동을 사용 하 여 철저 하 게, 약 1 시간 실 온에서 해 동 세포 때문에 수 그들은 부분적으로 냉동 유지, 그들은 구슬 구타에 의해 세포를 저항할 것 이다. - 비드 구타에 대 한 450 mL 금속 용기에 셀 물의 resuspension를 추가 합니다. 차가운 0.5 m m 유리 구슬 가진 나머지 볼륨에서 최고.
- 회전자와 구슬 박동 챔버를 조립 하 고 얼음 욕조에 담가. 6 1 분 펄스를 구분 2 분 나머지는 lysate 과열을 방지 하기 위해 수행 합니다.
- 유리 병에 플라스틱 일회용 병 최고 필터 망을 사용 하 여 진공 여과 장치를 조립. 남은 플라스틱 장치 통과 lysate 하면서 구슬을 캡처할 수 있기 때문에 여과 멤브레인을 제거 합니다. 비드 박동 챔버에 진공을 적용 하는 동안 어셈블리의 내용을 붓는 여는 lysate에서 구슬을 구분 합니다.
- 워시 워시 버퍼 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 밀리미터 PMSF, 1.4 M NaCl, 및 20% 글리세롤이 포함 된 x 2의 225 mL와 구슬 박동 챔버. 그들을 씻어을 구슬에 챔버의 내용이 비어 있습니다.
참고: 세척 ~ 450 mL lysed 세포의 최종 볼륨을 제공 하 고 크게 증가 수확된 막 생성 합니다. 최종 농도 50 m m Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, 1 밀리미터 PMSF, 10% 글리세롤과 700 mM NaCl, 그리고 소금 농도 높이기의 주된 목적은 주변 막 단백질을 분리 하는 데 도움이 것입니다. - 15000 x g에서 15 분 동안 lysate 셀 아래로 회전 합니다. 폴 리 탄산염 병 및 막 수집 하는 ultracentrifuge에서 135000 x g 에서 1 시간에 대 한 스핀으로는 상쾌한을 붓는 다.
참고:는 ultracentrifuge 사용할 수 없는 경우 막 53000 x g, 바닥 모델 원심 분리기에서 달성 하는 힘에서 3 h 동안 회전에 의해 수집 수 있습니다. - 삭제는 상쾌한 고 막 펠 릿을 가진 병의 무게. 약 35 mL 막 물의 resuspension 버퍼에 포함 된 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 그리고 10% 글리세롤 막 펠 릿 resuspend 고 유리 douncer에 추가 합니다. 막 수확의 질량을 결정 하기 위해 빈 원심 분리기 튜브 무게.
참고: 효율적인 막 수확, 막의 무게가 됩니다 그 막 수확에 대 한 사용 하는 셀의 무게 약 20%. 이 프로토콜 40-45 g의 전형적인 세포 수확량을 제공 하 고 그러므로 우리가 마찬가지로 8-9 g 세포 막의 수익률을 기대. - Dounce 균질 막, 및 약 수 지금-80 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있습니다 50 mL 원뿔 튜브로
참고:이 실험을 위해 일반적으로 두 개의 aliquots 만들어집니다, 두 개의 별도 단백질 담긴 한 원래 셀 준비에서 수행할 수 있도록.
4. 가용 화 및 단백질의 정화
- 비 커를 저 어 바와 n-라우릴-β-D-Maltopyranoside (DDM) 사용 되 고 g 막 당 150mg을 추가 합니다. 모든 시간에 얼음에 4 ° C에서 단백질을 유지.
참고: DDM 검 습기 이며 방 습 제로 사용에-20 ° C에서 유리 항아리에 저장 한다. 또한, 순수 단백질의 큰 금액을 얻기 위해 정화에 막 4-5 g 사이 사용 일반적입니다. - 막 해 동 하 고 g 막 막 물의 resuspension 버퍼 1 밀리미터 PMSF와 20 m m 이미 pH 8.0 보충에 당 15 mL의 최종 볼륨을. DDM으로 비 커를 막 추가 및 4 ° c.에서 1 h 동안 저 어
참고: DDM 농도 1 %w / v, 있을 것입니다 하지만 막 단백질의 가용 화에 대 한 세제 g 막 당 추가의 질량의 알고 있어야 더 중요 하다. - 135000 x g 비 solubilized 재료 펠 렛을 4 ° C에서 25 분에 대 한 스핀. 5 µ m 주사기 필터를 통해 필터링 하는 상쾌한.
- 연동 펌프에 의해 샘플 1 mL 고정된 니켈 선호도 열에 1 mL/min의 유량을 설정 하는 중에 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20mm 이미 pH 8.0 및 0.05% equilibrated DDM.
참고: 낮은 표현 단백질에 대 한 향상 된 순도 수율 관찰 되었다 친화성 크로마토그래피에 대 한 5 mL, 및 코발트 이온 대신 니켈 대신 1 mL를 사용 하 여. - 10 열 량 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 80mm 이미 pH 8.0 및 0.05%를 포함 하는 워시 버퍼의 열을 씻어 DDM.
참고: 10 그의 태그 단백질에 대 한 세척 하는 동안 사용할 수 있는 이미 농도 보다 일반적으로 평가 하 고 향상 된 순도 높은 수준 이다. - 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 300 밀리미터 이미 pH 8.0 및 0.05%를 포함 하는 버퍼에 단백질을 elute DDM. 10 1 mL 분수에 eluate 수집 하 고 solubilized lysate 및 세척 분수와 함께 4-20% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤에서 실행.
- 보통 5-6 mL, 및 집중 500 µ L 이하로 4 ° c.에 냉장 벤치탑 원심 분리기에서 50 kDa 컷오프 집중 장치에서 볼륨에 대 한 풀 피크 분수
참고: 500 µ L은 전형적인 최대 볼륨 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 열에 주입. 이 시점에서 단백질-80 ° C에 무기한으로 저장 될 수 있습니다 또는 초에 계속 - 단백질 0.2 µ m 스핀 열 필터를 통해 필터링 및 크기 제외 열 (예를 들어, Superdex-200) S200 버퍼에 equilibrated에 주사: 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl, 2% 글리세롤과 0.03 %DDM.
참고: 분석 결과 cross-linking 후속 글에 대 한 버퍼링 에이전트 포함할 수 없습니다 주 아민. 초는 Mes에 대 한 트리를 교환할 때 여기 다 필요한 경우 버퍼를 교환 하는 기회입니다. - 트리 스-글리신 SDS-페이지 4-20%에서 최대 분수 젤을 실행 합니다. 젤 얼룩, 순수 피크 분수, 수집 및 4 ° c.에 50 kDa 컷오프 집중에 집중
- -80 ° c.에 무기한 저장 280 nm의 파장에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정
5입니다. 글 Cross-linking 분석 결과
- 10 µ L 반응 S200 버퍼, S200 버퍼, 뒤에 1.5%의 1 µ L의 물 또는 20% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 1 µ L의 5 µ L에서에서 0.5 mg/mL 단백질의 3 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다.
참고:이 0.15 mg/mL 단백질 및 0.15% 글의 1 x 반응을 줄 것 이다. 샘플 SDS의 전처리를 포함 하는 중요 한 부정적인 컨트롤 혼합 한다 고도 추가 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 incubated. - 실 온에서 30 분 동안 반응을 품 어. SDS 페이지 젤 포함 냉각에 Tris 버퍼의 과잉 염료 로드 x 3의 5µL를 추가 하 여 반응을 종료.
- 4-20% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤, 레인 당 1.5 µ g 단백질 로드에 모든 15 µ L을 로드 합니다. 200 V 30 분 얼룩 젤을 실행 하 고 이합체 변성된 단위체의 크기를 두 번 실행 하는 밴드의 증거에 의해 교차 하는 연결의 범위를 결정 합니다.
참고:도 적정 시간 코스를 수행할 수 있습니다 먼저 homomeric 전송에 대 한 최상의 조건을 찾는 데.
Representative Results
전형적인 젤 니켈 친화성 크로마토그래피를 수행에서 eluted 분수에 대 한 모든 3 개의 단백질 부분적으로 순화 (그림 1A) 표시 합니다. 사다리의 오른쪽은 lysate, 각각의 경우에는 해당 잘 overexpress 하지 않는 단백질에 대 한 일반적 borate 전송 하는 중요 한 밴드를 표시 하지 않습니다. 80mm 워시 레인 이미 상대적으로 높은 농도도 불구 하 고 10-그의-태그 단백질의 최소한의 손실을 보여줍니다. 붕 산 염 운송업 자에 해당 하는 밴드는 eluted 분수에 예가 고 S200 젤 여과 칼럼에 주입 하기 전에 집중 하 고 분수 eluted 단백질의 대부분을 포함 하는 것으로 간주. 이 단계에서 단백질은 충분히 정화 하지 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 집중된 샘플에 추가 밴드 S200 열 (그림 1B)에 주입 하기 전에 표시 된 대로. 그러나, 고 순도 (그림 1B-C) eluted 분수를 보여준다 크기 제외 열에 샘플을 주입. Chromatograms 및 borate 전송기의 각각에 대 한 그들의 해당 젤 선물 된다. 친화성 크로마토그래피에서 차입 시 샘플의 적당 한 순수성에도 불구 하 고 단백질은 젤 여과 열의 방출에 매우 순수한. 비판적으로, chromatograms는 무효 볼륨에 유지 하는 작은 단백질으로 주로 단일 단 분산 피크로 마이그레이션할 각 단백질 공개. 불안정, misfolded, 또는 집계 된 단백질 줄 것 이다 일반적으로 여러 개의 비대칭 봉우리 또는 큰 피크 무효 볼륨에서 동안 안정적이 고 접힌 단백질 일반적으로 대칭 피크를 단 분산을 제공 합니다. 그것은 ScBor1, 및 대략 1 밀리 그램 각 순화 된 AtBor1와 OsBor3의 L 문화 당 효 모 문화 L 당 약 2 mg 정제 단백질의 최종 수익률을 얻는 전형적인. 이 번호는 하나에서 유래 막의 4-5 g의 한 약 수에서 순화 하는 단백질의 양을 원래 셀 준비의 절반.
가교 실험 순화 homomeric 전송기 솔루션 쉽게 평가 (그림 2)에 해당 어셈블리를 가질 수 보여줍니다. SDS의 전처리를 포함 하는 샘플의 목적은 cross-linking는 솔루션에서 접힌된 상태에 의존 하 고는 cross-linking 따라서 발생 하지 않습니다 multimerization 가혹한 세제에 의해 중단 될 때 보여주는 것입니다. 표시 된 결과 다른 2, AtBor1 및 OsBor3, 상호 링크 이합체 화를 표시 하는 동안 이러한 조건에 DDM에서 정화 하는 때 3 개의 borate 전송기, ScBor1, 중 하지 dimerized 구별 합니다. 그것은 모든 단백질 상호 링크 수 있습니다 볼 수 있습니다. 이 예제에서 OsBor3 모노 머의 미 량 AtBor1 완료 크로스 링크 하는 동안, 볼 수 있습니다. Cross-linking의 정도, 서로 게 근접에서 리 진 잔류물의 수에 따라 달라 집니다 그리고 다른 가교 시 약 수 있습니다 효율적으로 다른 막 단백질 상호 링크 가능 합니다.
그림 1 . 니켈 3 borate 전송기에 대 한 선호도 및 크기 배제 크로마토그래피 정화. 각 수직 패널 (A), (B), 그리고 (C) ScBor1, AtBor1, 및 OsBor3에 대 한 데이터를 포함. (A) 니켈 선호도 열. M은 분자량 마커 왼쪽에 지정 된 kDa에 무게의 사다리. L lysate, 원유 이며 W는 80 m m 이미 세척. 다른 모든 번호가 매겨진된 차선 1 mL 분수와 300 밀리미터 이미 eluted에 해당 합니다. 분수 위에 막대 표시를 결합 하는 열에 주사에 대 한 집중 선정 됐다. (B) P S200 열에 주입 하기 전에 집중된 단백질을 나타냅니다. Eluted 초 분수 젤 레인 (C) 그들의 크로마 분수와 일치 하는 데 사용 하는 괄호와 함께 오른쪽에 있습니다. 무효 볼륨 8 mL 직후 이다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 순화 전송기 multimeric 어셈블리에 대 한 평가 분석 결과 cross-linking. 분자 무게를 가진 사다리는 왼쪽에 표시 됩니다. 특히 다른 차선 표시 됩니다 어떤 단백질은 존재 여부는 샘플도 추가 또는 글 추가 하기 전에 SDS의 사전 처리 했다. 화살표는 AtBor1 및 OsBor3에 대 한 단량체와 이합체의 위치를 나타냅니다. ScBor1은 AtBor1 OsBor3 보다 작은 단백질 이며 예상 대로 실행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기 우리는 3 가지 진 핵 borate 전송기의 동질성을 정화 상세한 프로토콜을 공유 했습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 향상 된 순도 수율 향상된에 S. cerevisiae1,14, 완전 한 막 단백질 그리고 우리의 최적화 결과의 표현에 대 한 다른 프로토콜에서 파생 됩니다. 여기에 최적화 된 매개 변수는 셀 문화 성장 볼륨 및 시간, 구슬-박동 세포 절차, 동안 세포 세포의 용 해 버퍼 구성 및 단백질 정화, 그램 막, 금속 이온 당 사용 된 세제의 친 화력 정화에 식별 볼륨 선호도 열 및 oligomeric 전송기의 multimeric 상태를 평가 하 여 체와 세제 적합성을 평가 하는 상호 분석 결과의 구현. 프로토콜은 식물과 곰 팡이 종에서 여러 SLC4 homologs에 대 한 성공적 이다. 완전 한 막 단백질의 정화에 대 한 모든 전략의 한계는 보편적인 막 단백질 정화 방법 작동 하도록 보장 하는 존재 이다. 우리의 프로토콜은 더 많은 가능성이 시퀀스 id 및 SLC4 전송기, 그리고 이렇게 SLC4, SLC23, 및 SLC26 가족의 일원을 구조에 가까운 단백질 약속 수에 대 한 성공 하려면 대상15가능 하다. 마찬가지로, 더 봤을 borate 전송기에서 먼 막 전송 될 수도 있습니다, 그리고 더 많은 가능성이 프로토콜 해야한다와 같은 다른 표현 시스템, 세제, 또는 다른 주요 매개 변수4변화 하 여.
프로토콜은 단백질 정화, 그 태그에에서 가장 일반적으로 사용 되 선호도 태그를 활용합니다. 초기 eluted 분수에 불순물의 존재에도 불구 하 고 니켈 선호도, 광범위 한 세척 및 후속 초 정화의 조합을 매우 순화 된 단백질에서 발생 합니다. 10-그의-태그 허용 더 엄격한 이미 씻어 따라서 세척에 의해 8-그의-또는 6-그의-태그 허용에서 제거 될 수 있다 보다 더 많은 배경 바인딩 단백질을 제거할 수 있습니다. 순수한 분수에 대 한 우리의 선택 피크 초 분수에 해당 하는 가장 높은 순수한 젤 분수의 보수적인 측면에 잘못. 풀링 및 더 많은 분수, 집중 약간 덜 순수 단백질의 트레이드 오프와 최종 단백질 수율을 증가 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 사용 그의 태그를 잘라와 다른 것으로 교환 하는 전송 구성 된 정화 차이와 그것의 크리스탈 구조7의 결정에 지도 하는 수량에 AtBor1의 정화 크리스탈 회절7개선 한 세제
우리의 프로토콜 homologs와 solubilize 그들을 정화 하는 데 사용 하는 세제의 선택에 대 한 중요 한 고려 사항이 발생 합니다. DDM 때문에 상대적으로 온화 하 고, 종종 solubilizing, 성공 그리고 다양 한 막 단백질의 구조와 기능 연구에 사용 된 세제에 대 한 일반적인 첫 번째 선택 이다. 세제는 멤브레인에 대 한 불 쌍 한 선택 인지 결정할 때, 평가의 일반적인 방법은 이다 단백질 초 크로마에 단일 단 분산 피크 보다 무효 볼륨 또는 polydisperse 봉우리의 범위에 큰 피크를 제공 하는 여부는 단백질을 misfolded 또는 불안정을 나타냅니다. 더 미묘한 고려는 ScBor1의 우리의 정화에 의해 발생 합니다. 그것은 대량 및 유리한 모습과 구조 연구에 대 한 매력적인 대상 수 제안 하는 SEC 크로마에 단 분산에 정화. 그러나, 우리의 상호 분석 결과 정화 때 모노 머 다는 것을 보여준다. ScBor1 셀에 모노 머로 서 기본적으로 존재할 수 수 있지만 연구 나타냅니다 SLC4 전송기와 그들의 homologs 이합체7,8,,910될 것. 가교 시험의 우리의 개발 crystallizing 및 AtBor1의 구조를 해결 후 발생 했습니다. 그러나, 우리 수 있었다 상호 분석 결과, ScBor1 AtBor1에 비해 평가 귀중 한 시간과 연구 노력 후자는 궁극적으로 실패 했다에서 ScBor1 대신 AtBor1의 추구에 리디렉션 되었을 수 결정 화 및 회절 실험입니다. 따라서이 분석 결과 연구원 homologs 또는 구조 공부 때 단백질의 의심된 기본 형태를 유지 하는 조건 우선 순위를 지정 하기 위해 사용 하는 세제를 구분할 수 있습니다. 또한, 분석 결과 아미노산이 multimerization, multimerization 인터페이스와 단위체를 의무적으로 이어질 불안정 아미노를 함유한 산 성 대체를 찾기 위해 검색을 사용할 수 있습니다. 이러한 접근은 막 전송기16,,1718homomeric 어셈블리의 기능적 중요성을 사용 되었습니다.
우리의 방법의 일반적인 이점은 이다 효 모 다양 한 함수1의 많은 도전 막 단백질의 표현을 사용할 수 있도록 표시 되었습니다. 또한, 그것의 낮은 비용 및 성장 시간 조직 문화 또는 비싼 성장 매체를 필요로 하는 표현 전략을 사용 하 여 적은 수 많은 연구 노력에 대 한 접근을 촉진 합니다. 여기에 제시 된 절차는 상대적으로 저렴 하 고 접근 방법의 타당성을 강조는 1 주일에서 수행할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 구현 다른 도전 막 단백질의 구조 및 기능 연구를 가능 하 게 도울 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 데이비슨 대학에서 시작 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
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