Summary
Vorgestellt wird eine komfortable, schnelle und kostengünstige Methode zur Messung des Anteils von Seitenpopulationszellen in soliden Tumorzelllinien.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) sind eine wichtige Ursache für Tumorwachstum, Metastasierung und Rezidiv. Die Isolierung und Identifizierung von CSCs sind für die Tumorforschung von großer Bedeutung. Derzeit werden verschiedene Techniken zur Identifizierung und Reinigung von CSCs aus Tumorgeweben und Tumorzelllinien eingesetzt. Die Trennung und Analyse von Side Population (SP)-Zellen sind zwei der am häufigsten verwendeten Methoden. Die Methoden basieren auf der Fähigkeit von CSCs, fluoreszierende Farbstoffe wie Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss des Farbstoffs ist mit den ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC) assoziiert und kann durch ABC-Transporter-Inhibitoren gehemmt werden. Es werden Methoden zur Färbung kultivierter Tumorzellen mit Hoechst 33342 und zur Analyse des Anteils ihrer SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie beschrieben. Dieser Assay ist bequem, schnell und kostengünstig. Die in diesem Assay generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wirkung von Genen oder anderen extrazellulären und intrazellulären Signalen auf die Stammeigenschaften von Tumorzellen beitragen.
Introduction
Krebsstammzellen (CSCs) sind Untergruppen von Zellen mit Selbsterneuerungsfähigkeit und multiplem Differenzierungspotenzial, die eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum, der Metastasierung und dem Wiederauftreten spielen1,2. Derzeit wurden CSCs in einer Vielzahl von bösartigen Tumoren identifiziert, einschließlich Lungen-, Gehirn-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata-, Brust- und Leberkrebs3,4,5, 6,7,8,9. Die Identifizierung von CSCs in diesen Tumoren basiert hauptsächlich auf dem Vorhandensein von Oberflächenmarkerproteinen, wie z. B. hoher und / oder niedriger Expression von CD44, CD24, CD133 und Sca-19,10, aber ein einzigartiger Marker, der CSCs von Nicht-CSCs unterscheiden kann, wurde bisher nicht berichtet. Derzeit werden verschiedene Techniken verwendet, um CSCs in Tumorgewebe oder Tumorzelllinien zu identifizieren und zu reinigen. Diese Techniken basieren auf den spezifischen Eigenschaften von CSCs. Unter ihnen sind Assays und Sortierung von Side Population (SP) Zellen zwei der am häufigsten verwendeten Methoden.
SP-Zellen wurden ursprünglich von Goodell et al.11entdeckt, als sie hämatopoetische Stammzellen in Knochenmarkzellen von Mäusen charakterisierten. Als die Knochenmarkzellen der Maus mit dem fluoreszierenden Farbstoff Hoechst 33342 markiert wurden, erschien eine kleine Gruppe von Hoechst 33342 schwach gefärbten Zellen im zweidimensionalen Punktdiagramm eines Durchflusszytometrie-Assays. Hoechst 33342 ist ein DNA-bindender Farbstoff und hat mindestens zwei Bindungsmodi, die zu unterschiedlichen spektralen Eigenschaften führen. Bei gleichzeitiger Betrachtung der Fluoreszenzemission bei zwei Wellenlängen können mehrere Populationen aufgedeckt werden12. In ihrem Assay wurde der Hoechst 33342 bei 350 nm angeregt und die Fluoreszenz mit dem 450/20 nm Bandpassfilter (BP) und dem 675 nm Kantenfilter Long-Pass (EFLP)11gemessen. Im Vergleich zur gesamten Population von Knochenmarkzellen wurde diese Gruppe von Zellen mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert, die SP-Zellen genannt werden11. SP-Zellen sind in der Lage, Hoechst 33342 schnell auszustoßen. Der Ausfluss dieses Farbstoffs ist mit ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC)13verwandt, die durch einige Mittel wie FumitremorginC14,Verapamil und Reserpin15,16gehemmt werden können. Danach wurden unterschiedliche Anteile von SP-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, Organen, Tumorgeweben und Tumorzelllinien17,18,19nachgewiesen. Diese SP-Zellen haben viele Eigenschaften von Stammzellen17,19.
Dieses Manuskript beschreibt die Hoechst 33342-Markierung und Färbung von kultivierten Tumorzellen und die Analyse von SP-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden die Optimierung der Hoechst 33342-Konzentration und die richtige Blockerauswahl für eine bestimmte Tumorzelllinie mit diesem Ansatz gezeigt. Abschließend werden die Auswirkungen von Stängelförder- oder Hemmungssignalen auf den Sp-Anteil in Tumorzellen nachgewiesen. Die experimentellen Beispiele zeigen, dass die Analyse von SP verwendet werden kann, um die Auswirkungen verschiedener Signale wie Genexpression, kleine Inhibitoren, Aktivatoren, Zytokine und Chemokine auf die Tumorstammhaftigkeit zu untersuchen. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Isolierung und Reinigung von CSCs, wie z. B. Sortierung von CD44+/ CD24- Population, Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Analyse und Tumorsphärenbildungsassays, ist diese Methode einfacher zu manipulieren und kostengünstig.
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Protocol
1. Zellvorbereitung
- Zellverdauung und Neutralisation
- Samen Sie Tumorzellen (wie MDA-MB-231-Zellen) in einer 6-Well-Platte und kulturieren Sie sie in einem 37 °C-Inkubator, der mit 5% CO2versorgt wird.
- Ernten Sie Zellen, wenn ihre Dichte etwa 90% erreicht. Das Kulturmedium gründlich absaugen und die Zellen 2x mit 3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
HINWEIS: Um die Auswirkungen von Signalweginhibitoren (z. B. FRA1-Inhibitor) oder Aktivatoren (z. B. STAT3-Aktivator) auf die Stammmerkmale von Tumorzellen zu untersuchen, werden Tumorzellen in einer 6-Well-Platte ausgesät und vor der Ernte für eine bestimmte Zeit mit Inhibitoren oder Aktivatoren vorbehandelt. - Fügen Sie 500 μL 0,25% Trypsin-EDTA zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, legen Sie die Platte für 1-3 Minuten (min) in einen Inkubator bei 37 °C und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen.
HINWEIS: Eine längere Verdauung wirkt sich auf das SP-Profil aufgrund von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit aus. - Fügen Sie 3 ml PBS, ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum (FBS), zu jeder Vertiefung der 6-Well-Platte hinzu, um die Verdauung zu beenden, und pipetieren Sie die Zellen sanft 3-5x auf und ab, um die Zellklumpen zu dispergieren.
- Fügen Sie 0,5 ml Zellsuspension zu einer Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte hinzu und untersuchen Sie sie unter einem Mikroskop. Wenn Zellklumpen beobachtet werden, leiten Sie die Zellsuspension durch ein 70 μM Zellsieb.
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt. - Die Zellen werden in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min zu Pelletzellen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 3 ml PBS, ergänzt mit 2% FBS. Pipetetten Sie die Zellen 3-5x auf und ab, um sie gründlich zu mischen.
- Anzahl der Zellen
- 50 μL der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 50 μL trypanblauer Lösung mischen. Pipetten Sie 10 μL der Mischung, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einer Standardmethode wie einem Hämozytometer zu zählen.
- Verdünnen Sie die Zellen in PBS, ergänzt mit 2% FBS, auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml. 1 ml der Zellsuspension in ein 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzglas geben und zwei Probenröhrchen vorbereiten.
2. Zellfärbung mit Hoechst 33342
- Hoechst 33342 in ein Röhrchen geben, um eine entsprechende Endkonzentration zu erreichen.
HINWEIS: Beispielsweise beträgt die geeignete Konzentration von Hoechst 33342 3 μg/ml für MDA-MB-231-Zellen. - Fügen Sie einen Blocker (z. B. Fumitremorgin C, Verapamil oder Reserpin) in ein anderes Röhrchen in einer geeigneten Endkonzentration ein und inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C für 30 minuten, bevor Sie die gleiche Konzentration von Hoechst 33342 wie in Schritt 2.1 beschrieben hinzufügen.
HINWEIS: Für MDA-MB-231-Zellen ist der geeignete Blocker Reserpine (40 μM). Reserpine wird als blockierendes Steuerelement verwendet, um das Fehlen von Zellen im geschlossenen SP-Bereich zu überprüfen. - Bereiten Sie mehrere Röhrchen mit Zellen vor und fügen Sie Hoechst 33342 verschiedenen Konzentrationsgradienten hinzu. Wählen Sie nach einem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Profil und dem Anteil des SP.
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration von Hoechst 33342 zu definieren. - Mehrere Röhrchen mit Zellen vorbereiten, den Blocker verschiedenen Konzentrationsgradienten zuordnen, die Röhrchen 30 min lang bei 37 °C inkubieren und dann Hoechst 33342 in einer entsprechenden Konzentration hinzufügen. Wählen Sie nach dem Durchflusszytometrie-Assay die richtige Konzentration entsprechend dem Fehlen von Zellen im gated SP-Bereich.
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, um die richtige Konzentration des Blockers zu definieren. - Legen Sie die Röhrchen in einen 37 °C-Inkubator und inkubieren Sie sie für 60 Minuten, wobei die Röhrchen alle 10 Minuten geschüttelt werden.
HINWEIS: Das gründliche Schütteln von Röhrchen ist wichtig für die Färbung, da es einen vollständigen Kontakt zwischen den Zellen und dem Farbstoff für bessere Färbeergebnisse gewährleistet. - Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g,4 °C für 5 min und saugen den Überstand vorsichtig an, da die Zellen sehr lose und instabile Pellets bilden.
- Resuspend Zellen jeder Röhre in 1 ml eiskaltem PBS, ergänzt mit 2% FBS und Pipette die Zellen 3-5x auf und ab pipetten, um gründlich zu mischen. Fügen Sie 1 μL 1 mg / ml Propidiiumiodid (PI) zur Suspension jedes Röhrchens hinzu, um tote Zellen zu identifizieren.
HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Schritt sollten bei 4 °C durchgeführt werden, um den Ausfluss von Hoechst 33342 aus den Tumorzellen zu hemmen. Die Röhren sollten vor direkter Lichteinwirkung geschützt werden.
3. Analyse mittels Durchflusszytometrie
HINWEIS: Anweisungen zur Verwendung der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 1–10beschrieben.
- Klicken Sie in der Durchflusszytometer-Software auf die Schaltfläche ORDNER. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment und dann auf Neues Experiment ( Ergänzende Abbildung1A,B).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche OK. "Experiment_001" wird unter dem FOLDER angezeigt (Ergänzende Abbildung 2A,B).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment_001, um den Ordnernamen in einen bestimmten Namen zu ändern (z. B. "20191118-SP"). Klicken Sie auf Enter. Der neue Name ("20191118-SP") wird unter FOLDER (Ergänzende Abbildung 3A, B )angezeigt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem neuen Experimentordner ("20191118-SP") eine Probe hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Tube, um der Probe eine Tube hinzuzufügen. Klicken Sie auf die Pfeilspitzenschaltfläche (Ergänzende Abbildung 4A-C).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter und richten Sie die Parameter des Durchflusszytometers ein (Ergänzende Abbildung 5).
- Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegelkurzepass (DMSP) von 610 nm, um die Emissionswellenlängen zu trennen. Verwenden Sie einen 450/20 nm BP-Filter, um die blaue Fluoreszenz zu sammeln, und einen 675 nm EFLP, um die rote Fluoreszenz zu sammeln.
HINWEIS: Hoechst 33342 wird mit einem UV-Laser bei 355 nm und PI bei 488 nm angeregt.
- Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegelkurzepass (DMSP) von 610 nm, um die Emissionswellenlängen zu trennen. Verwenden Sie einen 450/20 nm BP-Filter, um die blaue Fluoreszenz zu sammeln, und einen 675 nm EFLP, um die rote Fluoreszenz zu sammeln.
- Führen Sie die Zellproben auf dem Durchflusszytometer aus.
HINWEIS: SP-Zellen können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter sterilen Bedingungen sortiert werden. Insgesamt sollten 100.000–500.000 Zellen für die Folgeexperimente gesammelt werden.- Führen Sie mit Hoechst 33342 gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.
- Legen Sie Röhrchen mit mit Hoechst 33342 gefärbten Zellen auf das Zytometer.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie dann auf die X-Achse und legen Sie sie auf "FSC-A" fest. Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm des Vorwärtsstreupulsbereichs (FSC-A, X-Achse auf linearen Modus eingestellt) im Vergleich zur PI-Fluoreszenz (Y-Achse auf logarithmische Skala eingestellt) an. Passen Sie die Spannungen so an, dass die lebenden Zellen auf der rechten Seite und die nicht lebenden Zellen, die hell mit PI gefärbt sind, in der oberen linken Ecke angezeigt werden. Richten Sie dann ein Polygon-Gate ein, um tote Zellen und Zelltrümmer auszuschließen (Abbildung 1A), indem Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate klicken, um die P1-Teilmenge, auch bekannt als FSC-A, PI-A-Teilmenge, zu gaten (Ergänzende Abbildung 6A,B).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm von FSC-A (X-Achse) im Vergleich zur Vorwärtsstreuimpulsbreite (FSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P1 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zum Gate der P2-Teilmenge (auch als FSC-A, FSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu erstellen. Dadurch werden Zellen mit großen Volumina ausgeschlossen (Ergänzende Abbildung 7A-C und Abbildung 1A).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Zeigen Sie das Punktdiagramm des seitlichen Streuimpulsbereichs (SSC-A, X-Achse) im Vergleich zur seitlichen Streuimpulsbreite (SSC-W, Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie unter Der Schaltfläche Populationen anzeigen auf die Schaltfläche P2. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zu erstellen, um die P3-Teilmenge (auch als SSC-A, SSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu unterteilen. Dadurch erhält man eine Zellpopulation mit einheitlicher Granularität (Ergänzende Abbildung 8A-C und Abbildung 1A).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Zeigen Sie das Punktdiagramm von Hoechst Red-A (X-Achse) und Hoechst Blue-A (Y-Achse) an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche P3 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate, um ein Polygon-Gate für die P4-Teilmenge (auch bekannt als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-Teilmenge) zu erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie auf die Schaltfläche Bevölkerungshierarchie anzeigen, um die Populationshierarchie anzuzeigen.
HINWEIS: Das Punktdiagramm zeigt drei verschiedene Populationen: 1) eine G0-G1-Phasenpopulation in der Nähe der Mitte des Diagramms; 2) eine S-G2/M-Phasenpopulation in der Nähe der oberen rechten Ecke; 3) die SP. Der SP wird dann für weitere Analysen eingezäunt (Ergänzende Abbildung 9A-D und Abbildung 1A). Wenn das Punktdiagramm von Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A kein SP-Profil ähnlich dem in Abbildung 1Azeigt, sollten die Spannungen angepasst werden, bis ein ähnliches Profil zu sehen ist. Passen Sie in der Zwischenzeit alle oben genannten Tore entsprechend an. - Nachdem Sie den Gate-Bereich der SP-Zellen bestimmt haben, klicken Sie auf Daten erfassen, um 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe zu sammeln, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren (Ergänzende Abbildung 10).
- Führen Sie die mit Blocker behandelten Hoechst 33342-gefärbten Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.
- Legen Sie Röhren mit Blocker auf das Zytometer und führen Sie Zellen mit den gleichen Spannungen und Gattern aus, um weiter zu überprüfen, ob die Spannungen und Gatter entsprechend ausgewählt sind.
HINWEIS: Im Vergleich zur Hoechst 33342-Färbung allein sollte nur ein sehr kleiner Teil der Zellen, falls vorhanden, im geschlossenen Bereich des SP erscheinen (Abbildung 1B). - Sammeln Sie 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Probe, um den Prozentsatz der SP-Zellen zu analysieren.
- Legen Sie Röhren mit Blocker auf das Zytometer und führen Sie Zellen mit den gleichen Spannungen und Gattern aus, um weiter zu überprüfen, ob die Spannungen und Gatter entsprechend ausgewählt sind.
- Führen Sie mit Hoechst 33342 gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer aus.
4. Datenanalyse
HINWEIS: Anweisungen für die Verwendung der Durchflusszytometrie-Analysesoftware (siehe Materialtabelle)sind in diesem Abschnitt und den ergänzenden Abbildungen 11–16 beschrieben.
- Kopieren Sie die Dateien im fcs-Format auf einen Computer, öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und ziehen Sie eine Beispieldatei in die Software (Ergänzende Abbildung 11A,B).
- Gate-Zellen und erhalten Sie den Prozentsatz der SP-Zellen.
- Doppelklicken Sie auf diese Beispieldatei,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die FSC-A, PI-A-Teilmenge abzulegen (Ergänzende Abbildung 12A-E).
- Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, PI-A,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge FSC-A, FSC-W abzulegen (Ergänzende Abbildung 13A-E).
- Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, FSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". Erstellen Sie dann ein rechteckiges Tor und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge SSC-A, SSC-W zu erhalten (Ergänzende Abbildung 14A-E).
- Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W,klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". Erstellen Sie dann ein Polygon-Gate und klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A abzulegen (Ergänzende Abbildung 15A-E).
- Öffnen Sie den Layout-Editor, indem Sie auf die Schaltfläche Layout-Editor öffnen klicken. Ziehen Sie die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W in den Layout-Editor, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Klicken, um das Fenster Layout in Datei zu speichern, um die Bildergebnisse zu speichern (Ergänzende Abbildung 16A-C).
- Speichern Sie den Arbeitsbereich, um die Gating-Informationen beim Schließen der Software beizubehalten.
- Führen Sie T-Test-Analysen mit statistischer Analysesoftware durch, um den Unterschied zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert.
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Representative Results
Vier experimentelle SP-Analysen wurden nach dieser Methode durchgeführt. In der ersten haben wir den Anteil der SP-Zellen in MDA-MB-231, einer dreifach negativen menschlichen Brustkrebszelllinie, unter normalen Bedingungen nachgewiesen. Nach der Zellzählung wurde Hoechst 33342 in ein Röhrchen mit 1 x 106 Zellen in einer Endkonzentration von 3 μg/ml gegeben. Reserpin und Hoechst 33342 wurden einem anderen Röhrchen in Endkonzentrationen von 40 μM bzw. 3 μg/ml zugesetzt. PI wurde zu beiden Röhren hinzugefügt. Das Punktdiagramm von FSC-A (X-Achse) versus PI-A (Y-Achse) zeigte drei Populationen: 1) eine PI-positive Zellpopulation, die die toten Zellen darstellte; 2) Zelltrümmer; und 3) die Hauptpopulation waren PI-negative Zellen, die einer weiteren Analyse unterzogen wurden (Abbildung 1A,B). Eine Einzelzellpopulation, die aus dem Punktdiagramm von FSC-A (X-Achse) versus FSC-W (Y-Achse) und dem Punktdiagramm von SSC-A (X-Achse) versus SSC-W (Y-Achse) gated ist, wurde verwendet, um den Anteil der SP-Zellen zu analysieren (Abbildung 1A,B). Die SP-Zellen wurden aus dem Punktdiagramm von Hoechst Red-A (X-Achse) versus Hoechst Blue-A (Y-Achse) abgeblendet, und ihr Prozentsatz betrug etwa 0,9% in MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 1A). Reserpine verringerte jedoch den Anteil der SP-Zellen stark (Abbildung 1B), was darauf zurückging, dass die Gate-Malerei für SP korrekt ist.
Das zweite Experiment bestand darin, die geeignete Färbekonzentration von Hoechst 33342 in MDA-MB-435-Zellen zu bestimmen. Nach der Zellzählung wurde Hoechst 33342 zu 1 x 106 Zellen, die in 1 ml PBS, ergänzt mit 2% FBS, suspendiert wurden, zu verschiedenen Konzentrationsgradienten hinzugefügt, einschließlich 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 und 4 μg/ml. Wie in Abbildung 2Agezeigt, war es bei zu niedriger Konzentration von Hoechst 33342 (d. h. 0,5, 1, 1,5 μg/ml) schwierig, SP-Zellen von anderen Zellpopulationen zu unterscheiden, da sich viele Zellen in einem schwach gefärbten Zustand befanden. Wenn die Konzentration von Hoechst 33342 zu hoch war (d.h. 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml), nahm der Anteil der SP-Zellen ab, bis er verschwand. Somit war 2 μg/ml Hoechst 33342 die beste Konzentration für die SP-Analyse in MDA-MB-435-Zellen. Um den richtigen Blocker für diese Zelllinie zu bestimmen, wurden Hoechst 33342 und ein Blocker (Verapamil oder Reserpin) zu 1 x 106 Zellen, die in 1 ml PBS, ergänzt mit 2% FBS, suspendiert wurden, zu Endkonzentrationen von 2 μg/ml bzw. 40 μM versetzt. Wie in Abbildung 2Bgezeigt, haben etwa 0,4% der Zellen den Farbstoff nach der Behandlung mit Verapamil ausgestoßen. Nach der Reserpin-Behandlung sank das Verhältnis jedoch auf etwa 0,1% (Abbildung 2C). Aus diesem Experiment wurde Reserpin als geeigneterer Blocker für diese Zelllinie angesehen.
Im dritten Beispiel wurden A549-Zellen (humane Lungenadenokarzinomzellen) 48 Stunden (h) mit STAT3-Aktivator-Colivelin20 (100 nM) vorbehandelt. Der STAT3-Signalweg ist wichtig für die Förderung der Stammeigenschaften von Tumorzellen21. Wie in Abbildung 3gezeigt, nahm der Anteil der SP-Zellen bei Colivelin-Stimulation zu.
Im letzten Beispiel wurden T47D-Zellen (menschliche Brustkrebszellen) mit 0,1 μM FRA1-Inhibitor-SKLB816 (auch 13an genannt) für 48 h22vorbehandelt. FRA1 ist ein berichteter Gatekeeper des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT) und an der Regulation der Tumorstammheit beteiligt23. Wie in Abbildung 4gezeigt, nahm der Anteil der SP-Zellen aufgrund der Behandlung des FRA1-Inhibitors ab.
Abbildung 1: Gating-Strategie von MDA-MB-231-Zellen in der SP-Analyse. (A) Gating-Strategie von MDA-MB-231-Zellen, die mit Hoechst 33342 (3 μg/ml) und Propidiniodid (PI, 1 μg/ml) gefärbt wurden. (B) Gating-Strategie von MDA-MB-231-Zellen, die mit Reserpin (40 μM) behandelt und mit Hoechst 33342 (3 μg/ml) und PI (1 μg/ml) angefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optimierung der Hoechst 33342 Konzentration und Selektion des Blockers in MDA-MB-435 Zellen. (A) Die SP-Analyseergebnisse von MDA-MB-435-Zellen, die mit Hoechst 33342 (Hoechst) bei unterschiedlichen Konzentrationsgradienten (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/ml) zusammen mit PI (1 μg/ml) gefärbt wurden. (B) Das SP-Analyseergebnis von MDA-MB-435-Zellen, die mit Verapamil (40 μM) behandelt und mit Hoechst 33342 (2 μg/ml) und PI (1 μg/ml) angefärbt wurden. (C) Das SP-Analyseergebnis von MDA-MB-435-Zellen, die mit Reserpin (40 μM) behandelt und mit Hoechst 33342 (2 μg/ml) und PI (1 μg/ml) gefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der Anteil der SP-Zellen wurde durch DEN STAT3-Aktivator in A549-Zellen erhöht. (A) Die SP-Analyseergebnisse von A549-Zellen, die mit STAT3-Aktivator-Colivelin (100 nM) oder seiner Fahrzeugsteuerung (Strg)-H2O für 48 h vorbehandelt wurden. Als blockierende Kontrolle wurden A549-Zellen verwendet, die mit Reserpin (45 μM) behandelt wurden. A549-Zellen wurden mit Hoechst 33342 (7 μg/ml) und PI (1 μg/ml) gefärbt. (B) Die statistischen Ergebnisse des Anteils von SP-Zellen in A549-Zellen, die mit Colivelin (100 nM) behandelt wurden, und seiner Fahrzeugkontrolle. Die Daten werden als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt, n = 3 für jede Gruppe. "*" steht für P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Der Anteil der SP-Zellen wurde durch FRA1-Inhibitor in T47D-Zellen gehemmt. (A) Die SP-Analyseergebnisse von T47D-Zellen, die mit SKLB816 (0,1 μM) oder seiner Fahrzeugsteuerung (Strg)-DMSO für 48 h vorbehandelt wurden. Als Blockierungskontrolle wurden T47D-Zellen verwendet, die mit Reserpin (40 μM) behandelt wurden. T47D-Zellen wurden mit Hoechst 33342 (8 μg/ml) und PI (1 μg/ml) gefärbt. (B) Die statistischen Ergebnisse des Anteils von SP-Zellen in T47D-Zellen, die mit SKLB816 (0,1 μM) behandelt wurden, und seiner Fahrzeugkontrolle. Die Daten werden als Mittelwert + SEM dargestellt, n = 3 für jede Gruppe. "*" steht für P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Anleitung für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.1. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche ORDNER. (B) Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment und dann auf die Schaltfläche Neues Experiment. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Anleitung für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.2. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche OK. (B) Experiment_001 wird unter ORDNERangezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Anleitung für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.3. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment_001, um den Namen Experiment_001 in einen bestimmten Namen zu ändern (z. B. "20191118-SP"). (B) Klicken Sie auf die Schaltfläche Enter. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Anleitung für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.4. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Exemplar. (B) Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Tube. (C) Klicken Sie auf die Pfeilspitzenschaltfläche. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Anleitung für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.5. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Parameter, um die Parameter einzurichten. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 6: Anweisungen für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.6.1.2. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und stellen Sie sie auf "PI-A". (B) Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate, um ein Polygon-Gate für die P1-Teilmenge (auch bekannt als FSC-A, PI-A-Teilmenge) zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 7: Anweisungen für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.6.1.3. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und stellen Sie sie auf "FSC-A"ein. Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". (B) Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm und klicken Sie auf die Schaltfläche P1 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zu erstellen, um die P2-Teilmenge (auch als FSC-A, FSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu gateen. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 8: Anweisungen für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.6.1.4. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". (B) Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm und klicken Sie auf die Schaltfläche P2 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen . (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um ein rechteckiges Tor zum Tor der P3-Teilmenge (auch als SSC-A, SSC-W-Teilmenge bezeichnet) zu erstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 9: Anweisungen für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.6.1.5. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um das Punktdiagramm anzuzeigen, klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". (B) Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm und klicken Sie auf die Schaltfläche P3 unter der Schaltfläche Populationen anzeigen. (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygon-Gate, um ein Polygon-Gate zu erstellen, um die P4-Teilmenge (auch bekannt als Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-Teilmenge) zu gateen. (D) Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Bevölkerungshierarchie anzeigen, um die Populationshierarchie anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 10: Anweisungen für die Durchflusszytometer-Software Schritt Nummer 3.6.1.6. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten erfassen, und sammeln Sie dann 20.000 bis 100.000 Ereignisse aus jeder Stichprobe. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 11: Anleitung für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.1. (A) Öffnen Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und ziehen Sie eine Probendatei in die Software. (B) Die Beispieldatei wird importiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 12: Anleitung für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.2.1. (A) Doppelklicken Sie auf diese Beispieldatei. (B) Klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "PI-A". (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygontor erstellen, um ein Polygontor zu erstellen. (D) Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge FSC-A, PI-A abzustellen. (E) Die Teilmenge FSC-A, PI-A wird erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 13: Anweisungen für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.2.2. (A) Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, PI-A. (B) Klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "FSC-W". (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor erstellen, um ein rechteckiges Tor zuerstellen. (D) Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge FSC-A, FSC-W zuerhalten. (E) Die Teilmenge FSC-A, FSC-W wirdabgerufen. Klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 14: Anleitung für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.2.3. (A) Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei FSC-A, FSC-W. (B) Klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "SSC-W". (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor erstellen, um ein rechteckiges Tor zu erstellen. (D) Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge SSC-A, SSC-W aufzuholen. (E) Die Teilmenge SSC-A, SSC-W wird erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 15: Anleitung für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.2.4. (A) Doppelklicken Sie auf die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W. (B) Klicken Sie auf die X-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Red-A"; Klicken Sie auf die Y-Achse und setzen Sie sie auf "Hoechst Blue-A". (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Polygontor erstellen, um ein Polygontor zu erstellen. (D) Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um die Teilmenge Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A abzustellen. (E) Die Teilmenge Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A wird erhalten. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 16: Anleitung für die Durchflusszytometrie-Analysesoftware Schritt Nummer 4.2.5. (A) Klicken Sie auf die Schaltfläche Layout-Editor öffnen, um den Layout-Editor zu öffnen. (B) Ziehen Sie die Beispieldatei für die Teilmengendatei SSC-A, SSC-W in den Layout-Editor. (C) Klicken Sie auf die Schaltfläche Klicken Sie, um das Fenster Layout in Datei zu speichern, um die Bildergebnisse zu speichern. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Punkte, die für den SP-Assay zu beachten sind. Die erste ist die Auswahl eines geeigneten Blockers, wie Verapamil oder Reserpine, für jede Zelllinie, da die "Gate" -Position der SP-Zellen nach der Position bestimmt wird, an der eine große Anzahl von SP-Zellen nach der Zugabe des Blockers verschwindet. Für die Zelllinie MDA-MB-231 funktioniert Reserpine gut. Für andere Zelllinien könnten jedoch verschiedene Blocker besser funktionieren.
Die zweite ist die Konzentration von Hoechst 33342. Der Prozentsatz der SP-Zellen nahm zu, als die Färbekonzentration von Hoechst 33342 abnahm, wie die repräsentativen Daten zeigten. Dieses Phänomen kann durch die Farbstoffaufnahmekinetik24erklärt werden. Veränderungen der Farbstoffkonzentration beeinflussen die Anreicherung von Hoechst 33342 in Zellen. Daher steht die Hoechst 33342 Färbekonzentration in engem Zusammenhang mit den Ergebnissen des SP-Assays. Darüber hinaus variieren Aufnahme und Ausstoß von Hoechst 33342 zwischen den Zelltypen. Daher müssen die richtigen Konzentrationen von Hoechst 33342 für verschiedene Zelllinien vor der SP-Analyse untersucht werden.
Der dritte ist ein guter Variationskoeffizient (CV) des Durchflusszytometers, der auch für die SP-Analyse25kritisch ist. UV-Laserleistung ist ein wichtiges Kriterium für bessere Lebensläufe12. Dieses Protokoll verwendet ein kommerzielles Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle),um den SP-Assay durchzuführen. In diesem Küvetten-Durchflusszellen-Instrument haben wir den UV-Laser mit einer Leistung von 15 mW verwendet, um die besten Lebensläufe zu erhalten. Generell sorgt eine relativ hohe UV-Laserleistung für die optimalen Lebensläufe. Beispielsweise liefern 50–100 mW das optimale Hoechst-Signal auf Jet-in-Air-Instrumenten12. Einige Laser bieten eine geringere UV-Leistung, was Lebensläufe reduzieren kann. In diesen Fällen ist eine gute Laserausrichtung entscheidend.
Der letzte ist der Einfluss anderer Faktoren während des Experiments. Zellstatus, Temperatur, Zeitpunkt der Färbung, Betrieb der Durchflusszytometrie und andere Faktoren können auch den Anteil und die Qualität des SP-Assays beeinflussen. Zum Beispiel beeinflussen Veränderungen der Zelllebensfähigkeit während der Herstellung von Zellsuspensionen das Verhältnis von SP-Zellen. Daher müssen die besten experimentellen Bedingungen untersucht werden, bevor eine SP-Analyse durchführt wird. Unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren kann das SP-Verhältnis derselben Zelllinie, das von verschiedenen Labors gemessen wird, unterschiedlich sein. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Anteile von MDA-MB-231-Zellen und A549-Zellen ~0,1%–4,8%26,27,28,29 und ~0,8%–18%30,31,32,33,34bzw. betragen.
Forscher können diesen Assay für verschiedene Anwendungen modifizieren, z. B. für die Untersuchung anderer Tumorzelllinien oder primärer, vom Patienten abgeleiteter Tumorzellen. Wenn das Protokoll für die getesteten Zellen nicht gut funktioniert, können die Forscher MDA-MB-231-Zellen als Positivkontrolle verwenden und die Zellen gemäß den angegebenen Spezifikationen färben. Da dieses Protokoll sehr empfindlich auf die Konzentration von Hoechst 33342, Färbetemperatur und -zeit usw. reagiert, sollten die Forscher alle diese Bedingungen genau überprüfen. Der Prozentsatz des SP in vielen Arten von menschlichen Tumorzelllinien ist relativ niedrig (~ 0%–37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Wenn ein zu hoher oder niedriger Sp-Prozentsatz beobachtet wird, kann dies auf unangemessene Konzentrationen von Hoechst 33342 oder verwendetem Blocker zurückzuführen sein. Wenn das Problem mit dem Durchflusszytometer zusammenhängt, sollte technische Unterstützung in Anspruch gewonnen werden.
Obwohl die Verwendung von SP zur Analyse und Trennung von CSCs sehr effizient ist, hat sie immer noch bestimmte Einschränkungen. Die erste ist seine hohe Empfindlichkeit gegenüber Fleckenbedingungen12. Viele Faktoren, wie die Konzentration von Hoechst 33342, Zellstatus, Temperatur, Zeitpunkt der Färbung, Betrieb der Durchflusszytometrie und die Blockerauswahl, können die Qualität der SP-Analyse beeinflussen. Die zweite ist die zytotoxische Wirkung von Hoechst 33342. Hoechst 33342 ist ein DNA-bindender Farbstoff, ist aber toxisch für Zellen, wenn er hohe Konzentrationen erreicht und somit die Zellaktivität reduziert37.
Zusammenfassend ist die SP-Analyse eine der am häufigsten verwendeten Methoden der letzten Jahre, um CSCs in Tumorzelllinien zu identifizieren und zu reinigen. Obwohl die Methode einige Einschränkungen aufweist, ist sie in Ermangelung spezifischer CSCs-Oberflächenmarker immer noch eine Methode zur bequemen, schnellen und kostengünstigen Anreicherung von CSCs. Diese Methode ist vorteilhaft für die Untersuchung der biologischen Funktionen von CSCs und für die Identifizierung spezifischer Oberflächenmarker. Darüber hinaus kann es durch die Erkennung der Auswirkungen verschiedener Signale auf das SP-Verhältnis von Tumorzellen Hinweise auf die regulatorische Wirkung dieser Signalwege auf CSCs-Merkmale liefern und die Entdeckung neuer Mechanismen erleichtern, die letztendlich die gezielte Therapie von Tumoren leiten können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 und 81972787 finanziert; Naturwissenschaftliche Stiftung der Stadt Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten, Nankai University 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
