Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att uttrycka, solubilize och rena flera eukaryota Borat transportörer med homologi till familjen SLC4 transporter med hjälp av jäst. Vi beskriver också en kemisk tvärbindande analys för att bedöma de rena homomeric proteinerna för multimeric montering. Dessa protokoll kan anpassas för andra utmanande membranproteiner.
Abstract
Familjen Solute Carrier 4 (SLC4) av proteiner kallas bikarbonat transportörerna och innehåller proteinet arketypiska Anion Exchanger 1 (AE1, även känd som Band 3), det vanligast förekommande membran proteinet i de röda blodkropparna. Familjen SLC4 är homologa med Borat transportörer, som har karaktäriserats i växter och svampar. Det är fortfarande en betydande teknisk utmaning att uttrycka och rena transporter membranproteiner till homogenitet i mängder som är lämpliga för strukturella eller funktionella studier. Här beskriver vi detaljerade förfaranden för överuttryck av Borat transportörer i Saccharomyces cerevisiae, isolering av jäst membran, lösbarhet av protein av tvättmedel och rening av Borat transportör homologs från S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaoch Oryza sativa. Vi detalj också en glutaraldehyd cross-linking experimentet för att assay multimerization av homomeric transportörer. Våra generaliserad förfaranden kan tillämpas på alla tre proteiner och har optimerats för effekt. Många av de strategier som utvecklats här kan utnyttjas för att studera andra utmanande membranproteiner.
Introduction
Svårigheten att få tillräckliga mängder renat membranprotein förblir en kritisk flaskhals i jakten på strukturella och funktionella studier av receptorer och jonkanaler transportörer. Många protokoll finns för måttligt hög genomströmning pipelines till skärmen och hitta kandidat membranproteiner som uttrycker tillräckligt väl för att möjliggöra efterföljande in vitro- studier1,2,3,4 . Vanligtvis proteiner är märkta med en N - eller C-terminal grönt fluorescerande protein (GFP) och uttrycksnivåerna övervakas genom i-gel fluorescens eller fluorescens-detection storlek utslagning kromatografi (FSEC)5. Sådana tillvägagångssätt aktivera triaging membran protein kandidater till hög uttrycker proteiner, måttlig eller låg uttrycker proteiner, eller proteiner som express dåligt eller inte alls. Denna metod fungerar bra när experimentell design är att undersöka ett stort antal kandidatgener med avsikt att välja vilket protein uttrycker bäst. Dock i vissa fall bygger en experimentell metod på att studera en viss aluminiummembran protein, vilket kan vara svårt när det protein uttryck är i intervallet måttlig eller låg. Dessutom, kan ibland i dessa fall uttrycksnivåerna endast minimalt ökas genom att förändra bygga via truncations, thermostabilizing mutationer eller kodon optimering. Det är därför ibland nödvändigt att optimera membran protein uttryck och rening protokoll för membranproteiner som uttrycker endast måttligt väl.
Familjen SLC4 av transportörer innehåller bikarbonat transportören Anion Exchanger 1 (även känd som Band 3), det vanligast förekommande membran proteinet i röda blodkroppar6och en viktig drivkraft för cellandningen. Familjen SLC4 är homologa med Borat transportörer, som är kritiska i växter och har visat sig uppvisar en liknande struktur Anion Exchanger 1 samt till natrium-kopplade SLC4 transportörer7,8,9 ,10. Här rapporterar vi optimerade protein uttryck och rening protokoll använder S. cerevisiae att rena tre olika Borat transportörer i jäst och växter. Belyser vi i detalj viktiga steg vi tog för att optimera avkastningen och effektiviteten i reningar till homogenitet. Dessutom kan rapportera vi en kemisk tvärbindande analysen använder glutaraldehyd för att övervaka multimeric montering av dessa transportörer i samband med ett renat protein-tvättmedel-lipid-komplex. Tvärbindande experimentet kan hjälpa till att utvärdera homolog och rengöringsmedel lämplighet genom att bedöma multimeric delstaten Oligomera transportörer efter rening.
Protokollet förutsätter att önskad transportören har blivit klonade in ett 2 µ härrör plasmiden under inducerbara kontroll av GAL1 arrangören för uttryck i S. cerevisiae. För dessa förfaranden, DNA användes kodning fullängds vildtyp Borat transportörer Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12och Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminus i varje konstruktion läggs med en 10-hans-tagg och en trombin klyvning webbplats införas mellan transportören och 10-hans-taggen för att aktivera dess avlägsnande om önskas. Protokollet kommer också att anta att plasmiden redan har förvandlats till DSY-5 uttrycket stam av S. cerevisiae på komplett kompletterande selektiva medier (CSM) saknar histidin.
Protocol
1. förberedelse av media och viktiga buffertar
- Förbereda 500 mL av 40% galaktos genom att lägga till 200 g av galaktos och avjoniserat vatten till en total volym på 500 mL. Använd en värmeplatta eller mikrovågsugn för att öka graden av galaktos att komma till lösning. Sterila filter med en dammsugarfilter apparat bestående av en 0,2 µm filter bifogas en steril glasflaska.
Obs: Alla medialösningar är beredda med hjälp av avjoniserat vatten. - Förbereda 500 mL av 40% glukos genom att lägga till 200 g glukos och vatten till en total volym på 500 mL. Autoklav att sterilisera.
- I varje av de fyra 2 L kolvarna, tillsätt 0,4 g komplett tillägg blandning utan histidin (CSM-hans), 3.35 g jäst kväve bas med ammoniumsulfat (YNB + kväve) och 475 mL vatten. Autoklav. Tillsätt 25 mL 40% glukos för att uppnå en slutlig glukos koncentration på 2%.
- Lägga till, i en glasflaska, 50 g pepton och 25 g jästextrakt och vattnet till 375 mL. Autoklav. Tillsätt 125 mL av 40% galaktos att ge 5 x jäst pepton (YP) lösning innehållande 10% galaktos.
- Lägga till, till en 250 mL kolv, 0,04 g CSM-hans, 0.335 g YNB + kväve och vatten till 47,5 mL. Autoklav. Tillsätt 2,5 mL av 40% glukos att få 50 mL CSM-hans YNB + 2% glukos.
- Laga 1 L av 1M Tris pH 7.0 genom att blanda 121.14 g av Tris base med 800 mL vatten. Tillsätt koncentrerad saltsyra till pH når 7.0. Tillsätt vatten till en slutlig volym av 1 L och passerar genom ett 0,2 µm filter.
- Förbereda 500 mL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) pH 8,0 genom att blanda 73.06 g EDTA med 400 mL vatten. Lägg till natriumhydroxid pellets tills EDTA är upplöst och pH-värdet når 8.0. Tillsätt vatten till en slutlig volym av 500 mL och passerar genom ett 0,2 µm filter.
- Bereda 100 mL 100 mM phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) genom att blanda 1,74 g PMSF med 200 bevis etanol. Förvaras vid-20 ° C.
- Bereda 225 mL 2 x pärla tvättbuffert bestående av 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, 20% glycerol och 1 mM EDTA pH 8,0.
- Bereda 100 mL storlek utslagning kromatografi bufferten (S200 buffert) bestående av 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol och 0,03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM).
- Bereda 100 mL membran resuspension buffert som består av 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, och 10% glycerol.
- Förbered 10 mL av en 3 x SDS-PAGE lastning dye genom att blanda 3 mL 20% sodium dodecyl sulfate (SDS), 3 mL glycerol, 2,4 mL 1M Tris pH 6,8, 0,03 g bromophenol blå och 1,6 mL 2-merkaptoetanol.
2. överuttryck av Borat transportör i S. cerevisiae
- Inokulera tre transformerad jäst kolonier i 50 mL CSM-hans + YNB + 2% glukos media och skaka övernattning på 190 rpm vid 30 ° C.
- Följande dag använda en spektrofotometer för att avgöra den optiska densiteten vid en våglängd på 600 nm (OD600) och Inokulera till en OD600 0,01 varje fyra 2 L mätkolvar att varje innehåller 500 mL CSM-hans YNB + 2% glukos media.
- Skaka på 190 rpm vid 30 ° C i 30 h att låta cellerna att konsumera alla glukos och växa till hög densitet.
Obs: Längre tillväxt resulterar i större cell ger, större skördade membran avkastning, och i slutändan större renat protein avkastning. - Inducera uttryck genom att lägga till 125 mL av 5 x YP media kompletteras med 10% galaktos för en sista induktion koncentration av 2% galaktos. Skaka på 190 rpm vid 30 ° C i 16 h.
- Skörden celler av snurrande vid 4000 x g i 15 min. resuspendera cellerna i 100 mL kallt vatten.
Obs: vid denna punkt celler kan frysas vid-80 ° C på obestämd tid, eller prep kan fortsätta in i cell lysis och membran skörd. Vi skördar normalt 40-45 g av celler.
3. upptagning av jäst membran
- Lägga till cell resuspension 11,25 mL 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL 0,5 M EDTA och 2,25 mL 100 mm PMSF, den senare varav två fungera som proteashämmare. Tillsätt vatten till en slutlig volym av 225 mL, vilket resulterar i en cell resuspension buffert 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, och 1 mm PMSF.
Obs: Om använder frysta celler tillåter celler Tina ordentligt, ca 1 h i rumstemperatur, eftersom om de fortfarande delvis frysta, de kommer att motstå Lys av pärla stryk. - Tillsätt cell resuspension i en 450 mL metall behållare för bead slog. Toppa den återstående volymen med kall 0,5 mm glaspärlor.
- Montera en pärla-slog kammare med rotorn och fördjupa i ett isbad. Utföra sex 1 min pulser, åtskilda av 2 min viloperioder att förhindra överhettning av lysat.
- Montera en dammsugarfilter apparater med hjälp av en plast som disponibla flaska övre filter skruvas in i en glasflaska. Ta bort filtrering membran, eftersom återstående plast enheten kan fånga pärlor samtidigt lysate att passera. Separera pärlorna från det lysate genom att hälla innehållet i pärla stryk kammaren på församlingen samtidigt som vakuum.
- Tvätta pärla stryk kammaren med 225 mL av en 2 x Tvättbuffert som innehåller 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl och 20% glycerol. Töm innehållet i kammaren på pärlor för att tvätta dem.
Obs: Tvätta ger en slutlig volym av ~ 450 mL lyserat celler och avsevärt ökar skördade membran avkastning. De slutliga koncentrationerna är 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glycerol och 700 mM NaCl och det primära syftet med upplyftande saltkoncentrationen är att hjälpa dissociera perifera membranproteiner. - Snurra cellen lysate under 15 minuter vid 15 000 x gnedåt. Häll supernatanten i polykarbonat flaskor och spin för 1 h vid 135 000 x g i en ultracentrifugen att samla membran.
Obs: Om det inte finns en ultracentrifugen, membran samlas av spinning för 3 h på 53 000 x g, en kraft som är uppnåeligt i golv modell centrifuger. - Avlägsna supernatanten och väga flaskorna med membran pellets. Återsuspendera membran pellets i ungefärligt 35 mL membran resuspension buffert innehållande 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, och 10% glycerol och lägga till ett glas douncer. Väg de tomma centrifugrör för bestämning av membran som skördas.
Obs: I en effektiv membran skörd, vikten på membran kommer att motsvara cirka 20% vikt celler används för denna membran skörd. Detta protokoll ger typiska cell avkastningarna av 40-45 g, och därmed vi jämväl förvänta sig en avkastning på 8-9 g membran. - Dounce homogenisera den membran och alikvot till 50 mL koniska rör som nu lagras på obestämd tid vid-80 ° C.
Obs: För detta experiment, vanligtvis två portioner görs, att tillåta två separata protein reningar som ska utföras från en ursprunglig cell beredning.
4. lösbarhet och rening av Protein
- Lägga till en uppståndelse bar och 150 mg n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per g membran som används till en bägare. Hålla protein på isen eller vid 4 ° C hela tiden.
Obs: DDM är hygroskopiskt och bör förvaras i en glasburk med torkmedel vid-20 ° C när inte i använda. Det är också vanligt att använda mellan 4-5 g av membran i en rening för att få en märkbar mängd rent protein. - Tina membran och föra till en slutlig volym av 15 mL per g membran i membran resuspension buffert kompletteras med 1 mM PMSF och 20 mM Imidazol pH 8,0. Lägga till membran i bägaren med DDM och rör för 1 h vid 4 ° C.
Obs: DDM koncentrationen blir 1% w/v, men för lösbarhet av membranproteiner är det viktigare att vara medveten om massa diskmedel per g membran. - Snurra för 25 min på 135 000 x g vid 4 ° C till pellet icke-solubilized material. Filtrera supernatanten genom ett filter med 5 µm i sprutan.
- Belastning i urvalet av den peristaltiska pumpen inställt med en flödeshastighet av 1 mL/min till en 1 mL immobiliserade nickel affinitet kolumn jämviktas i 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM Imidazol pH 8,0 och 0,05% DDM.
Obs: För lägre uttrycker proteiner, förbättrad renhet och avkastning observerades med en 1 mL i stället för 5 mL kolumn och nickel istället för kobolt joner för affinitetskromatografi. - Tvätta kolonnen med 10 kolumn volymer av en tvättlösning innehållande 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 80 mM Imidazol pH 8,0 och 0,05% DDM.
Obs: Den Imidazol-koncentration som kan användas under tvättar för ett 10-hans-taggade protein är högre än är ofta uppskattat och resulterar i förbättrad renhet. - Eluera proteinet i buffert innehållande 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, 10% glycerol, 300 mM Imidazol pH 8,0 och 0,05% DDM. Samla in eluatet i tio 1 mL fraktioner och köra på en 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel tillsammans med solubilized lysate och tvätta fraktioner.
- Pool peak fraktioner, vanligtvis cirka 5-6 mL, och koncentrat till 500 µL eller mindre volym i en 50 kDa cutoff koncentrator i en bänkmonterade centrifug kyld vid 4 ° C.
Obs: 500 µL är en typisk maxvolym som injiceras i storlek utslagning kromatografi (SEC) kolumner. På denna punkt proteinet kan lagras på obestämd tid vid-80 ° C eller Fortsätt på SEC. - Filtrera proteinet genom ett 0,2 µm spin kolumnfilter och injicera på en utslagning i kolumnen storlek (t.ex. Superdex-200) jämviktas i S200 buffert: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glycerol och 0,03% DDM.
Obs: För den efterföljande glutaraldehyd cross-linking assay, buffring agenten får inte innehålla en primär Amin. SEC är en möjlighet att utbyta buffertar vid behov, som gjort här när utbyte av Tris Mes. - Kör peak fraktioner på en 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel. Fläcken gelen, samla ren peak fraktioner och koncentrat i en 50 kDa-cutoff koncentrator vid 4 ° C.
- För att bestämma proteinkoncentration genom att mäta absorbansen vid en våglängd på 280 nm och store på obestämd tid vid-80 ° C.
5. glutaraldehyd Cross-linking Assay
- Förbered en 10 µL reaktion genom att blanda 3 µL 0,5 mg/mL protein i S200 buffert, 5 µL S200 buffert, 1 µL antingen vatten eller 20% sodium dodecyl sulfate (SDS), följt av 1 µL 1,5% glutaraldehyd.
Obs: Detta kommer att ge en 1 x reaktion av 0,15 mg/mL protein och 0,15% glutaraldehyd. Prover som innehåller en förbehandling av SDS bör är viktiga negativa kontroller och blandas och inkuberas i rumstemperatur i 5 min innan du lägger till glutaraldehyd. - Inkubera reaktionen i 30 min i rumstemperatur. Avsluta reaktionen genom att lägga till 5 µl 3 x SDS-PAGE gel lastning färgämne, som innehåller ett överskott av Tris buffert som släcker glutaraldehyd.
- Ladda alla 15 µL på 4-20% Tris-glycin SDS-PAGE gel, som kommer att ladda 1,5 µg protein per körfält. Kör gelen vid 200 V för 30 min. fläcken och fastställa omfattningen av dimer cross-linking av bevisning av ett band som körs två gånger storleken på denaturerat monomeren.
Obs: En glutaraldehyd titrering och tidsförloppet kan utföras först för att hitta de bästa förutsättningarna för en homomeric transportör.
Representative Results
Typiska geler för de eluerade fraktionerna från att utföra nickel affinitetskromatografi visar alla tre proteiner delvis renat (figur 1A). Till höger om stegen är den lysate, som i varje fall inte visar ett betydande band som motsvarar Borat transportören vilket är typiskt för proteiner som inte överuttrycka väl. 80 mM tvätta lane visar minimal förlust av 10-hans-taggade protein trots relativt hög Imidazol koncentrationen. Band som motsvarar Borat transportörerna är uppenbart eluerade fraktioner, och fraktioner anses innehålla huvuddelen av proteinet eluerade koncentreras innan du injicerar på kolumnen S200 gel filtrering. I detta skede renas proteinerna otillräckligt för många nedströms tillämpningar, som indikeras av extra band i koncentrerad provet innan du injicerar på kolumnen S200 (figur 1B). Injicera provet på kolumnen storlek utslagning avslöjar emellertid eluerade fraktioner av hög renhet (figur 1B-C). Kromatogram och deras motsvarande geler för varje Borat transportörerna presenteras. Trots måttlig renheten av proverna vid eluering från affinitetskromatografi är proteinet högt rena vid eluering från kolumnen gel filtrering. Kritiskt, avslöja kromatogram varje protein att migrera primärt som en enda monodisperse topp med lite protein kvar i void volymen. En stabil och vikta protein ger generellt en monodisperse och symmetriskt topp, medan instabila, felveckning eller aggregerade protein generellt ger antingen flera asymmetriska toppar eller en stor topp i void volymen. Det är typiskt att få en slutlig avkastning ca 2 mg renat protein per L av jästkultur för ScBor1 och cirka 1 mg varje renat AtBor1 och OsBor3 per L kultur. Dessa siffror är mängden protein som renats från en alikvot av 4-5 g av membran, som härstammar från en hälften av våra ursprungliga cellen förberedelser.
Tvärbindande experimentet visar att renat homomeric transportörer kan ha sin församling i lösning lätt bedömas (figur 2). Syftet med de prover som innehåller en förbehandling av SDS är att visa att cross-linking är beroende av ett hopvikt tillstånd i lösning och att cross-linking därför inte uppstår när multimerization störs av ett hårda rengöringsmedel. Resultaten visas skilja att inte är en av de tre Borat transportörerna, ScBor1, dimerized när renat i DDM i dessa villkor, medan de andra två, AtBor1 och OsBor3, tvärbinda och visar dimerization. Det är möjligt att se att inte allt protein kan länka. I det här exemplet är spårmängder av OsBor3 monomer synliga, medan AtBor1 cross-links till fullbordan. Omfattningen av cross-linking beror på antalet lysin rester i närhet till varandra, och det är möjligt att andra tvärbindande reagenser effektivt kan länka olika membranproteiner.
Figur 1 . Nickel affinitet och storlek utslagning kromatografi rening för tre Borat transportörer. Varje vertikal panel (A), (B), och (C) innehåller data för ScBor1, AtBor1 och OsBor3. (A) Nickel affinitet kolumn. M är en stege av molekylvikt markörer med vikter i kDa som anges till vänster. L är råa lysate och W är 80 mM Imidazol tvätten. Alla andra numrerade körfält motsvarar 1 mL fraktioner elueras med 300 mM Imidazol. Staplarna ovan fraktioner indikerar som valts till kombineras och koncentrerade för injektioner på kolumnen. (B) P anger koncentrerat protein innan du injicerar på kolumnen S200. Eluerade SEC fraktioner är till höger, med fästen som används för att matcha gel körfält med fraktioner kromatogrammet i (C). Void volymen är strax efter 8 mL. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Cross-linking analysen bedömer renat transportörer för multimeric montering. En stege med molekylvikten är indicerat till vänster. Framför allt andra körfält visas vilket protein är närvarande och om provet har haft glutaraldehyd lagt till eller en förbehandling av SDS innan glutaraldehyd tillägg. Pilarna anger monomer och dimer ståndpunkter för AtBor1 och OsBor3. ScBor1 är en mindre protein än AtBor1 och OsBor3 och körs som förväntat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här har vi delat detaljerade protokoll som resulterar i rening till homogenitet av tre distinkta eukaryota Borat transportörer. De protokoll som presenteras här härrör från andra protokoll för uttrycket av integrerad membranproteiner i S. cerevisiae1,14, och vårt optimeringar resultat i både förbättrad renhet och förbättrad avkastning. Parametrarna optimerad här inkluderar cell kultur tillväxt volymer och tider, pärla-slog lysis förfaranden, buffert sammansättning under cell lysis och protein rening, mängd diskmedel per gram membran, metall Jon identifiera i affinitet rening, volymen av kolumnen affinitet och genomförandet av en korslänkande analysen att bedöma homolog och rengöringsmedel lämplighet genom att bedöma multimeric delstaten Oligomera transportörer. Protokollen är framgångsrik för flera SLC4 homologs från de växter och svamp. En begränsning av alla strategier för rening av integrerad membranproteiner är att det finns ingen universal membran protein reningsmetod som är garanterat att det fungerar. Det är möjligt att våra protokoll är mer sannolikt att vara framgångsrik för proteiner närmare i sekvens identitet och struktur till SLC4 transportörer, och därmed familjemedlemmar, SLC4, SLC23 och SLC26 kunde vara lovande mål15. Likaså de mer evolutionärt avlägsna från Borat transportörerna membran transportör kan vara, desto mer sannolikt protokollet måste vara olika, exempelvis genom att variera uttrycket systemet, rengöringsmedel eller andra viktiga parametrar4.
Protokollet tar fördel av taggen vanligaste affinitet i protein rening, hans-etiketten. Trots förekomsten av föroreningar i de inledande eluerade fraktionerna, kombinationer av nickel affinitet, omfattande tvätt och efterföljande SEC rening resulterar i det höggradigt renat proteinet. En 10-hans-tag möjliggör den strängare Imidazol tvättar och därmed kan ta bort mer bakgrund bindande proteiner än kan avlägsnas i tvättar tillåtet av 8-hans - eller 6-hans-Taggar. Våra val för rena fraktioner fela på den konservativa sidan av de mest högt rena gel fraktioner, som motsvarar peak SEC fraktioner. Slutliga protein avkastning kan ökas genom att samla och koncentrera mer bråk, om än med avvägningen av något mindre rent protein. De metoder som presenteras här aktiverad rening av AtBor1 i mängder som ledde till fastställandet av dess kristall struktur7, med rening skillnader som består av att skära av hans-etiketten och utbyte av transportören till en annan rengöringsmedel för att förbättra crystal diffraktion7.
Våra protokoll väcker viktiga överväganden för val av homologs och de rengöringsmedel som används för att solubilize och rena dem. DDM är ett vanligt första val för rengöringsmedel eftersom det är relativt mild, ofta framgångsrika på solubilizing, och har använts i strukturella och funktionella studier av ett brett utbud av membranproteiner. Fastställer om ett diskmedel är ett dåligt val för ett membran, en gemensam metod för utvärdering är huruvida proteinet ger en enda monodisperse topp på en SEC kromatogrammet, snarare än en stor topp i void volymen eller ett intervall av polydisperse toppar, som Ange felveckning eller instabil protein. En mer subtil hänsyn tas upp av vår rening av ScBor1. Det renar i stora mängder och ser gynnsamt och monodisperse på en SEC kromatogrammet, vilket antyder att det kan vara ett attraktivt mål för strukturella studier. Våra tvärbindande analys visar dock att det är en monomer när renat. Det är möjligt att ScBor1 inföding kunde existera som en monomer i cellen, visar studier att SLC4 transportörer och deras homologs är benägna att vara dimerer7,8,9,10. Vår utveckling av bryggbindningen analysens inträffade efter utkristalliseras och lösa strukturen i AtBor1. Dock hade vi kunnat utvärdera ScBor1 jämfört med AtBor1 med tvärbindande analys, värdefull tid och forskning ansträngningar kunde har omdirigerats till jakten på AtBor1 istället för ScBor1, den senare som slutligen inte lyckades i kristallisation och diffraktion experiment. Denna analys kan således hjälpa forskarna att skilja mellan antingen homologs eller rengöringsmedel att använda när bedriver strukturella studier för att prioritera villkor där proteinet underhåller dess misstänkta infödda konformation. Analysen kan dessutom användas sond som aminosyror är kritiska för multimerization, för att hitta aminosyra substitutioner som destabilisera multimerization gränssnitt och bly att obligate monomerer. Ett sådant tillvägagångssätt har använts till probe funktionella betydelsen av homomeric montering i membran transportörer16,17,18.
En allmän fördel med vår metod är att jästen har visat att uttrycket av många utmanande membranproteiner varierande funktion1. Dessutom främja dess låg kostnad och tillväxt gånger dess tillgänglighet för många forskningsinsatser som kan vara mindre kunna använda uttrycket strategier som kräver vävnadsodling eller dyra tillväxt medier. De förfaranden som presenteras här är relativt billiga och kan utföras i en vecka som understryker genomförbarheten av metoden. Genomförandet av dessa protokoll kan hjälpa till att aktivera strukturella och funktionella studier av andra utmanande membranproteiner.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av start medel vid Davidson College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
