Summary
Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.
Abstract
Proteinler çözünen taşıyıcı 4 (SLC4) ailesinin bikarbonat taşıyıcılar denir ve arketipik protein anyon değiştirici 1 (AE1, Band 3 olarak da bilinir), kırmızı kan hücreleri en bol membran protein içerir. SLC4 aile homolog bitki ve mantarlar ile karakterize Bor taşıyıcılar ile. Bu hızlı ve membran taşıma proteinlerinin homojenliği yapısal veya fonksiyonel çalışmaları için uygun miktarlarda için arındırmak için önemli bir teknik meydan okuma kalır. Burada tarif biz ayrıntılı yordamlar için Borat taşıyıcılar Saccharomyces cerevisiae, Maya membran izolasyon, solubilization protein overexpression deterjan ve Bor ışınlama homologs S. dan arıtma cerevisiae, Arabidopsis thalianave Oryza sativa. Biz de bir oxazolidin multimerization homomeric taşıyıcılar, tahlil için deney cross-linking ayrıntı. Genelleştirilmiş prosedürlerimiz tüm üç proteinler için uygulanabilir ve etkinlik için optimize edilmiştir. Burada geliştirilen stratejilerin pek çok zorlu diğer membran proteinlerinin incelenmesi için yararlı olabilir.
Introduction
Yeterli miktarda saflaştırılmış membran protein alma zorluk yapısal ve fonksiyonel çalışmalar reseptörleri, iyon kanalları ve Işınlayıcılar takibinde kritik bir darboğaz kalır. Sonraki vitro çalışmalar1,2,3,4 etkinleştirmek için yeterince hızlı ekran ve bul aday membran proteinlerinin için orta derecede yüksek işlem hacmi boru hatları için birçok protokoller bulunmaktadır . Tipik olarak, protein bir N - veya C-terminal yeşil flüoresan protein (GFP) ile etiketlenir ve ifade düzeyleri jel floresan veya floresan-algılama boyutu dışlama Kromatografi (FSEC)5tarafından izlenir. Bu tür yaklaşımlar içine yüksek ifade proteinler, orta ya da düşük protein, ifade ya da düzgün çalışmayabilir veya hiç de hızlı proteinler membran protein adaylar önceliklendirmek etkinleştirin. Bu yaklaşım de deneysel tasarım en iyi hangisi protein ifade seçme niyeti ile aday genler çok sayıda araştırmak üzere olduğunda çalışır. Ancak, bazı durumlarda, protein'ın ifade düzeyleri orta ya da düşük aralığında olduğunda zor olabilir bir belirli membran protein, eğitim üzerinde deneysel bir yaklaşım esas olan. Ayrıca, bazen bu gibi durumlarda, ifade düzeyleri sadece minimal yapı truncations, thermostabilizing mutasyonlar veya kodon optimizasyon yoluyla değiştirerek arttırılabilir. Olduğunu, bu nedenle, bazen sadece orta derecede iyi ifade membran proteinlerinin membran protein ifade ve arıtma protokolleri en iyi duruma getirmek gerekli.
Işınlayıcılar SLC4 ailesi bikarbonat ışınlama anyon değiştirici 1 (grup 3 olarak da bilinir), kırmızı kan hücreleri6en bol membran proteini ve hücresel solunum bir anahtar sürücü içerir. SLC4 aile homolog bitkilerde kritik olan ve anyon değiştirici 1 yanı sıra sodyum birleştiğinde SLC4 taşıyıcılar7,8,9 benzer bir yapı gösteren göstermiştir Bor taşıma araçları ile ,10. Burada en iyi duruma getirilmiş protein ifade ve arıtma protokolleri S. cerevisiae Maya ve bitkiler bulunan üç farklı Bor taşıyıcılar arındırmak için kullanarak raporu. Ayrıntı önemli adımda verim ve homojenliği için purifications verimliliğini optimize etmek için aldık vurgulayın. Buna ek olarak, biz bu taşıyıcılar saf protein-deterjan-lipid karmaşık bağlamında multimeric Meclisi izlemek için oxazolidin kullanarak bir kimyasal cross-linking tahlil raporu. Cross-linking deneme sonra arıtma oligomeric Işınlayıcılar multimeric durumunu değerlendirirken tarafından homolog ve deterjan uygunluğu değerlendirmek yardımcı olabilir.
Bu iletişim kuralı istenen taşıyıcı içine 2 µ türetilmiş plazmid S. cerevisiaeifadede GAL1 düzenleyicinin indüklenebilir kontrol altında klonlanmış varsayar. Bu yordamları için DNA tam uzunlukta vahşi tipi Bor taşıyıcılar Saccharomyces cerevisiae Bor1 kodlama kullanıldı (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12ve Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminus her seçenekli bir 10-His-etiketi ile eklenir ve taşıyıcı ve 10-onun-onun kaldırma etkinleştirmek için etiketi arasında eklenen bir Trombin bölünme site istenen. Protokol Ayrıca plazmid zaten histidin eksik DSY-5 ifade S. cerevisiae nın üzerindeki yükü tam tamamlayıcı seçmeli medya (CSM) dönüştürülmüştür üstlenecek.
Protocol
1. medya ve önemli arabellekleri hazırlanması
- 500 mL % 40 galaktoz toplam hacmi 500 mL için galaktoz ve de-iyonize su 200 gr ekleyerek hazırlayın. Isıtma levhası veya mikrodalga çözüm alma galaktoz oranı artırmak için kullanın. Steril cam şişe bağlı 0.2 µm filtre üst oluşan bir vakum filtrasyon aparatı ile steril filtre.
Not: Tüm medya çözümleri de-iyonize su kullanılarak hazırlanır. - 500 mL % 40 glikoz toplam hacmi 500 mL için 200 gr glikoz ve su ekleyerek hazırlayın. Sterilize etmek için basınçlı kap.
- Her dört 2 L şişe içine 0.4 g histidin (CSM-O'nun), 3.35 g maya azot amonyum sülfat (YNB + azot) ve 475 mL su ile temel olmadan tam ek karışımı ekleyin. Basınçlı kap. Son glikoz konsantrasyonu % 2 elde etmek için % 40 glikoz 25 mL ekleyin.
- Ekleme, bir cam şişe, 50 gr pepton ve 25 gr Maya özü ve 375 mL su. Basınçlı kap. 5 x % 10 galaktoz içeren Maya pepton (YP) çözüm vermek için % 40 galaktoz 125 mL ekleyin.
- Ekleme, 250 mL şişe için 0,04 g CSM-O'nun, 0,335 g YNB + azot ve su 47,5 ml. Basınçlı kap. CSM-O'nun 50 mL almak için % 40 glikoz 2.5 mL ekleyin YNB + % 2 glikoz.
- 1 L 1 M Tris pH 7,0 121.14 g Tris temel 800 mL su ile karıştırılarak hazır olun. PH 7,0 ulaşıncaya kadar konsantre hidroklorik asit ekleyin. 1 L son bir hacim için su ekleyin ve 0.2 µm filtreden geçmek.
- 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0 500 mL EDTA 73.06 g 400 mL su ile karıştırılarak hazır olun. Sodyum hidroksit pellets EDTA çözünmüş ve pH 8.0 ulaşır kadar ekleyin. 500 mL son bir hacim için su ekleyin ve 0.2 µm filtreden geçmek.
- 100 mM phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) 100 mL PMSF 1,74 g 200 kanıt etanol ile karıştırarak hazırlayın. -20 ° C'de mağaza
- 2 x 50 mM Tris pH 7,0, 1,4 M NaCl, % 20 gliserol ve 1 mM EDTA pH 8.0 oluşan boncuk yıkama arabellek 225 mL hazırlayın.
- 100 mL boyutu dışlama Kromatografi arabelleği (S200 arabellek) 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic asit hidrat (MES) pH 6.5, 100 mM NaCl, % 2 gliserol ve %0.03 n-lauryl-beta-D-Maltopyranoside (demir) oluşan hazırlayın.
- 100 mL oluşan 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl ve % 10 gliserol membran resuspension arabelleği hazırlayın.
- 10 mL 3 SDS-sayfa yükleme boya x 3 mL % 20 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 3 mL gliserol, 2.4 mL 1 M Tris pH 6.8, 0,03 g bromophenol mavi ve 1.6 mL 2-mercaptoethanol karıştırarak hazırlayın.
2. overexpression S. cerevisiae Bor ışınlama
- CSM-O'nun 50 mL üç dönüştürülmüş Maya kolonilerde aşılamak + 30 ° C'de 190 RPM YNB + % 2 glikoz medya ve shake gecede
- Ertesi gün, bir dalga boyu 600 optik yoğunluk belirlemek için bir Spektrofotometre kullanabilir nm (OD600) ve bir OD600 her her CSM-O'nun 500 mL içeren dört 2 L şişeler 0.01 aşılamak YNB + % 2 glikoz medya.
- 190 RPM hücrelere tüm glikoz tüketmek ve yüksek yoğunluklu için büyümeye izin vermek 30 h 30 ° C'de sallamak.
Not: Daha uzun bir büyüme zaman daha büyük hücredeki sonuçlar verir, daha büyük hasat zar getiri, ve sonuçta daha büyük saf protein verir. - İfade 125 mL % 10 galaktoz % 2 galaktoz son indüksiyon konsantrasyon için ile takıma 5 x YP medya ekleyerek teşvik. 16 h 30 ° C'de 190 RPM sallamak.
- Hasat hücreleri tarafından 4.000 x g 15 dakika süreyle de iplik 100 mL soğuk su hücrelerde Resuspend.
Not: Bu noktada hücreleri-80 ° C'de süresiz olarak dondurulmuş olabilirler veya hazırlık hücre lizis ve membran hasat devam edebilir. Biz genellikle 40-45 g hücre hasat.
3. hasat Maya zarı
- İkisi de proteaz inhibitörleri hareket hücre resuspension 1 M Tris pH 7,0, 0,5 M EDTA 0,45 mL 11,25 mL ve 100 mM PMSF, ikinci 2,25 mL ekleyin. Son hacmi bir 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF hücre resuspension arabellekte sonuçları 225 mL su ekleyin.
Not: çünkü onlar kısmen donmuş kalırsa, onlar tarafından boncuk atan lizis direneceğini hücreleri donmuş kullanarak hücreleri iyice, yaklaşık 1 saat oda sıcaklığında erimek için izin. - Hücre resuspension yenerek boncuk için 450 mL metal kutu içine ekleyin. Kalan cilt soğuk 0,5 mm cam boncuk ile kapalı üst.
- Boncuk atan odası ile rotor montaj ve bir buz banyosu içinde bırakın. Lysate aşırı ısınmayı önlemek için 2 dk dinlenme noktalarla ayrılmış altı 1 dk bakliyat gerçekleştirin.
- Bir vakum filtrasyonu cihaz bir cam şişe içine bir plastik tek kullanımlık şişe ilk filtre vidalı kullanarak birleştirin. Çünkü kalan plastik aygıt-ebilmek esir boncuk geçmek için lysate izin verirken filtrasyon zarının kaldırın. Boncuk boncuk atan odası vakum uygularken derlemenin üzerine içeriğini dökerek lysate ayırın.
- Boncuk atan odası 2 x 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl ve % 20 gliserol içeren yıkama arabelleği 225 mL ile yıkayın. Onları yıkamak için boncuk üzerine odası içeriğini temizleyin.
Not: Yıkama ~ 450 mL lysed hücre son hacim verir ve önemli ölçüde artar hasat membran verimleri. Son konsantrasyonu 50 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, % 10 gliserol ve 700 mM NaCl ve tuz konsantrasyonu yükselen birincil amacı periferik membran proteinlerinin ayırmak yardımcı olmaktır. - 15.000 x gde 15 dakika lysate hücre aşağı spin. Süpernatant polikarbonat şişe ve spin 135,000 x g membranlar toplamak için bir ultracentrifuge içinde de 1 h için içine dökün.
Not: bir ultracentrifuge yoksa, membranlar 3 h 53.000 x g, zemin modeli santrifüjler içinde ulaşılabilir bir güç olarak iplik tarafından toplanabilir. - Süpernatant atın ve membran granül ile şişe tartın. Membran granül 50 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl ve % 10 gliserol içeren yaklaşık 35 mL membran resuspension bir arabellek resuspend ve cam douncer ekleyin. Hasat membranlar kitle belirlemek için boş santrifüj tüpleri tartın.
Not: bir verimli membran hasat membranlar ağırlığının yaklaşık % 20 hücreleri ağırlığını bu membran hasat için kullanılan eşit olur. Bu iletişim kuralı tipik hücre sayıları 40-45 g verir ve böylece aynı şekilde 8-9 g membranlar verimini bekliyoruz. - Şimdi süresiz olarak-80 ° C'de depolanmış olabilir 50 mL konik tüpler içine Dounce homojenize membranlar ve aliquot
Not: Bu deneme için genellikle iki aliquots, iki ayrı protein purifications bir orijinal hücrenin hazırlık yapılması izin vermek için yapılır.
4. solubilization ve Protein saflaştırma
- Bir ölçek için bir heyecan bar ve n-lauryl-β-D-Maltopyranoside (demir) kullanılan g membran başına 150 mg ekleyin. Protein buz üzerinde veya 4 ° C'de tutunuz.
Not: DDM higroskopik ve kurutucu kullanılmadığı zaman-20 ° C'de bir cam kavanoza saklanmalıdır. Ayrıca, 4-5 gram saf protein bir kayda değer miktarda elde etmek için bir arıtma membran arasında kullanmak için normaldir. - Membranlar çözülme ve son hacmi 15 mL g membran membran resuspension tampon 1 mM PMSF ve 20 mM imidazole pH 8.0 ile desteklenmiş başına getirmek. DDM ile kabı membranlar eklemek ve 4 ° C'de 1 h için ilave edin
Not: Demir konsantrasyonu % 1 w/v olacak, ama zar proteinleri solubilization için g membran eklendi deterjan kitle haberdar olmak için daha önemlidir. - 135,000 x g 4 ° C'de sigara çözündürüldükten malzeme cips için de 25 min için spin. Süpernatant 5 mikron şırınga filtre ile filtre.
- Örnek Peristaltik pompa tarafından ayarla 1 mL/dk 1 mL immobilize nikel benzeşme sütuna bir akış hızı için yük equilibrated 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 20 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 DDM.
Not: alt ifade proteinler için geliştirilmiş saflık ve verimleri 1 mL 5 mL sütun ve nikel kobalt iyonları yerine yerine benzeşme Kromatografi için kullanarak tespit edildi. - Sütun 10 sütun birimleri 20 mM Tris pH 7,0, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 80 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 içeren bir yıkama arabellek ile yıkayın DDM.
Not: yıkama sırasında-ebilmek var olmak kullanılmış için 10-His-öğesini protein imidazole konsantrasyonu genellikle için teşekkür ederiz ve geliştirilmiş saflık olur daha yüksektir. - 20 mM Tris pH 7,0, 200 mM NaCl, % 10 gliserol, 300 mM imidazole pH 8.0 ve % 0.05 içeren arabellek protein elute DDM. Eluate on 1 mL kesirler toplamak ve 4-%20 Tris-glisin SDS-sayfa jel çözündürüldükten lysate ve yıkama kesirler ile birlikte çalıştırın.
- Genellikle 5-6 mL ve konsantre 500 µL veya daha az 4 ° C'de dondurulmuş benchtop santrifüj içinde 50 kDa kesme yoğunlaştırıcı hacmindeki hakkında havuzu tepe kesirler
Not: 500 µL boyutu dışlama Kromatografi (sn) sütunlar enjekte bir tipik maksimum birimdir. Bu noktada protein veya süresiz olarak-80 ° C'de depolanabilir sn devam - Protein 0.2 µm spin sütun filtresi filtre ve S200 arabellekte equilibrated bir boyutu dışlama sütuna (Örneğin, Superdex-200) enjekte: %0,03 20 mM Mes pH 6.5, 100 mM NaCl ve % 2 gliserol DDM.
Not: tahlil cross-linking sonraki oxazolidin için bir birincil Amin arabelleğe alma Aracısı içermemelidir. SN arabellekleri gerekirse, burada ne zaman Tris Mes için alışverişi bitmiş gibi değişimi için bir fırsattır. - 4-%20 Tris-glisin SDS-sayfasında tepe kesirler jel çalıştırın. Jel leke, saf tepe kesirleri toplamak ve 50 kDa-kesme yoğunlaştırıcı 4 ° C'de konsantre
- 280 nm dalga boyunda Absorbans ve mağaza-80 ° C'de süresiz olarak ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek
5. oxazolidin tahlil Cross-linking
- 10 µL tepki 0,5 mg/mL protein S200 arabelleği, S200 arabelleği, su veya % 20 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 1 µL % 1.5 oxazolidin 1 µL tarafından takip 5 µL 3 µL karıştırarak hazırlayın.
Not: Bu 0.15 mg/mL protein ve % 0.15 oxazolidin 1 x tepki verecektir. SDS bir ön arıtma içeren örnekleri önemli negatif denetimleridir ve karışık ve 5 min için oda sıcaklığında inkübe oxazolidin eklemeden önce. - Oda sıcaklığında 30 dakika tepki kuluçkaya. Reaksiyon 5µL SDS-sayfa jel boya, oxazolidin quenches Tris arabellek aşırı içeren yükleme x 3 ekleyerek bitirmek.
- Tüm 15 µL lane başına 1,5 µg protein-ecek yük % 4-20 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerine yükleyin. Jel 200 V 30 dk. leke çalıştırın ve kanıt denatüre monomer boyutunda iki kez çalışan bir grup tarafından dimer cross-linking ölçüde belirler.
Not: Bir oxazolidin titrasyon ve zaman ders önce bir homomeric taşıyıcı için en iyi koşulları bulmak için gerçekleştirilebilir.
Representative Results
Nikel benzeşme Kromatografi gerçekleştirmesini eluted kesirler için tipik jelleri kısmen arıtılmış tüm üç proteinler (şekil 1A) göster. Merdivenin sağında lysate, hangi her durumda does değil göstermek de overexpress değil proteinler için tipik olan Bor ışınlama karşılık gelen belirgin bir bant vardır. 80 mM yıkama lane en az 10-His-öğesini protein rağmen nispeten yüksek imidazole Konsantrasyon kaybı gösterir. Bor taşıyıcıları için karşılık gelen grup eluted kesirler kolayca belirgin olduğu ve toplu eluted protein içeren düşünülen kesirler S200 jel filtrasyon sütun enjekte önce yoğunlaşmıştır. Bu aşamada, proteinler yeterince birçok aşağı akım uygulamalarda, S200 sütun (şekil 1B) enjekte önce konsantre örnek ilave bantlarında gösterildiği gibi saf. Ancak, örnek boyutu dışlama sütuna enjekte yüksek saflık (şekil 1B-C) eluted kesirler ortaya koymaktadır. Chromatograms ve onların karşılık gelen jeller her Bor taşıyıcılar için sunulmaktadır. Örnekleri elüsyon benzeşme Kromatografi üzerinden üzerine orta saflık rağmen jel filtrasyon sütundan eluting üzerine son derece saf proteindir. Eleştirel, chromatograms öncelikle bir tek monodisperse uç aynı derecede küçük protein geçersiz birim ile geçirmek için her protein ortaya koyuyor. İstikrarlı ve katlanmış protein genellikle bir monodisperse ve simetrik tepe, verir kararsız, misfolded veya toplanan protein genellikle birden fazla asimetrik zirveleri ya da büyük bir pik geçersiz hacmindeki verecektir. ScBor1 ve yaklaşık 1 mg-de her saf AtBor1 ve OsBor3 L kültür için Maya kültür litre başına yaklaşık 2 mg saf protein bir son verim elde etmek için normaldir. Bu numaralar üzerinden 4-5 g membranlar, hangi birinden kaynaklanan bir aliquot saf protein miktarı da orijinal hücre hazırlık yarısı.
Cross-linking deney arıtılmış homomeric taşıyıcılar kolayca değerlendirildi çözümde (Şekil 2) onların derleme olabilir gösterir. SDS bir ön arıtma içeren örnekleri amacı cross-linking çözüm katlanmış bir durumda bağımlı olduğu ve multimerization tarafından sert bir deterjan bozulur cross-linking bu nedenle oluşmaz olduğunu göstermektir. Gösterilen sonuçlar üç Bor taşıyıcıları, ScBor1, biri iken diğer ikisi, AtBor1 ve OsBor3, bölünmelerini ve dimerization göstermek DDM içinde bu koşullar içinde temizledi zaman dimerized değil olduğunu ayırt etmek. Tüm protein çapraz görmek mümkündür. Bu örnekte, AtBor1 için bitirme çapraz bağlantılar iken OsBor3 monomer eser miktarda görülebilir. Cross-linking ölçüde birbirlerine yakınlık lizin kalıntılarında sayısına bağlıdır ve diğer cross-linking reaktifler verimli bir şekilde farklı membran proteinlerinin bölünmelerini mümkündür.
Resim 1 . Nikel benzeşme ve boyutu dışlama Kromatografi arıtma üç Bor taşıyıcılar için. Her dikey panel(a)(B) ve (C) ScBor1, AtBor1 ve OsBor3 için veri içerir. (A)nikel benzeşme sütun. M ağırlık içinde sola belirtilen kDa ile molekül ağırlığı işaretlerinin bir merdiven var. L lysate ham ve W 80 mM imidazole yıkama. Tüm diğer numaralı yolları 1 mL kesirler ile 300 mM imidazole eluted karşılık gelir. Çubuklar kesirler yukarıda kombine ve sütuna enjeksiyonları konsantre için seçili gösterir. (B) P S200 sütun enjekte önce yoğun protein belirtir. Eluted sn kesirler sağa, onların Kromatografik kesirler (C) ile jel şerit eşleştirmek için kullanılan ayraç içine bulunmaktadır. Sadece 8 mL sonra geçersiz birimdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Tahlil cross-linking multimeric derleme için saflaştırılmış taşıyıcılar değerlendiriyor. Bir merdiven moleküler ağırlıkları ile sol tarafta gösterilir. Her şeyden önce diğer yolları gösterilir hangi protein var ve örnek oxazolidin eklendi veya SDS öncesi bir işlemden oxazolidin ek önce olmuştur. Oklar, AtBor1 ve OsBor3 monomer ve dimer konumları gösterir. ScBor1 AtBor1 ve OsBor3 daha küçük bir proteindir ve beklendiği gibi çalışır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Burada üç farklı ökaryotik Bor taşıyıcılar homojenliği için arıtma neden ayrıntılı protokolleri paylaştılar. Burada sunulan iletişim kuralları diğer protokolleri integral membran proteinlerinin, S. cerevisiae1,-14ve bizim en iyi duruma getirmeleri sonuç ifadesi için geliştirilmiş saflık ve geliştirilmiş verimleri türetilir. Burada en iyi duruma getirilmiş parametreler arasında hücre kültür büyüme birimleri ve kez, boncuk atan lizis yordamlar, hücre lizis sırasında arabellek oluşturma ve protein saflaştırma, gram membran, metal iyon kullanılan deterjan miktarı benzeşme arıtma belirlemek, benzeşme sütun ve oligomeric Işınlayıcılar multimeric durumunu değerlendirirken tarafından homolog ve deterjan uygunluğunu değerlendirmek için cross-linking bir tahlil uygulanması hacmi. Birden çok SLC4 homologs bitki ve mantar türü için başarılı iletişim kurallarıdır. Bir integral membran proteinlerinin arıtma için tüm stratejiler çalışması garanti hiçbir evrensel membran protein saflaştırma yöntemi var olduğunu kısıtlamasıdır. Bizim iletişim kuralları daha çok protein daha yakın sıra kimlik ve yapısı SLC4 taşıyıcılar ve böylece SLC4, SLC23 ve SLC26 ailelerinin üyeleri için umut verici olabilir için başarılı olmak için15hedefler vardır mümkündür. Aynı şekilde, daha evrimsel uzak Bor taşıyıcılar gelen bir membran taşıyıcı olabilir, daha büyük olasılıkla protokol ifade sistem, deterjan veya diğer anahtar parametreleri4değiştirerek farklı gibi olmak olacak.
Protokol protein saflaştırma, O'nun etiketi en çok kullanılan benzeşme etiketi yararlanır. İlk eluted kesirler yabancı maddelerin varlığı rağmen nikel benzeşme, geniş çamaşır ve sonraki sn arıtma birleşimleri sonuçları son derece saf protein. Daha sıkı imidazole yıkar bir 10-His-etiketi sağlar ve böylece daha 8-His - veya 6-His-tags yazılı izin yıkama kaldırılabilmesi için daha fazla arka plan bağlayıcı proteinler kaldırabilirsiniz. Bizim seçimler saf kesirler için tepe sn kesirler için karşılık gelen en son derece saf jel kesirler muhafazakar tarafında err. Son protein verimleri havuzu oluşturma ve daha fazla kesirler, konsantre dengelemeyi de olsa biraz daha az saf protein ile artırılabilir. Burada sunulan yöntemleri AtBor1 arıtma O'nun etiketi-kesme ve taşıyıcı farklı bir alışverişi oluşan arıtma farklılıklar ile onun kristal yapısı7, belirlenmesine yol açtı miktarda etkin deterjan kristal kırınım7geliştirmek için.
Bizim iletişim kuralı homologs ve solubilize ve onları arındırmak için kullanılan deterjan seçimi için önemli konuları gündeme getiriyor. Çünkü bu nispeten hafif, Çözücü, genellikle başarılı ve yapısal ve işlevsel membran proteinlerinin çok çeşitli çalışmalarda kullanılan DDM deterjan için ortak bir ilk seçim var. Bir deterjan bir membran için kötü bir seçim olup olmadığını belirleme içinde bir ortak yöntem değerlendirme olup protein bir tek monodisperse tepe üzerinde bir sn Kromatografik yerine geçersiz birim veya polydisperse tepeler, bir dizi büyük bir pik veriyor hangi misfolded ya da kararsız protein gösterir. Daha ince bir göz ScBor1 bizim arıtma tarafından oluşturulur. Büyük miktarlarda ve olumlu görünüyor ve monodisperse üzerinde yapısal çalışmalar için cazip bir hedef olabilir öneriyor bir sn Kromatografik arındırır. Ancak, bizim cross-linking tahlil saf bir monomer olduğunu ortaya koymaktadır. ScBor1 yerel olarak hücredeki bir monomer olarak var olabilir mümkün olsa da, çalışmalar SLC4 taşıyıcılar ve onların homologs dimer7,8,9,10olma olasılığı olduğunu gösteriyor. Bizim geliştirme cross-linking testin crystallizing ve AtBor1 yapısını çözme sonra oluştu. Ancak, biz ScBor1 AtBor1 ile karşılaştırıldığında cross-linking tahlil ile değerlendirmek mümkün olmuştu değerli zaman ve araştırma çabalarını yönlendirildi AtBor1 yerine ScBor1, ikincisi olan sonuçta değil başarılı takip kristalizasyon, kırınım deneyleri. Bu tahlil böylece araştırmacılar homologs ya da yapısal çalışmalar takip protein onun şüpheli yerel biçimi korur koşulları öncelik vermek için kullanılacak deterjanlar arasında ayırt yardımcı olabilir. Ayrıca, tahlil hangi amino asitler multimerization arayüzü ve kurşun monomerleri zorunluluğunu istikrarsızlaştırmak amino asit oyuncu değişikliği bulmak için multimerization için kritik soruşturma için kullanılabilir. Böyle bir yaklaşım membran taşıyıcı16,17,18homomeric derlemesinde işlev önemini incelemek için kullanılmıştır.
Bir genel bizim yöntem Maya birçok zorlu membran proteinlerinin çeşitli işlev1ifadesi etkinleştirmek için gösterilen avantajdır. Ayrıca, düşük maliyet ve büyüme kez daha az doku kültürü veya pahalı büyüme medya gerektiren ifade stratejileri kullanmak mümkün olabilir birçok araştırma çabalarını için erişilebilirlik reklamını. Burada sunulan yordamları nispeten ucuzdur ve bir hafta içinde hangi fizibilite yaklaşımının altını çiziyor gerçekleştirilebilir. Bu iletişim kurallarının uygulanması zor diğer membran proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmaların etkinleştirmek yardımcı olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma başlangıç fonlar Davidson College tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES) | Acros | 172591000 | |
| Äkta Pure 25 L FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC905024 | for concentrating nickel column fractions |
| Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator | Millipore | UFC805024 | for concentrating S200 fractions |
| Bacto Peptone | BD Diagnostics | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Diagnostics | 288620 | |
| Glass Erlenmeyer flask, 2L | Sigma-Aldrich | CLS44442L | |
| Benchtop centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Bottle top filter | Nalgene | 595-4520 | the membrane is removed and used to filter glass beads |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Complete supplement mixture without histidine | Sunrise Science | 1006-100 | |
| D-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| Ethanol, 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Bio-Rad | 1658004 | |
| Glass bead-beating cell disruptor | BioSpec | 1107900 | |
| Glass beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105 | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | sent as an 8% solution under nitrogen |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| HiTrap IMAC FF column, 1 mL | GE Healthcare | 17-0921-02 | charged with nickel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Imidazole | Acros | 12202 | |
| Instant Blue gel stain | Expedeon | ISB1L | |
| JA-10 rotor | Beckman | 369687 | |
| JA-14 rotor | Beckman | 339247 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Thermo Scientific | 3451 | |
| Microcentrifuge, refrigerated | Fisher | 13-100-676 | |
| Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20% | Bio-Rad | 456-1096 | |
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | F155005 | used for loading lysate onto affinity column |
| n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM) | Inalco | 1758-1350 | |
| Nickel(II) Sulfate Hexahydrate | Sigma-Aldrich | 227676 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick | C24 | |
| p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert | available from authors | ||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Acros | 215740050 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes | Beckman | 355618 | |
| Polypropylene bottles, 250mL | Beckman | 356011 | |
| Polypropylene bottles, 500mL | Beckman | 355607 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | Bio-Rad | 1610375 | |
| S. cerevisiae expression strain DSY-5 | available from authors | ||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Spin column with 0.2 µm filter, 0.5mL | Millipore | UFC30GV0S | for filtering protein before injecting onto S200 column |
| Sterile Falcon tubes, 15mL | Lab Depot | TLD431696 | |
| Sterile Falcon tubes, 50mL | Lab Depot | TLD431698 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | used for SEC purification |
| Syringe filter, 5µm | Pall | 4650 | for filtering lysate before loading affinity column |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman | 337922 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-70M | |
| YNB+Nitrogen without amino acids | Sunrise Science | 1501-500 |
References
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Andréll, J., Tate, C. G. Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).
- Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).
- Coudray, N., et al. Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation. Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).
- Arakawa, T., et al. Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3. Science. 350 (6261), 680-684 (2015).
- Huynh, K. W., et al. CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Zhao, R., Reithmeier, R. A. Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).
- Takano, J., et al. Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature. 420, 337-340 (2002).
- Nakagawa, Y., et al. Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading. Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).
- Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast. Methods in Enzymology. 470, Issue C (2010).
- Chang, Y. -N., Geertsma, E. R. The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers. Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).
- Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Design, function and structure of a monomeric ClC transporter. Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).
- Last, N. B., Miller, C. Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter. Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).
- Yu, X., et al. Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters. Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).
