Summary
Dit protocol is bedoeld om stapsgewijze de techniek van extractie en beoordeling van de hartfunctie te beschrijven met behulp van gevilde cardiomyocyten. Deze methode maakt het mogelijk om de myofilamentfunctie te meten en te acuut temodificeren met kleine bevroren biopsieën die kunnen worden verzameld vanaf verschillende hartlocaties, van muizen tot mannen.
Abstract
In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om een enkele permeabiliseerde cardiomyocyte ("gevild") te isoleren en te bevestigen aan een krachtmeetapparaat en een motor om functionele studies uit te voeren. Deze studies zullen het mogelijk maken cardiomyocyte stijfheid (passieve kracht) en de activering ervan met verschillende calcium (Ca2 +)-bevattende oplossingen te bepalen, onder andere: maximale kracht ontwikkeling, myofilament Ca2 +-gevoeligheid (pCa50), cooperativiteit (nHill) en de snelheid van kracht herontwikkeling (ktr). Deze methode maakt het ook mogelijk om de effecten van geneesmiddelen die rechtstreeks op myofilamenten werken en van de expressie van exogene recombinante eiwitten op zowel actieve als passieve eigenschappen van cardiomyocyten te bepalen. Klinisch, gevilde cardiomyocyte studies benadrukken de pathofysiologie van veel myocardiale ziekten en maken in vitro beoordeling van de impact van therapeutische interventies gericht op de myofilaments. Al met al maakt deze techniek het mogelijk om cardiale pathofysiologie te verduidelijken door correlaties te onderzoeken tussen in vitro en in vivo parameters in diermodellen en menselijk weefsel verkregen tijdens een open hart- of transplantatieoperatie.
Introduction
Traditioneel is de beoordeling van myocardiale mechanische eigenschappen meestal geprobeerd in meercellige preparaten, zoals papillaire spieren en trabeculae1,2. Meercellige cardiale spieren strips omvatten een heterogene populatie van cellen, met inbegrip van contractiel cardiomyocyten met een onbekend patroon van oriëntatie en kracht generatie, elektrische activiteit en stress / stam distributies, evenals een omringende bindweefsel matrix3,4. Een preparaat zonder collageen en met een enkele cardiomyocyte zou het mogelijk maken de sarcomere lengte en cross-bridge contractiel eigenschappen op een zeer nauwkeurige en gecontroleerde manier5,6. Daarom zijn in de afgelopen vier decennia verschillende methoden ontwikkeld die het mogelijk maken de mechanische, contractiele en ontspanningseigenschappen van één cardiomyocyte6,7teonderzoeken . De contractiele functie van deze cellen is sterk afhankelijk van sarcomere lengte en cross-bridge fietsen kinetiek3. Zo is het wenselijk om de spierfunctie direct te onderzoeken in enkele geïsoleerde hartcellen, gezien het feit dat het mogelijk maakt sarcomere lengte en prestaties te beoordelen, evenals cross-bridge functie en contractiele eigenschappen. Het isoleren en bevestigen van functionele cardiomyocyten met een redelijke optische sarcomereresolutie tijdens het opnemen van krachtmeting op μN-niveau is echter nog steeds uitdagend en evoluerend3,6. Andere uitdagingen zijn de logistiek die moet worden geïnstalleerd om cardiomyocyten te isoleren van vers ingezamelde biopten. De onvoorspelbaarheid van de verzameling van menselijke biopten kan bijvoorbeeld de haalbaarheid van de experimenten in gevaar brengen.
Bovendien hebben ethische bezwaren met betrekking tot de vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven voor wetenschappelijke procedures (beginselen van de 3R's) studies op cellulair en weefselniveau bevorderd, bij voorkeur in menselijke biopten, of in kleinere diermonsters. Een geleidelijke verfijning van methodologieën om de hartfunctie in vitro op een kleiner niveau van complexiteit te beoordelen, maakt een goede integratie van de resultaten met het hele lichaam mogelijk en vertaalt deze naar het klinische scenario7. Al met al kan het gebruik van monsters die bij -80 °C zijn opgeslagen om cardiomyocyten te extraheren een aantrekkelijk alternatief zijn.
Het myocardiaal weefsel wordt in kleine stukjes gesneden en gehomogeniseerd met een mortier en een stamper. Het resultaat van deze homogenisatie is een suspensie van gevilde gebundelde en geïsoleerde cellen met verschillende mate van sarcolemmale schade, waarbij het myoplasma wordt blootgesteld aan het badmedium en alle cellulaire componenten worden uitgewassen. Structuren zoals de myofibrils die verder van de sarcolemma verwijderd zijn, worden bewaard. Zo worden sarcomere verkorting en functionele eigenschappen in verband met het myofibrillar apparaat intact gehouden en kunnen8,9worden geregistreerd .
Het cardiomyocyte krachtmeetsysteem bestaat uit een elektromagnetische motor, gebruikt om de cardiomyocyte lengte aan te passen, en een krachttransducer, die isometrische cardiomyocyte contractie meet. Een permeabiliseerde of gevilde cardiomyocyte wordt geplaatst in een experimentele kamer met een ontspannende oplossing ([Ca2+] < 10 nM) en silicium gelijmd aan 2 dunne naalden: een bevestigd aan de motor en de andere aan de krachttransducer. Een optisch systeem wordt gebruikt om cardiomyocyte morfologie en sarcomere lengte te bepalen. Het experimentele protocol bestaat vaak uit een reeks krachtopnames op bufferoplossingen die verschillende Ca2+ concentraties bevatten, de bepaling van actin-myosine cross-bridge kinetiek en het meten van de passieve spanning van de gemonteerde cardiomyocyten op vooraf gedefinieerde sarcomerelengtes(figuur 1). Isolatie van permeabiliseerde cardiomyocyten van myocylaten bevroren in vloeibare stikstof (en vervolgens opgeslagen bij -80 °C) is een techniek die gebruik maakt van cellulaire mechanica en eiwitbiochemie voor het meten van maximale Ca2 +-geactiveerde (actieve) kracht per dwarsdoorsnedegebied (Tactief, kN·m-2), Ca2+-onafhankelijk (passieve) spanning (Tpassief, kN·m-2), myofilaments Ca2+-sensitiviteit (pCa50), myofilaments cooperativity (nHill), het tempo van krachtherontwikkeling (ktr) en sarcomere lengte afhankelijkheden van Tactief, Tpassief, pCa50, nHill en ktr.
Het doel van dit protocol is om het potentieel van het cardiomyocyte krachtmeetsysteem te illustreren en samen te vatten als een betrouwbare procedure om de functionele mechanische eigenschappen van enkel gevilde cardiomyocyten geïsoleerd van bevroren monsters van verschillende soorten te beoordelen.
Protocol
Alle dierproeven voldoen aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH Publicatie nr. 85-23, herzien 2011) en de Portugese wet op dierenwelzijn (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De bevoegde lokale autoriteiten keurden dit experimentele protocol (018833) goed.
1. Voorbereiding van de voorraadoplossing (Tabel 1)
- Bereid 1.000 mL ontspannende oplossing voor cardiomyocyten isolement (RELAX-ISO) door instructies in tabel 2te volgen. Los het reagens hierboven op in ≈500 mL en pas de pH aan op 7,0 met KOH. Pas het uiteindelijke volume aan op 1000 mL.
- Verdeel RELAX-ISO in buizen van 50 mL. Bewaar bij -20 °C.
- Bereid 250 mL activerende oplossing voor door de instructies in tabel 3op te volgen . Los de reagentia hierboven op in ≈100 mL ultrazuiver water. Stel de pH aan op 7,1 met 5 M KOH bij 15 °C.
OPMERKING: Meestal is het noodzakelijk om een aanzienlijke hoeveelheid KOH toe te voegen om de gewenste pH te bereiken. Doe de volumetrische ballon in een doos met ijs om de oplossing af te koelen tot 15 °C.- Pas het uiteindelijke volume aan op 250 mL. Roer deze oplossing continu met een magnetische roerder tot het moment van mengen met de ontspannende oplossing.
- Bereid 100 mL ontspannende oplossing voor door de instructies in tabel 4op te volgen. Los de reagentia hierboven op in ≈50 mL ultrazuiver water. Stel de pH aan op 7,1 met KOH 5 M op 15 °C.
OPMERKING: Meestal is het noodzakelijk om een aanzienlijke hoeveelheid KOH toe te voegen om een pH van 7.1 te bereiken. Plaats de volumetrische ballon in een doos gevuld met ijs om de oplossing af te koelen tot 15 °C. De ionische sterkte van de oplossingen die tijdens de metingen werden gebruikt bedroeg 180 mM.- Pas het uiteindelijke volume aan op 100 mL. Roer deze oplossing continu met een magnetische roerder tot het moment van mengen met activerende oplossing.
- Mix activerende en ontspannende oplossingen in de in tabel 5 gepresenteerde verhoudingen om pCa-oplossingen tussen 5.0 en 6.0 te verkrijgen.
- Houd altijd ontspannen en activeren van oplossingen roeren tijdens het mengen van beide.
- Aliquot elk mengsel tot 2 mL microbuisjes. Bewaar alle microbuisjes bij -20 °C.
- Bereid voor elk protocol een andere batch pCa-oplossing (4,5 tot 6,0) voor.
2. Kalibratie van de krachtomvormer
OPMERKING: De kalibratie van de krachttransducer is een routineprocedure die om de paar maanden moet worden uitgevoerd of wanneer wordt vermoed dat deze niet is gekalibreerd. De krachttransducer is zeer gevoelig en is gemakkelijk gebroken. Het moet voorzichtig worden behandeld in elke stap van het gebruik ervan, met inbegrip van kalibratie, lijmen van de cardiomyocyte en reiniging.
- Maak de krachttransducer los van de rest van het apparaat.
- Plaats de krachttransducer met behulp van een klem horizontaal zodanig dat de naald naar beneden wijst in dezelfde richting dat de cardiomyocyte kracht zal ontwikkelen. Dit zal het vergemakkelijken van het ophangen van een reeks massa's met bekende gewichten (elastische band, hechting of pin).
OPMERKING: Controleer de kenmerken van de krachttransducer voordat u naar deze stap gaat om de schaalfactor [mg/volt] te controleren en om overmatig gewicht op de transducer te voorkomen. Voor het force transducer model is de schaalfactor 50 (50 mg komt overeen met 1 volt) en gebruiken we 5 gewichten tussen 12,5 en 250 mg. - Zet de krachttransducer aan en laat hem 30 minuten opwarmen.
- Begin met het ophangen van de lichtere massa aan de krachttransducer en het registreren van de overeenkomstige spanning gemeten bij FORCE OUT.
- Herhaal deze procedure voor maximaal vijf gewichten.
- Plotkracht toegepast op de krachttransducer (belasting) versus spanning en controleer op lineariteit.
- Als er geen lineariteit is, pas dan de nul aan en verkrijg potentiometers in de printplaat van de transducer. Controleer de specifieke instructie voor meer informatie.
- Draai de nul potentiometer totdat de uitgangsspanning 0,0 V afleet.
- Hand een gemiddeld gewicht op de transducer naald en pas de gain potentiometer aan om de overeenkomstige spanning af te lezen (bijvoorbeeld, 50 mg komen overeen met 1 V). Verwijder het gewicht en pas de nul potentiometer opnieuw aan op 0,0.
- Herhaal stap 2.6.2 tot de output met en zonder het gewicht correct is.
- Monteer de krachttransducer terug in het apparaat.
3.
- Ontdooi een flesje van elk van de activerende, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 en ontspannende oplossingen en onderhoud ze op ijs.
LET OP: ATP en PCr zijn labiele verbindingen die bij koude temperaturen moeten worden onderhouden. - Bereid de microscoop, het testapparaat en de bijbehorende computer voor(figuur 1).
- Pas de temperatuur zo aan dat de thermometer in de kamer 15 °C aft. Voer alle experimenten uit op deze temperatuur, met uitzondering van kinase en fosfatase incubaties (20 °C).
- Zet de kracht-transducer en de motor aan.
4. Extractie en permeabilisatie van gevilde cardiomyocyten
- Ontdooi 50 mL RELAX-ISO oplossing.
- Zet de centrifuge aan en koel hem snel af tot 4 °C.
- Ontdooi 3-5 μg van een myocardmonster in een petrischaaltje met 2,5 mL RELAX-ISO-oplossing.
- Snijd het weefsel in kleine stukjes met een scalpelmes(figuur 2). Snijd het monster op een precieze manier om onnodige schade aan de cellen te voorkomen.
- Breng de 2,5 mL RELAX-ISO oplossing met het weefsel naar een Potter-Elvehjem glas met behulp van een gesneden pipet tip.
- Verstoor het weefsel mechanisch met een molen bij een rotatiesnelheid van 30-40 tpm. Druk het weefsel 3 keer voor 2 s elk om een goede cel suspensie te verkrijgen.
- Bereid 10% Triton in RELAX-ISO oplossing (250 μL Triton met 2,25 mL RELAX-ISO) in een 15 mL buis en voeg deze oplossing toe aan de celsuspensie.
- Meng voorzichtig door de buis 3 keer om te keren.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min en 4 min op ijs.
- Was de Triton door relax-ISO toe te voegen aan de bovenkant van de 15 mL buis; zachtjes mengen (3 keer de buis omkeren) en uiteindelijk de cellen in een schuine centrifuge (1 min bij 348 x g)naar beneden draaien. Verwijder de supernatant tot 3 mL boven de celpellet.
LET OP: Verwijder de supernatant voorzichtig om te voorkomen dat de cel pellet storen. Toch zullen sommige cellen in supernatant onvermijdelijk verloren gaan. - Herhaal de stap 4.10 ten minste 4 keer of totdat er geen bellen meer worden geproduceerd door Triton-residuen.
LET OP: Hoe meer uitwasstappen worden gemaakt, hoe meer cellen verloren gaan met de afgedankte supernatant. - In de laatste wash-out, verwijder de supernatant tot een volume van 5-10 mL van de cel suspensie.
5. Selecteren en lijmen van de gevilde cardiomyocyte
- Leg een celophangdruppel op een coverslip bovenop een glazen schuif in de schuifhouder van de microscoop(figuur 1).
- Selecteer een enkele staafvormige cardiomyocyte met een goed strepenpatroon en een goede grootte(figuur 2).
- Vind de naaldtips van de kracht-transducer en de motor met behulp van de laagste vergroting van de omgekeerde microscoop.
- Draai de coverslip om de geselecteerde cardiomyocyte horizontaal te positioneren, zodat de uiteinden worden uitgelijnd met de naald van de krachttransducer en de motor (figuur 2).
- Plaats een dunne lijn lijm op de zijkant van de coverslip met behulp van een wattenstaafje(figuur 2).
- Dompel de naaldtips van de krachttransducer en de motor onder in de lijmlijn om een lijmhalo rond beide uiteinden te creëren.
OPMERKING: Stappen 5.6 - 5.10 worden bereikt door zorgvuldig gebruik van de gemotoriseerde micropositioners. - Verplaats snel de naaldtips dicht bij het brandpuntsvlak van de cardiomyocyte.
- Verplaats de naaldpunt van de krachttransducer naar beneden, zodat deze aan één rand van de cardiomyocyte lijmt.
- Herhaal deze procedure met de punt van de motor en het andere uiteinde van de cel.
LET OP: Deze procedure moet minder dan 2-3 min duren als de lijm zeer snel begint te genezen. - Til na 5-8 min de naalden ≈15 μm op om te voorkomen dat de cel aan de afdekken wordt gelijmd. Dit wordt gedaan door het verplaatsen van beide micromanipulatoren tegelijk.
- Laat de lijm genezen. Deze procedure kan duren van 15 tot 45 min, afhankelijk van het type lijm. In ons geval is de cardiomyocyte voldoende gelijmd na ≈15 min.
6. Het registreren van krachtmetingen van actieve, passieve en Ca2+ gevoeligheid
- Vul de eerste experimentele put met de ontspannende oplossing (55-100 μL in het experimentele apparaat) en de tweede experimentele put met activerende oplossing.
- Plaats met behulp van de camerasoftware de regio van belang (ROI) in een gebied van de cardiomyocyte met een duidelijk patroon van strepen.
OPMERKING: Voor cardiale myocyten varieert de werkingsarcomerelengte tussen 1,8 en 2,2 μm en de optimale sarcomerelengte is ongeveer 2,15 μm. - Meet de afstand tussen de twee uitersten van de cardiomyocyte (van de motor tot de transducerlijmhalo, figuur 3)nadat de optimale sarcomerelengte is ingesteld (2,2 μm). Nota van de waarde als myocyte lengte in de software.
- Meet cardiomyocyte breedte en diepte, de laatste met behulp van een prisma spiegel loodrecht geplaatst op de cel.
OPMERKING: Er is een krachtige, externe lichtbron nodig om de cel door het prisma te visualiseren. In het geval er geen prisma, en ervan uitgaande dat hartcellen hebben een elliptische vorm, cardiomyocyte diepte kan worden afgeleid als 70% van cardiomyocyte breedte. - Bereken doorsnedegebied (CSA, mm2) uitgaande van een elliptische vorm van de cardiomyocyte.
- Beweeg het microscoopstadium voorzichtig, zodat de cel van de coverslip naar de put met ontspannende oplossing op de achterkant van het podium beweegt.
LET OP: Deze procedure kan de cel gemakkelijk beschadigen. Voordat u de cel beweegt, beweegt u de naalden voorzichtig een beetje meer omhoog. Vermijd het verwijderen van de cel uit de oplossing. - Selecteer het protocol in software die twee celverkorting bevat (80% van de initiële lengte), die zal optreden wanneer de cel wordt opgedoken in ca2+ oplossing en in ontspannende oplossing, respectievelijk(figuur 1, Aanvullend bestand).
OPMERKING: De eerste "Slack" van de cel wordt uitgevoerd binnen de activerende oplossing en de tweede "Slack" binnen ontspannende oplossing. Door dit te doen, zal de gebruiker in staat zijn om de totale kracht (Ftotaal)van de cel te berekenen vanaf de1e en de passieve kracht (Fpassief)van de cel vanaf de2e. Gebruik de formule om actieve kracht te berekenen, Factief = Ftotaal - Fpassief. De cel wordt 80% ingekort om alle kruisbruggen recordkracht los te maken. - Ontlok isometrische contractie door het microscoopstadium te verplaatsen zodat de cardiomyocyte van het ontspannen naar de activerende oplossing beweegt (pCa=4.5(1)).
LET OP: Als de cel functioneel is, wordt deze onmiddellijk gecontracteerd. - Bij het bereiken van kracht plateau, beginnen met het opnemen van de kracht gegevens.
LET OP: De tests kunnen individueel worden gedaan. Afhankelijk van de software is er de mogelijkheid om een reeks tests te maken die overeenkomen met de verschillende Ca2+ oplossingen binnen een Ca2+-gevoeligheidsprotocol(figuur 1, aanvullend bestand). - Wacht ~ 10 s en schakel vervolgens de cel ondergedompeld in het activeren van oplossing.
OPMERKING: Het is belangrijk om 10 s te wachten voordat u de cel onderdompelt in ontspannende oplossing. Als de cel te vroeg wordt verplaatst, kunnen belangrijke gegevens verloren gaan om de herontwikkelingskracht van de cel (ktr-waarde) te berekenen. - Verplaats het podium snel zodat de cardiomyocyte zich onderdompelt in de ontspannende oplossing.
- Wacht tot de test stopt.
- Herhaal stap 6.8 - 6.12 zodat de cel twee keer wordt geactiveerd bij het activeren van oplossing (pCa=4.5(2)).
OPMERKING: Meestal, na de eerste activering, cardiomyocyte uiteinden kunnen iets los te maken van de naald tips, het veranderen van de cardiomyocyte lengte, CSA en / of de sarcomere lengte. Aangepast aan de gewenste sarcomere lengte en de juiste afmetingen in de software te introduceren.- Ga door naar stap 6.13.2 voor Ca2+ gevoeligheidsprotocol of sla de gegevens op, als waarden van passieve en actieve kracht van de cel de enige parameters zijn die nodig zijn en de cel loskoppelen van naalden en ze reinigen met aceton om de lijm te verwijderen.
- Pas de sarcomerelengte van de cel aan op 2,2 μm door deze indien nodig weer iets uit te rekken.
- Vervang de activerende oplossing door de volgende Ca2+ oplossing (55-100 μL hier). Herhaal stap 6.8 - 6.12.
- Vervang de activerende oplossing door de volgende Ca2+ oplossing (55-100 μL hier) en herhaal stap 6.8 - 6.12 totdat alle oplossingen zijn getest (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
- Tot slot activeert u de cel opnieuw met een activerende oplossing (pCa4.5(3)). Herhaal stap 6.8- 6.12.
7. Incubatie met kinases en fosfata's
- Verdun na het uitvoeren van het geselecteerde basisprotocol de kinase/fosfatase in Ontspannende oplossing bij de aanbevolen concentratie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voorafgaand aan het experiment een dosisresponscurve uit te voeren. - Stel de temperatuur van de experimentele putten in op 20 °C.
- Vul de experimentele putten met kinase/fosfatase, ontspannende oplossing en activerende oplossing (55-100 μL).
- Beweeg voorzichtig het microscoopstadium zodat de cel wordt ondergedompeld in de put met kinase/fosfatase.
- Incubeer de cardiomyocyte met de kinase/fosphatase gedurende ten minste 30 min of volgens de instructies van de fabrikant.
- Herhaal het geselecteerde basislijnprotocol.
8. Afronding van het experiment
- Unglue de cardiomyocyte van de uiteinden van de krachttransducer en motor door het uitrekken van de cel.
- Verwijder voorzichtig de lijmhalo van de naaldtips met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in aceton.
- Sluit de apparatuur af.
9. Analyseren van de gegevens
- Verzamel alle bestanden van elke cardiomyocyte getest.
LET OP: Elke test komt overeen met één bestand. Dit betekent dat er voor elke Ca2+ oplossing of sarcomerelengte een bijbehorend bestand zal zijn. - Bereken actieve en passieve krachten van een enkele cardiomyocyte.
- Open het bestand dat overeenkomt met de eerste activering (pCa=4.5(1)) met behulp van een spreadsheet(figuur 3A, aanhangsel A in aanvullend bestand).
OPMERKING: We hebben een programma op maat gemaakt om de analyse uit te voeren. Zie aanhangsel A in het aanvullende dossier. - Gemiddelde ≈60 waarden voor en gemiddelde ≈60 waarden na de1e speling van de cel (wanneer de cel wordt ondergedompeld in Ca2 + oplossing). Deze 2 waarden komen overeen met respectievelijk a en b.
- Herhaal dezelfde analyse voor de2e speling van de cel (wanneer de cel wordt ondergedompeld in ontspannende oplossing). Deze 2 waarden komen overeen met respectievelijk c en d.
- Bereken het verschil tussen a en b (totale kracht, Ftotaal).
- Bereken het verschil tussen c en d (passieve kracht, Fpassief).
- Bereken actieve kracht, Factief = Ftotaal - Fpassief.
- Normaliseer alle krachtwaarden naar CSA (zie bovenstaande formule) om de totale spanning (Ttotaal),passieve spanning (Tpassief)en actieve spanning (Tactief)te verkrijgen.
- Herhaal stap 9.2.1 tot 9.2.5 voor de2e activering (pCa=4.5(2)).
- Beschouw deze waarden als die die Ttotaal,Tactief en Tpassief van cardiomyocyte onder analyse vertegenwoordigen.
OPMERKING: De eerste activering van de cel met pCa4.5(1) wordt meestal geassocieerd met wijzigingen in celafmetingen. Om deze reden is de 2e activering met pCa4.5 nauwkeuriger en is het een te gebruiken. - Herhaal de stappen 9.2.1 tot en met 9.2.5 voor elk bestand/pCa-geteste oplossingen (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Open het bestand dat overeenkomt met de eerste activering (pCa=4.5(1)) met behulp van een spreadsheet(figuur 3A, aanhangsel A in aanvullend bestand).
- Bereken pCa50 en nHill van een enkele cardiomyocyte.
OPMERKING: Gebruik voor deze analyse de niet-genormaliseerdeF-actieve waarden uit de bestanden 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 en 4.5(3).- Plaats in een spreadsheetbestand alle niet-genormaliseerde waarden van Fdie actief zijn voor elke geteste Ca2+-oplossing (4.5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- Bereken de correctiefactor = Factief [4.5(2)] - Factief [4.5(3)] / 7.
- Bereken de gecorrigeerde waarden van Factief voor elke Ca2+ oplossingen (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) door Factive - correctiefactor af te trekken.
- Bereken de relatieve kracht (Frelatief)voor elke Ca2+-oplossing door elke actieve F-waardente normaliseren met de overeenkomstige gecorrigeerde waarde.
OPMERKING: HetF-relatieve [4.5(3)] moet gelijk zijn aan 1. Elk experimenteel protocol begint en eindigt met een controleactivering bij verzadigende Ca2+-concentratie (pCa 4.5(2) en 4.5(3)). Dit maakt force normalisatie en beoordeling van het vervallen van de voorbereidingen door de vergelijking van veranderingen in maximale Ca2 +-geactiveerde kracht (Fmax). Als aan het einde van het experimentele protocol de cardiomyocyt minder dan ten minste 70% van de maximale kracht van de eerste samentrekking produceert, moet die cel/meting van de analyse worden uitgesloten. - Gebruik hetF-relatieve en de bijbehorende pCa-waarden om aan te passen aan een sigmoïdale curve met de volgende vergelijking F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
- Extrapoleren pCa en nHill waarden van de bovenstaande vergelijking.
- Bereken de snelheid van krachtherontwikkeling (ktr) van een enkele cardiomyocyte.
- Voer een pasvorm uit op de curve die overeenkomt met de waarden onmiddellijk na de1e celspeling.
- Bereken de helling van de curve en deze waarde komt overeen met de snelheid van krachtherontwikkeling.
- Herhaal stap 9.4.1 en 9.4.2 voor elke Ca2+ oplossing.
LET OP: Een slechte curve fit zal worden verkregen voor de laagste Ca-oplossingen (R kwadraat≤0,90).
Representative Results
Functionele permeabiliseerde cardiomyocyten moeten uniform lijken en met een consistent strepenpatroon gedurende het hele experiment. Hoewel na langdurige experimenten een zekere mate van verslechtering en afname van de kracht wordt verwacht, moeten de waarden van actieve spanning relatief stabiel zijn. Cellen met duidelijke tekenen van striatieverlies of significante krachtdaling (< 15 kN·m-2 of <80% van de initiële actieve kracht) moeten worden uitgesloten. Tabel 6 geeft de verwachte normale waarden weer voor de belangrijkste parameters die zijn afgeleid van knaagdieren, varkens en menselijke monsters.
De verkregen parameters zijn voornamelijk afhankelijk van het gekozen protocol. Figuur 5 toont representatieve krachtsporen van 3, van de 8, krachtopnames die nodig zijn om een protocol van myofilaments Ca2+-gevoeligheid uit te voeren. Door de cel over te brengen naar een put die de activerende oplossing bevat, begint de cardiomyocyte kracht te ontwikkelen totdat het een plateau bereikt. Na een snelle slappe test (duur van 1 ms), waarbij de cardiomyocyte verkort tot 80% van de lengte, verkrijgen we de basiswaarden van nulkracht. Na de slappe test blijft de cel kracht ontwikkelen terwijl deze wordt ondergedompeld in de activerende oplossing. Totale kracht (Ftotaal)wordt berekend door de plateauwaarde af te trekken van de minimale waarde. De helling van het laatste deel van deze curve geeft ons de waarde van de snelheid van krachtherontwikkeling (ktr) (Figuur 6), dat is een maat voor de schijnbare snelheid van brugbevestiging en detachement (fapp en gaap)10. Wanneer de ktr R2-waarde <0.90 is, moet de ktr-waarde worden uitgesloten en meestal gebeurt dit bij lagere Ca2+ concentraties (pCa 5.6, 5.8 en 6.0). Na het overbrengen van de cel terug naar een put met de ontspannende oplossing, ontspant de cel en daalt de kracht. Passieve kracht (Fpassief)wordt berekend door de minimale waarde (verkregen na een langdurige celverkorting) af te trekken aan deze nieuwe waarde van kracht. Actieve kracht vloeit voort uit het verschil tussen Ftotaal en Fpassief.
De maximale actieve en passieve kracht die een cardiomyocyte kenmerkt, is die van de tweede celactivering met een verzadigende Ca2+-oplossing (pCa = 4,5). De eerste activering wordt meestal weggegooid als de sarcomere lengte vaak moet worden aangepast.
Voor het uitvoeren van een myofilament Ca2+-gevoeligheidsprotocol is het noodzakelijk om ten minste 9 activeringstests uit te voeren (4,5; 4,5; 5,2; 5,6; 6,0; 5,0; 5,4; 5,8 en 4,5). Deze volgorde is slechts een voorbeeld, maar moet altijd beginnen met 4,5 (twee maal) en eindigen met 4,5. De programmering van de data-acquisitie software voor een myofilament Ca2+-gevoeligheid protocol is afgebeeld in figuur 1 van het aanvullende bestand.
Controleer na het berekenen van actieve kracht voor al deze activeringsoplossingen of de laatste activering meer dan 80% van de initiële maximale kracht heeft opgeleverd (anders moeten deze celresultaten worden weggegooid, zoals hierboven vermeld). Om de daling van Fmax tijdens de experimentele serie te corrigeren, kunnen de geïnterpoleerde Fmax-waarden worden gebruikt om de gegevenspunten te normaliseren. De genormaliseerde gegevens kunnen worden aangepast aan een sigmoïdale curve met de volgende vergelijking F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). De verkregen parameterwaarden vertegenwoordigen de calciumgevoeligheid (Ca50, die kan worden omgezet in pCa50) en cooperativity (nHill). Alle krachtwaarden kunnen worden omgezet in spanningswaarden nadat ze zijn genormaliseerd naar het doorsnedegebied. Naast myofilament Ca2+-gevoeligheid en de lengte-afhankelijke activeringsprotocollen, kunnen andere tests worden uitgevoerd. Dit is het geval bij sarcomere lengteafhankelijkheden van Tactief, Tpassief (figuur 7), en cardiomyocyte restkracht. Restkrachtopnamen worden berekend op basis van het initiële krachtterugwinning (pCa 4.5) dat is bereikt na de lengteverandering van de cel (80%) en genormaliseerd op elke totale steady-state kracht bereikt vóór lengte verandering11. Toename van de restkracht is meestal indicatief voor kruisbruggen met langzame onthechting kinetiek en hogere stijfheid.
Tot slot moeten we benadrukken dat deze techniek kan worden uitgevoerd in gevilde cardiomyocyten die mechanisch worden geëxtraheerd uit bevroren of vers verzamelde monsters, evenals enzymatisch geïsoleerd, gevolgd door de permeabilisatie van de membranen. De manier waarop de cardiomyocyten geïsoleerd zijn, beïnvloedt aanzienlijk de resultaten die uit deze techniek worden afgeleid. Figuur 8 toont de verschillen die tussen de drie isolatieprocedures worden waargenomen.
Figuur 1: Geïntegreerd schema van het testapparaat. Het testapparaat omvat de microscoop, de micromanipulatoren en de bijbehorende computer. De onderkant van de figuur toont een gevilde cardiomyocyte gelijmd tussen de motor en de krachttransducer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Stroomdiagram van het protocol van celisolatie, permeabilisatie en lijmen. De afbeelding linksboven bestaat uit 4 afbeeldingen met stukken van het hartmonster in de RELAX-ISO-oplossing(A)in een petrischaaltje, (B) in een buis die wordt gebruikt voor mechanische homogenisatie van weefsel, (C) de homogenisator, (D) het weefsel onmiddellijk na homogenisatie en (E) wanneer het in een buis voor Triton permeabilisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van de lengte en sarcomere lengte van een gevilde cardiomyocyte. Cellengte en breedtebepaling op een sarcomerelengte van ≈2,2 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Lengte-afhankelijk activeringsprotocol (bootst het Frank-staring mechanisme in vitro na). Representatieve krachtsporen en parameters die zijn afgeleid van myofilaments' Ca2+ gevoeligheidsprotocollen die eerder werden uitgevoerd (A, 1,8 μm) en na het uitrekken van een cardiomyocyte tot 2,2 μm (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Myofilaments Ca2+-gevoeligheidsprotocol. Representatieve krachtsporen en afgeleide parameters. Omwille van de eenvoud worden slechts 3 van de 8 krachtcurven afgebeeld. Namelijk een cardiomyocyte geactiveerd met de verzadigende, een tussenliggende en de laagste Ca2 +-bevattende oplossing (respectievelijk 4,5, 5,6 en 6,0). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatieve sporen van een muizen cardiale cel geactiveerd bij verschillende calcium oplossingen en de respectieve ktr fit curve. a) pCa 4.5; b) pCa 5.0; c) pCa 5.2; d) pCa 5.4; (E) pCa 5.6; (F) pCa 6.0 en E waarden voor totale, passieve en actieve spanning, ktr waarde en Rsquare voor ktr fit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Protocollen betreffende de lengteafhankelijkheden van Tpassief (A) en Tactief (B). Passieve spanning en actieve spanning werden berekend in een enkele cardiomyocyte met een sarcomere lengte van 1,8 μm tot 2,3 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Representatieve resultaten voor cardiomyocyten die mechanisch zijn geïsoleerd van verse ("Verse") en bevroren myocardmonsters ("Frozen") en van collagenase verteerd hart (gemodificeerde Langgendorf-techniek) met achterste permeabilisatie met Triton ("Collag+Triton"). Waarden van (A) Totale spanning, (B) Actieve spanning en (C) Pasisve Spanning van cardiomyocyten geactiveerd met pCa 4.5-oplossing met een sarcomerelengte van ≈2,2 μm. (D) Calciumgevoeligheidscurve en de respectieve waarden voor (E) pCa50 en (F) nHill. (G) Restkracht en (H) ktr-waarden berekend op maximale activeringsoplossing (pCa 4.5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.
| Store bij | Voorraadoplossingen | [M] | Eindvolume (mL) | Gewicht/volume | Notities |
| 4°C | Kaliumhydroxide (KOH) | 1 | 100 | 5.611 g | De pH aanpassen |
| 4°C | Kaliumhydroxide (KOH) | 5 | 50 | 14,03 g | De pH aanpassen |
| 4°C | BES | 1 | 50 | 10,66 g | |
| 4°C | Propionzuur | 1 | 100 | 7.483 mL | Pas de pH aan op 7,0 met 5M of 1M KOH |
| 4°C | CaEGTA bestaat uit: | 0.1 | 100 | Meng en verwarm de oplossing langer dan 1 uur tot 60°C. Pas de pH aan op 5-6 met 1M KOH. | |
| - CaCO3 | 0.1 | 1,001 g | |||
| - Titriplex (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
Tabel 1: Instructies voor de voorbereiding van de voorraadoplossing.
| RELAX-ISO (voor het isolement van cardiomyocyten) | [mM] | Gewicht |
| Na2ATP | 5.95 | 3,28 g |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1,23 g |
| Tritiplex (EGTA) | 2 | 0,76 g |
| Kcl | 139.6 | 10,41 g |
| Imidazool | 10 | 0,68 g |
Tabel 2: Instructies voor de voorbereiding van de Relax-ISO-oplossing.
| Activerende oplossing (voor de metingen) | [mM] | Gewicht /volume |
| Na2ATP | 5.97 | 0,823 g |
| MgCl 1M | 6.28 | 1,57 mL |
| Propionzuur | 40.64 | 10,16 mL |
| BES | 100 | 25 mL |
| CaEGTA (voorraadoplossing eerder voorbereid) | 7 | 17,5 mL |
| Na2PCr | 14.5 | 0,925 g |
Tabel 3: Instructies voor het activeren van de voorbereiding van de oplossing.
| Ontspannende oplossing (voor de metingen) | [mM] | Gewicht /volume |
| Na2ATP | 5.89 | 0,325 g |
| MgCl 1M | 6.48 | 0,65 mL |
| Propionzuur | 40.76 | 4,08 mL |
| BES | 100 | 10 mL |
| Titriplex (EGTA) | 6.97 | 0,265 g |
| Na2PCr | 14.5 | 0,370 g |
Tabel 4: Instructies voor het ontspannen van de oplossing voorbereiding.
| pCa = -Log [Ca2+] | Ontspannen (pCa=9.0) Ml |
Ativating (pCa=4.5) Ml |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
Tabel 5: Instructies voor de voorbereiding van pCa-oplossingen.
| Parameter | Knaagdier | Varken | Menselijke |
| Actieve spanning, kN.m-2 (bij 2,2 μm) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| Passieve spanning, kN.m-2 (bij 2,2 μm) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| nHill nHill | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
Tabel 6: Typische parameters en indexen afgeleid van enkele permeabiliseerde cardiomyocyten van knaagdieren, varkens en mensen. Aangepast vanaf12.
| Probleem | Mogelijke reden | Oplossing |
| De cardiomyocyt ontkoppelt tijdens maximale activering | Onvoldoende lijmtijd; De lijm is oud en is gedroogd | Verhoog de tijd van de lijmstap; overwegen om een nieuwe lijmbuis te openen. |
| Er zit Triton® in de celsuspensieoplossing, die niet meer kan worden verwijderd | Herhaal de extractieprocedure met een of twee extra Triton® stappen uitwassen | |
| De cardiomyocyte heeft een lage kracht onder controleomstandigheden | De extractie ging mis en leverde cellen van lage kwaliteit | Verhoog de steekproefgrootte en doe een nieuwe extractie. Als het probleem blijft bestaan is waarschijnlijk te wijten aan onjuiste monsterverzameling - gooi dit monster |
| De cel is zichtbaar aanbestedende, maar er wordt geen kracht geregistreerd; De cel heeft ongebruikelijke krachtwaarden | De krachttransducer is uitgeschakeld | Inschakelen |
| De krachttransducer is niet goed gekalibreerd | Kalibreer de krachttransducer met behulp van een set bekende gewichten (controleer de handleiding van de fabrikant). | |
| De krachttransducer naald is los | Lijm de naald opnieuw met behulp van kristal binding 509 of juweliers wax. | |
| Het strepenpatroon is niet goed genoeg om de sarcomerelengte te bepalen | Onvoldoende licht | Verhoog het microscooplicht of verplaats de cel terug naar de coverslip en beoordeel de sarcomerelengte opnieuw (de putten hebben een lagere lichtintensiteit) |
| De extractie ging mis en leverde cellen van lage kwaliteit | Verhoog de steekproefgrootte en doe een nieuwe extractie | |
| De tips van naalden bevinden zich niet in hetzelfde vlak | Met behulp van micromanipulatoren, pas de naalden 'tips omhoog of omlaag tot het vinden van een gerichte sarcomeres | |
| Geen lengte- en/of krachtvariatie tijdens de overname | De motor of de krachttransducer zijn uitgeschakeld | Zet ze aan |
| De motor is kapot en produceert geen celverkorting | Vervang het of probeer het te kalibreren met behulp van een functiegenerator | |
| Te veel ruis op de acquisitie-opnames | Te veel luchtstroom rond de apparatuur | Bescherm de apparatuur tegen de directe luchtstroom |
| Te veel trillingen rond de apparatuur | Een stabilisatietafel is aan te raden. Zelfs dan is het raadzaam om alle apparatuur die een compressor zou kunnen hebben of trillingen (vriezer, koelkasten) te verwijderen | |
| Ca2+-gevoeligheidscurve heeft vreemde waarden en de krachtwaarden nemen niet toe met [Ca2+]. | Het mengsel van activerende en ontspannende oplossing was niet goed gedaan (controleer 3.10 tot 3.14 van de methodesectie, misschien wegens ontoereikend mengen) | Ontdooi de flesjes met dezelfde concentratie, verzamel alle flacon's inhoud in dezelfde beker, meng met een roerder en verdeel ze opnieuw. Test deze oplossingen opnieuw in een nieuwe cel. Als dit het probleem oplost, bereid dan een nieuwe batch Ca2+-met oplossingen |
Tabel 7: Tabel probleemoplossing.
Discussion
In vitro beoordeling van de hartfunctie met behulp van gevilde cardiomyocyten is een belangrijke techniek om de wijzigingen die zich op cardiomyocytenniveau in fysiologische (bijvoorbeeld stretch) en pathologische context (bijvoorbeeld ischemie) voordoen, te verduidelijken. Deze methode heeft verschillende voordelen, zoals het vereisen van een minimale hoeveelheid myocardium om de functie in cardiomyocyten verkregen uit ontdooide monsters te beoordelen; met behulp van cardiomyocyten van een breed scala aan soorten (muizen13, rat1,14,15, konijn16, varken17, hond18, cavia19 en menselijke20) en verschillende hartlocaties, waaronder de atria, linker en rechter ventrikels of een specifieke regio van het infarct hart. Bovendien maakt deze techniek het mogelijk om specifieke concentraties van Ca2+ en energie (ATP) te leveren terwijl de functie van regelgevende en contractiele structuren in hun eigen configuratie wordt gemeten.
Ondanks de eenvoud van deze techniek, zijn er enkele kritische stappen. Het is essentieel om de kwaliteit van elke stap vanaf het begin te garanderen, inclusief het verzamelen van monsters. Myofilament eiwitten zijn gevoelig voor proteases21. Zo is het verplicht om monsters onmiddellijk na de inzameling in vloeibare stikstof op te slaan. Verse monsters, die niet eerder bevroren waren, zullen aanzienlijk hogere krachten ontwikkelen, dus het is niet raadzaam om metingen in verse en bevroren monsters in hetzelfde protocol te mengen. De tweede meest kritieke stap is de extractie van de cardiomyocyten. Tijdens deze procedure is het meestal van cruciaal belang om het monster op ijs te houden. Een proteaseremmercocktail kan worden gebruikt om het risico op eiwitdegradatie tijdens de extractie/permeabilisatie te verminderen22. Ten derde, monsters moeten worden gesneden in kleinere stukken met behulp van nauwkeurige scalpel bewegingen, omdat we opgemerkt verminderde kwaliteit cardiomyocyten wanneer deze stap werd genegeerd. Een andere kritieke stap is het wassen van de cardiomyocyten omdat het moeilijk is om de juiste balans tussen het uitwassen van Triton (permeabiliseert de cel, maar bevordert de ungluing) en het houden van zo veel cellen in de supernatant mogelijk. Het is belangrijk om eerst de extractie en het aantal washouts voor elk monster, soort of protocol te proberen. Bijvoorbeeld, in onze handen, merkten we op dat ZSF1 zwaarlijvige rattenweefsel extracties hebben een "vet" aspect, waardoor deze cellen meer glad tijdens het lijmen, maar niet moeilijker te meten. De manier waarop we dit probleem omzeilen was door meer experimenten uit te voeren om een redelijk aantal cellen per dier te hebben. Bovendien is het cruciaal om een goede cel te selecteren om te lijmen, namelijk met een goede striatie en redelijke lengte. Als de cardiomyocyte deze functies niet heeft, zal het meestal loskomen van de naaldtips of geen/lage kracht ontwikkelen. Het is ook belangrijk om de juiste lijm te gebruiken voor cardiomyocyte gehechtheid, gezien de tijd van lijmen en de werkzaamheid ervan om de cel aan de naald te lijmen. In onze handen geneest de siliconenlijm(Table of Materials)snel (10-15 min) en sterk genoeg. Ten slotte is de laatste kritieke stap gerelateerd aan het zorgvuldig opheffen van de cardiomyocyte 5 min na het lijmen van de cel (om te voorkomen dat de cel aan de coverslip wordt gelijmd) en voordat u deze naar de putten verplaatst (om te voorkomen dat de cel door de microscoopfase wordt gesleept). Tabel 7 geeft een overzicht van de probleemoplossing in verband met deze techniek, de onderliggende oorzaken en mogelijke oplossingen om veelvoorkomende problemen op te lossen.
De belangrijkste beperking van deze methode is dat het niet alle vragen met betrekking tot de myofilament contractility kan beantwoorden, zoals hoe snel de myofilaments activeren/deactiveren. In de in vivo-instelling moeten membraandepolarisatie, intracellulaire Ca2+ toename en de verspreiding ervan naar myofilamenten optreden voor de myocyten om samen te trekken, terwijl in gevilde cardiomyocyten Ca2+ diffusie naar myofilaments onmiddellijk optreedt wanneer de cel wordt ondergedompeld in de Ca2+ oplossing. Deze snellere snelheid van Ca2 + diffusie zal bias myofilaments activering / deactivering analyse23.
Deze experimenten worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de temperatuur, oplossing pH, mechanische verstoring (slack-re-stretch vs slack) en cel bevestiging procedures (pin tie vs lijm), al deze variabelen goed voor literatuur discrepanties in termen van ktr en de sarcomere lengte-afhankelijke toename van kracht4,12.
Toekomstige vooruitgang van de techniek omvat het uitvoeren van functionele studies in intacte in plaats van permeabilized cardiomyocyten. Deze techniek heeft als nadeel van een beroep op cardiomyocyten vers geïsoleerd (niet eerder bevroren). Een andere belangrijke kwestie die niet rechtstreeks verband houdt met deze methode, maar die een aanzienlijke invloed kan hebben, heeft betrekking op de maximale periode van monstergevroren opslag. In het bijzonder is het verplicht om de mate van myofilament afbraak vast te stellen gedurende de opslagtijd (dat wil zeggen, voor hoe lang bevroren monsters kunnen worden opgeslagen om te zorgen voor een goede kwaliteit functionele gegevens afgeleid van de geëxtraheerde cardiomyocyten).
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict.
Acknowledgments
De auteurs danken Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), Europese Unie, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) en Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) voor de financiering van UnIC (UID/IC/00051/2013) onderzoekseenheid. Dit project wordt ondersteund door FEDER via COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), het project DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), ondersteund door het regionale operationele programma van Norte Portugal (NORTE 2020), in het kader van de partnerschapsovereenkomst van Portugal 2020, via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), het project NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), ondersteund door Europese structuur- en investeringsfondsen, het regionale operationele programma van Lissabon 2020. Patrícia Rodrigues werd gefinancierd door FCT (SFRH/BD/96026/2013) en João Almeida-Coelho was van Universidade do Porto/FMUP en FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
- Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
- Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
- Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
- van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
- Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
- Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
- Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
- Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
- Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
- Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
- Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
- van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
- Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
- Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
- Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
- Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
- Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
- Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P.
