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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/60658
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3
1School of Medicine, Nankai University, 2Tianjin Key Laboratory of Tumour Microenvironment and Neurovascular Regulation, 3Collaborative Innovation Center for Biotherapy, Nankai University

Summary

Une méthode pratique, rapide, et rentable pour mesurer la proportion de cellules de population latérale dans les variétés de cellule pleines de tumeur est présentée.

Abstract

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une cause importante de croissance, de métastase, et de répétition de tumeur. L’isolement et l’identification de CSCs sont d’une grande importance pour la recherche de tumeur. Actuellement, plusieurs techniques sont utilisées pour l’identification et la purification des CSC à partir de tissus tumoraux et de lignées cellulaires tumorales. La séparation et l’analyse des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées. Les méthodes reposent sur la capacité des CSC à expulser rapidement les colorants fluorescents, tels que Hoechst 33342. L’efflux du colorant est associé aux transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC) et peut être inhibé par des inhibiteurs du transporteur ABC. Des méthodes pour souter les cellules cultivées de tumeur avec Hoechst 33342 et analyser la proportion de leurs cellules de SP par cytometry d’écoulement sont décrites. Ce test est pratique, rapide et rentable. Les données générées dans ce test peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.

Introduction

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont des sous-ensembles de cellules ayant une capacité d’autore renouvellement et un potentiel de différenciation multiple, qui jouent un rôle essentiel dans la croissance tumorale, les métastases et la récurrence1,2. Actuellement, les CSC ont été identifiés comme existant dans une variété de tumeurs malignes, y compris les cancers du poumon, du cerveau, du pancréas, de la prostate, du sein et du foie3,4,5,6,7,8,9. L’identification de CSCs dans ces tumeurs est principalement basée sur la présence des protéines de marqueur de surface, telles que l’expression haute et/ou basse de CD44, CD24, CD133, etSca-1 9,10,mais un marqueur unique qui peut distinguer CSCs de non-CSCs n’a pas été rapporté jusqu’ici. Actuellement, plusieurs techniques sont employées pour identifier et purifier des CSC dans le tissu tumoral ou les variétés de cellule tumorales. Ces techniques sont conçues en fonction des propriétés spécifiques des CSC. Parmi eux, les tests et le tri des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées.

Les cellules SP ont été découvertes à l’origine par Goodell et al.11,lorsqu’ils ont caractérisé les cellules souches hématopoïétiques dans les cellules de la moelle osseuse de la souris. Quand les cellules de moelle de souris ont été étiquetées avec le colorant fluorescent Hoechst 33342, un petit groupe de cellules de Hoechst 33342 faiblement-souillées est apparu dans le diagramme bidimensionnel de point d’une analyse cytometry d’écoulement. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN et a au moins deux modes de liaison qui conduisent à des caractéristiques spectrales différentes. Lors de la visualisation de l’émission de fluorescence à deux longueurs d’onde en même temps, plusieurs populations peuvent être révélées12. Dans leur test, le Hoechst 33342 a été excité à 350 nm et la fluorescence a été mesurée à l’aide du filtre passe-bande (BP) de 450/20 nm et du filtre de bord de 675 nm passe-long (EFLP)11. Par rapport à toute la population de cellules de moelle osseuse, ce groupe de cellules a été enrichi en cellules souches hématopoïétiques appelées cellules SP11. Les cellules SP sont capables d’expulser rapidement Hoechst 33342. L’efflux de ce colorant est apparenté aux transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC)13,qui peuvent être inhibés par certains agents tels que la fumitrémorgineC14,le vérapamil et la réserpine15,16. Après cela, différentes proportions de cellules SP ont été détectées dans une variété de tissus, d’organes, de tissus tumoraux et de lignées cellulairestumorales 17,18,19. Ces cellules SP présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches17,19.

Ce manuscrit décrit le étiquetage et la coloration de Hoechst 33342 des cellules tumorales cultivées et l’analyse des cellules SP par cytométrie en flux. D’ailleurs, l’optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et la sélection appropriée de bloqueur pour une variété de cellule spécifique de tumeur utilisant cette approche sont montrées. Enfin, les effets des signaux de promotion ou d’inhibition de stemness sur la proportion de SP dans les cellules tumorales sont démontrés. Les exemples expérimentaux démontrent que l’analyse du SP peut être employée pour explorer les effets de divers signaux, tels que l’expression de gène, les petits inhibiteurs, les activateurs, les cytokines, et les chemokines, sur le stemness de tumeur. Par rapport à d’autres méthodes d’isolement et de purification des CSC, telles que le tri de cd44+/CD24– population, l’analyse de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et les tests de formation de sphère tumorale, cette méthode est plus facile à manipuler et est rentable.

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Protocol

1. Préparation cellulaire

  1. Digestion cellulaire et neutralisation
    1. Graines de cellules tumorales (telles que les cellules MDA-MB-231) dans une plaque à 6 puits, et les culturez dans un incubateur à 37 °C alimenté à 5% deCO2.
    2. Récoltez des cellules lorsque leur densité atteint environ 90%. Aspirer soigneusement le milieu de culture et laver les cellules 2x avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE: Pour examiner les effets des inhibiteurs de la voie de signalisation (par exemple, l’inhibiteur FRA1) ou des activateurs (par exemple, l’activateur STAT3) sur les caractéristiques de stemness des cellules tumorales, les cellules tumorales sont ensemencées dans une plaque de 6 puits et prétraitées avec des inhibiteurs ou des activateurs pendant un certain temps avant la récolte.
    3. Ajouter 500 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % à chaque puits de la plaque à 6 puits, placer la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 1 à 3 minutes (min) et taper doucement la plaque pour détacher les cellules.
      REMARQUE: Une digestion prolongée affectera le profil SP en raison de changements dans la viabilité cellulaire.
    4. Ajouter 3 mL de PBS complétés par 2% de sérum fœtal bovin (FBS) à chaque puits de la plaque de 6 puits pour terminer la digestion et pipeter doucement les cellules de haut en bas 3-5x pour disperser les amas cellulaires.
    5. Ajouter 0,5 mL de suspension cellulaire à un puits d’une nouvelle plaque de 6 puits et l’examiner au microscope. Si des amas cellulaires sont observés, passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μM.
      Remarque : Il s’agit d’une étape facultative.
    6. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Cellules centrifugeuses à 200 x g pendant 5 min aux cellules de granulés. Retirez le surnageant et ressuscitez-les dans 3 mL de PBS complétés par 2% FBS. Pipettez les cellules de haut en bas 3 à 5x pour bien mélanger.
  2. Nombre de cellules
    1. Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et le mélanger avec une solution de bleu trypan de 50 μL. Pipetter 10 μL du mélange pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant une méthode standard, telle qu’un hémocytomètre.
    2. Diluez les cellules dans PBS complété avec 2% FBS à une concentration finale de 1 x 106 cells/mL. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire à un tube à essai rond en polystyrène de 5 mL et préparer deux tubes échantillons.

2. Coloration cellulaire avec Hoechst 33342

  1. Ajouter Hoechst 33342 à un tube pour atteindre une concentration finale appropriée.
    NOTA : Par exemple, la concentration appropriée de Hoechst 33342 est de 3 μg/mL pour les cellules MDA-MB-231.
  2. Ajouter un bloqueur (p. ex. fumitrémorgine C, Vérapamil ou Réserpine) à un autre tube à une concentration finale appropriée et incuber le tube à 37 °C pendant 30 min avant d’ajouter la même concentration de Hoechst 33342 que celle décrite à l’étape 2.1.
    REMARQUE : Pour les cellules MDA-MB-231, le bloqueur approprié est la réserpine (40 μM). Reserpine est utilisé comme contrôle bloquant pour vérifier l’absence de cellules dans la zone SP fermée.
  3. Préparez plusieurs tubes contenant des cellules et ajoutez Hoechst 33342 à différents gradients de concentration. Après un test de cytométrie en flux, choisissez la concentration appropriée en fonction du profil et de la proportion de SP.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative utilisée pour définir la concentration appropriée de Hoechst 33342.
  4. Préparer plusieurs tubes contenant des cellules, ajouter le bloqueur à différents gradients de concentration, incuber les tubes à 37 °C pendant 30 min, puis ajouter Hoechst 33342 à une concentration appropriée. Après l’essai de cytométrie de flux, choisissez la concentration appropriée en fonction de l’absence de cellules dans la zone SP fermée.
    Remarque : Il s’agit d’une étape facultative utilisée pour définir la concentration appropriée du bloqueur.
  5. Placez les tubes dans un incubateur à 37 °C et incuber pendant 60 min, en secouant les tubes toutes les 10 minutes.
    REMARQUE: Secouer soigneusement les tubes est important pour la coloration, car il assure un contact complet entre les cellules et le colorant pour de meilleurs résultats de coloration.
  6. Après l’incubation, centrifuger les cellules à 200 x g,4 °C pendant 5 min, et aspirer soigneusement le surnageant, car les cellules forment des pastilles très lâches et instables.
  7. Ressuscitez les cellules de chaque tube dans 1 mL de PBS glacé complété par 2% de FBS et pipettez les cellules de haut en bas 3 à 5x pour bien mélanger. Ajouter 1 μL d’iodure de propidium (IP) à 1 mg/mL à la suspension de chaque tube pour identifier les cellules mortes.
    REMARQUE: Toutes les procédures de cette étape doivent être effectuées à 4 ° C pour inhiber l’efflux de Hoechst 33342 des cellules tumorales. Les tubes doivent être protégés contre toute exposition directe à la lumière.

3. Analyse par cytométrie de flux

NOTA : Les instructions d’utilisation du logiciel du cytomètre de flux (voir la table des matériaux)sont décrites dans cette section et dans les figures supplémentaires 1 à 10.

  1. Dans le logiciel du cytomètre de flux, cliquez sur le bouton DOSSIER. Cliquez sur le bouton Experiment (Expérience), puis sur New Experiment (Figure supplémentaire 1A,B).
  2. Cliquez sur le bouton OK. « Experiment_001 » apparaîtra sous le DOSSIER (Figure supplémentaire 2A,B).
  3. Cliquez sur le bouton Experiment_001 pour remplacer le nom du dossier par un nom spécifique (par exemple, « 20191118-SP »). Cliquez sur Entrée. Le nouveau nom (« 20191118-SP ») apparaîtra sous DOSSIER (Figure supplémentaire 3A,B).
  4. Cliquez sur le bouton Nouveau spécimen pour ajouter un spécimen au nouveau dossier d’expérience (« 20191118-SP »). Cliquez sur le bouton Nouveau tube pour ajouter un tube à l’échantillon. Cliquez sur le bouton Flèche (Figure supplémentaire 4A-C).
  5. Cliquez sur le bouton Parameters (Paramètres) et configurez les paramètres du cytomètre de flux(Figure supplémentaire 5).
    1. Utilisez un miroir dichroïque de 610 nm à passage court (DMSP) pour séparer les longueurs d’onde d’émission. Utilisez un filtre BP de 450/20 nm pour collecter la fluorescence bleue et un EFLP de 675 nm pour collecter la fluorescence rouge.
      REMARQUE: Hoechst 33342 est excité avec un laser UV à 355 nm et PI est excité à 488 nm.
  6. Exécutez les échantillons de cellules sur le cytomètre de flux.
    REMARQUE: Les cellules SP peuvent être triées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) dans des conditions stériles. Un total de 100 000 à 500 000 cellules devrait être recueilli pour les expériences de suivi.
    1. Exécuter des cellules colorées avec Hoechst 33342 sur le cytomètre de flux.
      1. Placer des tubes contenant des cellules colorées avec Hoechst 33342 sur le cytomètre.
      2. Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, puis cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe Y et définissez-le sur "PI-A« . Affichez le diagramme à points de la zone d’impulsion de diffusion vers l’avant (FSC-A, axe X défini en mode linéaire) par rapport à la fluorescence PI (axe Y défini sur l’échelle logarithmique). Ajustez les tensions pour afficher les cellules vivantes dans le côté droit et les cellules non vivantes, qui sont brillamment colorées avec PI, dans le coin supérieur gauche. Ensuite, établissez une porte polygonale pour exclure les cellules mortes et les débris cellulaires(Figure 1A)en cliquant sur le bouton Porte polygonale pour griller le sous-ensemble P1, également connu sous le nom de sous-ensemble FSC-A, PI-A(Figure supplémentaire 6A,B).
      3. Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "FSC-W« . Affichez le diagramme à points de FSC-A (axe X) par rapport à la largeur d’impulsion de diffusion vers l’avant (FSC-W, axe Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton P1 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P2 (également appelé sous-ensemble FSC-A, FSC-W). Cela exclura les cellules avec de grands volumes(figure supplémentaire 7A-C et figure 1A).
      4. Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . Affichez le diagramme à points de la zone d’impulsion de diffusion latérale (SSC-A, axe X) par rapport à la largeur d’impulsion de diffusion latérale (SSC-W, axe Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, puis cliquez sur le bouton P2 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez ensuite sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P3 (également connu sous le nom de sous-ensemble SSC-A, SSC-W). On obtiendra ainsi une population cellulaire avec une granularité uniforme(figure supplémentaire 8A-C et figure 1A).
      5. Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur" Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . Affichez le diagramme à points de Hoechst Red-A (axe des X) par rapport à Hoechst Blue-A (axe des Y). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton P3 sous le bouton Afficher les populations. Cliquez sur le bouton Polygon Gate pour créer une porte polygonale pour gater le sous-ensemble P4 (également appelé sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A). Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, cliquez sur le bouton Afficher la hiérarchie de population pour afficher la hiérarchie de population.
        REMARQUE : Le diagramme à points montrera trois populations différentes : 1) une population en phase G0-G1 près du centre du graphique; 2) une population en phase S-G2/M près du coin supérieur droit; 3) le SP. Le SP est ensuite activé pour une analyse plus approfondie(figure supplémentaire 9A-D et figure 1A). Si le diagramme à points de Hoechst Red-A par rapport à Hoechst Blue-A ne montre pas un profil sp similaire à celui illustré à la figure 1A,les tensions doivent être ajustées jusqu’à ce qu’un profil similaire soit vu. Pendant ce temps, ajustez toutes les portes ci-dessus en conséquence.
      6. Après avoir déterminé la région de porte des cellules SP, cliquez sur Acquérir des données pour collecter 20 000 à 100 000 événements de chaque échantillon afin d’analyser le pourcentage de cellules SP(Figure supplémentaire 10).
    2. Exécutez les cellules colorées hoechst 33342 traitées avec un bloqueur sur le cytomètre de flux.
      1. Placez des tubes contenant un bloqueur sur le cytomètre et faites fonctionner les cellules en utilisant les mêmes tensions et portes pour vérifier si les tensions et les portes sont sélectionnées de manière appropriée.
        REMARQUE: Par rapport à la coloration Hoechst 33342 seule, seule une très faible proportion de cellules, le cas échéant, devrait apparaître dans la zone fermée du SP(Figure 1B).
      2. Collectez 20 000 à 100 000 événements de chaque échantillon pour analyser le pourcentage de cellules SP.

4. Analyse des données

NOTA : Les instructions d’utilisation du logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir la table des matériaux)sont décrites dans cette section et dans les figures supplémentaires 11à16.

  1. Copiez les fichiers au format fcs sur un ordinateur, ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et faites glisser un fichier d’échantillon vers le logiciel(Figure supplémentaire 11A,B).
  2. Cellules de porte et obtenir le pourcentage de cellules SP.
    1. Double-cliquez sur cet exemple de fichier, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe Y et définissez-le sur "PI-A« . Ensuite, créez une porte polygonale et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, PI-A(Figure supplémentaire 12A-E).
    2. Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, PI-A, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "FSC-W« . Ensuite, créez une porte rectangulaire et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, FSC-W(Figure supplémentaire 13A-E).
    3. Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, FSC-W, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . Ensuite, créez une porte rectangulaire et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble SSC-A, SSC-W(Figure supplémentaire 14A-E).
    4. Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W, cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . Ensuite, créez une porte polygonale et cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(Figure supplémentaire 15A-E).
    5. Ouvrez l’Éditeur de mise en page en cliquant sur le bouton Ouvrir l’éditeur de mise en page. Faites glisser le fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W vers l’Éditeur de mise en page, puis cliquez sur le bouton Cliquez pour enregistrer la fenêtre de mise en page dans un fichier pour enregistrer les résultats del’image (Figure supplémentaire 16A-C).
  3. Enregistrez l’espace de travail pour conserver les informations de contrôle lors de la fermeture du logiciel.
  4. Effectuez des analyses de test t avec un logiciel d’analyse statistique pour comparer la différence entre deux groupes. Une valeur de P < 0,05 a été définie comme statistiquement significative.

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Representative Results

Quatre analyses expérimentales de SP ont été exécutées selon cette méthode. Dans le premier, nous avons détecté la proportion de cellules de SP dans MDA-MB-231, qui est une variété de cellule humaine triple négative de cancer du sein, dans des conditions normales. Après comptage cellulaire, Hoechst 33342 a été ajouté dans un tube contenant 1 x 106 cellules à une concentration finale de 3 μg/mL. La réserpine et le hoechst 33342 ont été ajoutés à un autre tube à des concentrations finales de 40 μM et de 3 μg/mL, respectivement. PI a été ajouté aux deux tubes. Le diagramme à points de FSC-A (axe des X) par rapport à PI-A (axe des Y) a montré trois populations : 1) une population de cellules PI-positive, qui a représenté les cellules mortes ; 2) débris cellulaires; et 3) la population principale était des cellules PI-négatives, qui ont été soumises à une analyse plus approfondie(figure 1A,B). Une population unicellulaire fermée à partir du diagramme à points de FSC-A (axe des X) par rapport à FSC-W (axe des Y) et du diagramme à points de SSC-A (axe des X) par rapport à SSC-W (axe des Y) a été utilisée pour analyser la proportion de cellules SP(figure 1A,B). Les cellules sp ont été fermées à partir du diagramme à points de Hoechst Red-A (axe X) par rapport à Hoechst Blue-A (axe Y), et leur pourcentage était d’environ 0,9% dans les cellules MDA-MB-231(figure 1A). Cependant, la réserpine a considérablement diminué la proportion de cellules SP(figure 1B),ce qui soutient que la peinture de porte pour SP est correcte.

La deuxième expérience était de déterminer la concentration appropriée de souillure de Hoechst 33342 en cellules MDA-MB-435. Après comptage cellulaire, Hoechst 33342 a été ajouté à 1 x 106 cellules, qui ont été suspendues dans 1 mL de PBS complété par 2% FBS, à différents gradients de concentration, y compris 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 et 4 μg/mL. Comme le montre la figure 2A,lorsque la concentration de Hoechst 33342 était trop faible (c.-à-d. 0,5, 1, 1,5 μg/mL), il était difficile de distinguer les cellules SP des autres populations cellulaires, car de nombreuses cellules étaient dans un état faiblement coloré. Lorsque la concentration de Hoechst 33342 était trop élevée (c.-à-d. 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL), la proportion de cellules SP diminuait jusqu’à ce qu’elle disparaisse. Ainsi, 2 μg/mL Hoechst 33342 était la meilleure concentration pour l’analyse sp dans les cellules MDA-MB-435. De plus, pour déterminer le bloqueur approprié pour cette lignée cellulaire, Hoechst 33342 et un bloqueur (Vérapamil ou Réserpine) ont été ajoutés à 1 x10 6 cellules, qui ont été suspendues dans 1 mL de PBS complété par 2 % de FBS, à des concentrations finales de 2 μg/mL et 40 μM, respectivement. Comme le montre la figure 2B,environ 0,4 % des cellules ont expulsé le colorant après le traitement au vérapamil. Cependant, après le traitement par réserpine, le rapport a chuté à environ 0,1 %(figure 2C). De cette expérience, Reserpine a été considéré comme un bloqueur plus approprié pour cette lignée cellulaire.

Dans le troisième exemple, des cellules A549 (cellules humaines d’adénocarcinome de poumon) ont été traitées au préalable avec l’activateur STAT3-Colivelin20 (100 nM) pendant 48 heures (h). La voie de signalisation STAT3 est importante pour promouvoir les caractéristiques de stemness des cellulestumorales 21. Comme le montre la figure 3,la proportion de cellules SP a augmenté lors de la stimulation coliveline.

Dans le dernier exemple, les cellules T47D (cellules cancéreuses du sein humaines) ont été prétraitées avec 0,1 μM inhibiteur FRA1-SKLB816 (également nommé 13an) pendant 48 h22. FRA1 est un gardien rapporté de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et impliqué dans la régulation de la stemness de tumeur23. Comme le montre la figure 4,la proportion de cellules SP a diminué en raison du traitement de l’inhibiteur FRA1.

Figure 1
Figure 1 : Stratégie de gating des cellules MDA-MB-231 dans l’analyse sp. (A) Stratégie de gating des cellules MDA-MB-231, qui ont été colorées avec Hoechst 33342 (3 μg/mL) et de l’iodure de propidium (PI, 1 μg/mL). (B) Stratégie de gating des cellules MDA-MB-231, qui ont été traitées avec de la réserpine (40 μM) et colorées avec Hoechst 33342 (3 μg/mL) et PI (1 μg/mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et sélection du bloqueur dans les cellules MDA-MB-435. (A) Les résultats de l’analyse SP des cellules MDA-MB-435, qui ont été colorées avec Hoechst 33342 (Hoechst) à différents gradients de concentration (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 μg/mL) avec PI (1 μg/mL). (B) Le résultat de l’analyse SP des cellules MDA-MB-435, qui ont été traitées avec du vérapamil (40 μM) et colorées avec Hoechst 33342 (2 μg/mL) et PI (1 μg/mL). (C) Résultat de l’analyse SP des cellules MDA-MB-435, qui ont été traitées avec de la réserpine (40 μM) et colorées avec Hoechst 33342 (2 μg/mL) et PI (1 μg/mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : La proportion de cellules SP a été augmentée par l’activateur STAT3 dans les cellules A549. (A) Les résultats de l’analyse SP des cellules A549 prétraitées avec STAT3 activateur-Colivelin (100 nM) ou sa commande de véhicule (Ctrl)-H2O pendant 48 h. Des cellules A549 traitées à la réserpine (45 μM) ont été utilisées comme témoin de blocage. Les cellules A549 ont été colorées avec Hoechst 33342 (7 μg/mL) et PI (1 μg/mL). (B) Les résultats statistiques de la proportion de cellules SP dans les cellules A549 traitées avec colivelin (100 nM) et son contrôle du véhicule. Les données sont présentées sous forme de moyenne + erreur type de la moyenne (MEB), n = 3 pour chaque groupe. « * » indique P < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : La proportion de cellules SP a été inhibée par l’inhibiteur FRA1 dans les cellules T47D. (A) Les résultats de l’analyse SP des cellules T47D prétraitées avec SKLB816 (0,1 μM) ou sa commande de véhicule (Ctrl)-DMSO pendant 48 h. Des cellules T47D traitées à la réserpine (40 μM) ont été utilisées comme témoin de blocage. Les cellules T47D ont été colorées avec Hoechst 33342 (8 μg/mL) et PI (1 μg/mL). (B) Les résultats statistiques de la proportion de cellules SP dans les cellules T47D traitées avec SKLB816 (0,1 μM) et son contrôle du véhicule. Les données sont présentées sous forme de moyenne + MEB, n = 3 pour chaque groupe. « * » indique P < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Instructions pour l’étape 3.1 du logiciel du cytomètre de flux. (A)Cliquez sur le bouton DOSSIER. (B) Cliquez sur le bouton Expérience, puis sur le bouton Nouvelle expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 2 : Instructions pour l’étape 3.2 du logiciel du cytomètre de flux. (A)Cliquez sur le bouton OK. (B) Experiment_001 apparaît sous DOSSIER. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 3 : Instructions pour l’étape 3.3 du logiciel du cytomètre de flux. (A) Cliquez sur le bouton Experiment_001 pour remplacer le nom de Experiment_001 par un nom spécifique (par exemple, « 20191118-SP »). (B) Cliquez sur le bouton Entrée. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 4: Instructions pour l’étape 3.4 du logiciel du cytomètre de flux. (A)Cliquez sur le bouton Nouvel échantillon. (B)Cliquez sur le bouton Nouveau tube. (C)Cliquez sur le bouton Flèche. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 5 : Instructions pour l’étape 3.5 du logiciel du cytomètre de flux. (A) Cliquez sur le bouton Paramètres pour configurer les paramètres. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 6: Instructions pour l’étape du logiciel du cytomètre de flux numéro 3.6.1.2. (A) Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et réglez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et définissez-le sur « PI-A ». (B) Cliquez sur le bouton Polygon Gate pour créer une porte polygonale pour gater le sous-ensemble P1 (également connu sous le nom de sous-ensemble FSC-A, PI-A). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 7: Instructions pour l’étape 3.6.1.3 du logiciel du cytomètre de flux. (A) Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et réglez-le sur « FSC-A »; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur « FSC-W ». (B) Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points et cliquez sur le bouton P1 sous le bouton Afficher les populations. (C) Cliquez sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P2 (également connu sous le nom de sous-ensemble FSC-A, FSC-W). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 8: Instructions pour l’étape du logiciel du cytomètre de flux numéro 3.6.1.4. (A) Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe des X et réglez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . (B) Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points et cliquez sur le bouton P2 sous le bouton Afficher les populations. (C) Cliquez sur le bouton Grille rectangulaire pour créer une porte rectangulaire pour griller le sous-ensemble P3 (également connu sous le nom de sous-ensemble SSC-A, SSC-W). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 9: Instructions pour l’étape 3.6.1.5 du logiciel du cytomètre de flux. (A) Cliquez sur le bouton Dot Plot pour afficher le dot plot, cliquez sur l’axe X et réglez-le sur "Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . (B) Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points et cliquez sur le bouton P3 sous le bouton Afficher les populations. (C) Cliquez sur le bouton Polygon Gate pour créer une porte polygonale pour gater le sous-ensemble P4 (également connu sous le nom de Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A subset). (D) Cliquez avec le bouton droit sur le diagramme à points, puis cliquez sur le bouton Afficher la hiérarchie de population pour afficher la hiérarchie de population. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 10: Instructions pour l’étape 3.6.1.6 du logiciel du cytomètre de flux. (A) Cliquez sur le bouton Acquérir des données, puis collectez 20 000 à 100 000 événements de chaque exemple. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 11 : Instructions pour l’étape numéro 4.1 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A) Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie de flux et faites glisser un fichier d’échantillon dans le logiciel. (B) L’exemple de fichier est importé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 12 : Instructions pour l’étape 4.2.1 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A) Double-cliquez sur cet exemple de fichier. (B) Cliquez sur l’axe X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe Y et définissez-le sur "PI-A« . (C) Cliquez sur le bouton Créer une porte de polygone pour créer une porte de polygone. (D) Cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, PI-A. (E) Le sous-ensemble FSC-A, PI-A est obtenu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 13 : Instructions pour l’étape 4.2.2 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A) Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, PI-A. (B) Cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "FSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "FSC-W« . (C) Cliquez sur le bouton Créer une porte rectangulaire pour créer une porte rectangulaire. (D) Cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble FSC-A, FSC-W. (E) Le sous-ensemble FSC-A, FSC-W est obtenu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 14 : Instructions pour l’étape 4.2.3 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A) Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble FSC-A, FSC-W. (B) Cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "SSC-A« ; cliquez sur l’axe des Y et réglez-le sur "SSC-W« . (C) Cliquez sur le bouton Créer une porte rectangulaire pour créer une porte rectangulaire. (D) Cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble SSC-A, SSC-W. (E) Le sous-ensemble SSC-A, SSC-W est obtenu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 15 : Instructions pour l’étape 4.2.4 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A) Double-cliquez sur le fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W. (B) Cliquez sur l’axe des X et définissez-le sur "Hoechst Red-A« ; cliquez sur l’axe Y et réglez-le sur "Hoechst Blue-A« . (C) Cliquez sur le bouton Créer une porte de polygone pour créer une porte de polygone. (D) Cliquez sur le bouton OK pour obtenir le sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) Le sous-ensemble Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A est obtenu. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 16: Instructions pour l’étape 4.2.5 du logiciel d’analyse de cytométrie de flux. (A)Cliquez sur le bouton Ouvrir l’éditeur de mise en page pour ouvrir l’éditeur de mise en page. (B) Faites glisser l’exemple de fichier de sous-ensemble SSC-A, SSC-W vers l’éditeur de mise en page. (C)Cliquez sur le bouton Cliquez pour enregistrer la fenêtre de mise en page dans un fichier pour enregistrer les résultats de l’image. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

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Discussion

Il y a plusieurs points clés à garder à l’esprit pour le test SP. Le premier est la sélection d’un bloqueur approprié, tel que Vérapamil ou Réserpine, pour chaque lignée cellulaire, car l’emplacement « porte » des cellules SP est déterminé en fonction de la position à laquelle un grand nombre de cellules SP disparaissent après l’ajout du bloqueur. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, Reserpine fonctionne bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires, différents bloqueurs peuvent mieux fonctionner.

La seconde est la concentration de Hoechst 33342. Le pourcentage de cellules de SP a augmenté pendant que la concentration de souillure de Hoechst 33342 diminuait, comme les données représentatives ont montré. Ce phénomène peut s’expliquer par la cinétique d’absorption des colorants24. Les changements dans la concentration de colorant affectent l’enrichissement de Hoechst 33342 dans les cellules. Par conséquent, la concentration de coloration de Hoechst 33342 est étroitement liée aux résultats de l’analyse sp. De plus, l’absorption et l’expulsion de Hoechst 33342 varient selon les types de cellules. Ainsi, les concentrations appropriées de Hoechst 33342 doivent être explorées pour différentes lignées cellulaires avant l’analyse SP.

Le troisième est un bon coefficient de variation (CV) du cytomètre de flux, qui est également critique pour l’analyse SP25. La puissance laser UV est un critère important pour de meilleurs CV12. Ce protocole utilise un cytomètre de flux commercial (voir la table des matériaux)pour effectuer le test SP. Dans cet instrument à cuvette-flow-cell, nous avons utilisé le laser UV d’une puissance de 15 mW pour obtenir les meilleurs CV. En général, une puissance laser UV relativement élevée fournit les CV optimaux. Par exemple, 50 à 100 mW fournissent le signal Hoechst optimal sur les instruments jet-in-air12. Certains lasers fournissent une puissance UV plus faible, ce qui peut réduire les CV. Dans ces cas, un bon alignement laser est essentiel.

Le dernier est l’influence d’autres facteurs au cours de l’expérience. L’état cellulaire, la température, le moment de la coloration, le fonctionnement de la cytométrie en flux et d’autres facteurs peuvent également affecter la proportion et la qualité de l’essai sp. Par exemple, les changements dans la viabilité cellulaire pendant la préparation des suspensions cellulaires affecteront le rapport des cellules SP. Par conséquent, les meilleures conditions expérimentales doivent être explorées avant d’effectuer une analyse SP. Compte tenu des facteurs ci-dessus, le rapport SP de la même lignée cellulaire mesuré par différents laboratoires peut être différent. Par exemple, les proportions de cellules MDA-MB-231 et de cellules A549 ont été rapportées pour être ~0.1%–4.8%26,27,28,29 et ~0.8%–18%30,31,32,33,34, respectivement.

Les chercheurs peuvent modifier ce test pour différentes applications, telles que l’étude d’autres lignées cellulaires tumorales ou de cellules tumorales primaires dérivées du patient. Si le protocole ne fonctionne pas bien pour les cellules testées, les chercheurs peuvent utiliser les cellules MDA-MB-231 comme témoin positif et colorer les cellules en suivant les spécifications données. Parce que ce protocole est très sensible à la concentration de Hoechst 33342, la température et le temps de coloration, etc., les chercheurs devraient vérifier toutes ces conditions de près. Le pourcentage de SP dans de nombreux types de lignées cellulaires tumorales humaines est relativement faible (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Si un pourcentage excessivement élevé ou faible de SP est observé, cela peut être dû à des concentrations inappropriées de Hoechst 33342 ou de bloqueur utilisé. Si le problème semble être lié au cytomètre de flux, un soutien technique doit être obtenu.

Bien que l’utilisation de SP pour analyser et séparer les CSC soit très efficace, elle présente encore certaines limites. La première est sa grande sensibilité aux conditions de coloration12. De nombreux facteurs, tels que la concentration de Hoechst 33342, l’état des cellules, la température, le temps de coloration, le fonctionnement de la cytométrie en flux et la sélection du bloqueur, peuvent affecter la qualité de l’analyse SP. Le second est l’effet cytotoxique de Hoechst 33342. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN, mais est toxique pour les cellules lorsqu’il atteint des concentrations élevées et réduit ainsi l’activité cellulaire37.

En résumé, l’analyse de PS est l’une des méthodes les plus couramment utilisées ces dernières années pour identifier et purifier CSCs dans des variétés de cellule de tumeur. Bien que la méthode présente certaines limites, en l’absence de marqueurs de surface de CSC spécifiques, il s’agit toujours d’une méthode d’enrichissement pratique, rapide et rentable des CSC. Cette méthode est bénéfique pour l’étude des fonctions biologiques des CSC et pour l’identification de marqueurs de surface spécifiques. D’ailleurs, en détectant les effets de divers signaux sur le rapport de PS des cellules de tumeur, il peut fournir des indices à l’effet régulateur de ces voies de signal sur des caractéristiques de CSC, et faciliter la découverte de nouveaux mécanismes, qui peuvent finalement guider la thérapie ciblée des tumeurs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 et 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Université de Nankai 63191153.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate CORNING 3516 9.5 cm2 (approx.)
Colivelin MCE HY-P1061A Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries (BIOIND) 04-001-1ACS
Flow cytometer BD Biosciences BD LSRFortessa
Flow cytometer software BD Biosciences FACSDiva
Flow cytometry analysis software BD Biosciences FlowJo
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube CORNING 352054 12 x 75 mm, 5 mL
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine Sigma-Aldrich 83580 (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816 Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200072
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V4629 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride

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References

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
  4. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
  5. Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
  6. Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
  7. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
  9. Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
  10. Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
  11. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  12. Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
  13. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
  14. Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
  15. Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
  16. Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
  17. Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
  18. Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
  19. Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
  20. Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
  21. Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
  22. Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
  23. Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
  24. Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
  25. Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
  26. Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
  27. Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
  28. Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
  29. Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
  30. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
  31. Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
  32. Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
  33. Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
  34. Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
  35. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  36. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  37. Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).

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Dong, X., Wei, Y., Xu, T., Tan, X., Li, N. Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines. J. Vis. Exp. (168), e60658, doi:10.3791/60658 (2021).

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