Summary
En bekväm, snabb och kostnadseffektiv metod för att mäta andelen sidopopulationsceller i solida tumör cellinjer presenteras.
Abstract
Cancerstamceller (CSCs) är en viktig orsak till tumörtillväxt, metastasering och återkommande. Isolering och identifiering av CSCs är av stor betydelse för tumör forskning. För närvarande används flera tekniker för identifiering och rening av CSCs från tumör vävnader och tumör cellinjer. Separation och analys av sidopopulationsceller (SP) är två av de vanliga metoderna. Metoderna förlitar sig på CSC: s förmåga att snabbt utvisa fluorescerande färgämnen, såsom Hoechst 33342. Färgämnets utflöde är förknippat med ATP-bindande kassett (ABC) transportörer och kan hämmas av ABC transportörhämmare. Metoder för färgning odlade tumörceller med Hoechst 33342 och analysera andelen av deras SP celler genom flöde cytometri beskrivs. Denna analys är bekväm, snabb och kostnadseffektiv. Data som genereras i denna analys kan bidra till en bättre förståelse av effekten av gener eller andra extracellulära och intracellulära signaler på tumörcellernas stamegenskaper.
Introduction
Cancerstamceller (CSCs) är delmängder av celler med självförnyelseförmåga och multipla differentieringspotential, som spelar en viktig roll i tumörtillväxt, metastasering och återkommande1,2. För närvarande har CSCs identifierats för att existera i en mängd maligna tumörer, inklusive lunga, hjärna, bukspottkörtel, prostata, bröstochlevercancer3,4,5,6,7,8,9. Identifiering av CSCs i dessa tumörer är huvudsakligen baserat på förekomsten av ytmarkörproteiner, såsom högt och/ eller lågt uttryck av CD44, CD24, CD133 och Sca-19,10, men en unik markör som kan skilja CSCs från icke-CSCs har hittills inte rapporterats. För närvarande används flera tekniker för att identifiera och rena CSCs i tumörvävnad eller tumör cellinjer. Dessa tekniker är utformade baserat på CSC:s specifika egenskaper. Bland dem är analyser och sortering av sidopopulationsceller (SP) två av de vanliga metoderna.
SP-celler upptäcktes ursprungligen av Goodell et al.11, när de karakteriserade hematopoetiska stamceller i musbenmärgsceller. När mus benmärg celler var märkta med fluorescerande färgämne Hoechst 33342, en liten grupp av Hoechst 33342 svagt färgade celler uppträdde i den tvådimensionella pricken plot av ett flöde cytometri analys. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne och har minst två bindningslägen som leder till olika spektralegenskaper. När man tittar på fluorescensutsläpp vid två våglängder samtidigt kan flera populationer avslöjas12. I sin analys var Hoechst 33342 upphetsad på 350 nm och fluorescensen mättes med hjälp av filtret 450/20 nm bandpass (BP) och 675 nm kantfilter långpass (EFLP)11. Jämfört med hela populationen av benmärgsceller berikades denna grupp av celler med hematopoetiska stamceller som kallas SP-celler11. SP-celler kan snabbt utvisa Hoechst 33342. Utflödet av detta färgämne är relaterat till ATP-bindande kassett (ABC) transportörer13, som kan hämmas av vissa medel som Fumitremorgin C14,Verapamil och Reserpine15,16. Därefter upptäcktes olika proportioner av SP-celler i en mängd olika vävnader, organ, tumörvävnader och tumörcelllinjer17,18,19. Dessa SP-celler har många egenskaper hos stamceller17,19.
Detta manuskript beskriver Hoechst 33342 märkning och färgning av odlade tumörceller och analys av SP-celler genom flöde cytometri. Dessutom visas optimering av Hoechst 33342 koncentrationen och rätt blockerare urval för en specifik tumör cellinje med hjälp av detta tillvägagångssätt. Slutligen demonstreras effekterna av stamning marknadsföring eller hämning signaler på andelen SP i tumör celler. De experimentella exemplen visar att analys av SP kan användas för att utforska effekterna av olika signaler, såsom genuttryck, små hämmare, aktivatorer, cytokiner och kemokiner, på tumörstamhet. Jämfört med andra metoder för isolering och rening av CSCs, såsom sortering av CD44+/ CD24- population, aldehyd dehydrogenas (ALDH) analys och tumör sfärbildning analyser, är denna metod lättare för manipulation och är kostnadseffektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellberedning
- Cellsammanfattning och neutralisering
- Frötumörceller (såsom MDA-MB-231 celler) i en 6 brunnsplatta och odla dem i en 37 °C inkubator levereras med 5% CO2.
- Skörda celler när deras densitet når ca 90%. Aspirera odlingsmediet noggrant och tvätta cellerna 2x med 3 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: För att undersöka effekterna av signalvägshämmare (t.ex. FRA1-hämmare) eller aktivatorer (t.ex. STAT3-aktivator) på tumörcellernas stamegenskaper sås tumörceller i en 6 brunnsplatta och förbehandlas med hämmare eller aktivatorer under en viss tid före skörden. - Tillsätt 500 μL 0,25% trypsin-EDTA till varje brunn på 6 brunnsplattan, placera plattan i en inkubator vid 37 °C i 1–3 minuter (min) och knacka försiktigt på plattan för att lossa cellerna.
OBS: Långvarig matsmältning påverkar SP-profilen på grund av förändringar i cellens livskraft. - Tillsätt 3 ml PBS kompletterat med 2% fetala nötkreatursserum (FBS) till varje brunn på 6 brunnsplattan för att avsluta matsmältningen och försiktigt pipettera cellerna upp och ner 3-5x för att sprida cellklumparna.
- Tillsätt 0,5 ml cellfjädring till en brunn på en ny 6-brunnsplatta och undersök den under ett mikroskop. Om cellklumpar observeras, passera cellsuspensionen genom en 70 μM cellsil.
Obs: Detta är ett valfritt steg. - Överför cellerna till ett 15 ml centrifugeringsrör. Centrifugceller vid 200 x g i 5 min till pelletsceller. Ta bort supernatanten och återanvänd dem i 3 ml PBS kompletterat med 2% FBS. Pipettera cellerna upp och ner 3-5x för att blanda ordentligt.
- Antal celler
- Tillsätt 50 μL av cellfjädringen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda det med 50 μL trypanblå lösning. Pipett 10 μL av blandningen för att räkna antalet levande celler med en standardmetod, till exempel en hemocytometer.
- Späd cellerna i PBS kompletterat med 2% FBS till en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/ml. Tillsätt 1 ml av cellfjädringen till ett 5 ml polystyren runt bottenprovröret och förbered två provrör.
2. Cellfärgning med Hoechst 33342
- Tillsätt Hoechst 33342 till ett rör för att uppnå en lämplig slutlig koncentration.
OBS: Till exempel är lämplig koncentration av Hoechst 33342 3 μg/ml för MDA-MB-231 celler. - Tillsätt en blockerare (t.ex. Fumitremorgin C, Verapamil eller Reserpine) i ett annat rör till en lämplig slutlig koncentration och inkubera röret vid 37 °C i 30 minuter innan samma koncentration av Hoechst 33342 tillsätts enligt beskrivningen i steg 2.1.
OBS: För MDA-MB-231-celler är lämplig blockerare Reserpine (40 μM). Reserpine används som en blockerande kontroll för att verifiera frånvaron av celler i det gated SP-området. - Förbered flera rör som innehåller celler och tillsätt Hoechst 33342 till olika koncentrationsgradienter. Efter en flödescytometrianalys väljer du rätt koncentration enligt profilen och andelen SP.
OBS: Detta är ett valfritt steg som används för att definiera korrekt koncentration av Hoechst 33342. - Förbered flera rör som innehåller celler, tillsätt blockeraren i olika koncentrationsgradienter, inkubera rören vid 37 °C i 30 min och tillsätt sedan Hoechst 33342 till en lämplig koncentration. Efter flödescytometrianalysen väljer du rätt koncentration beroende på frånvaron av celler i det gated SP-området.
OBS: Detta är ett valfritt steg som används för att definiera korrekt koncentration av blockerare. - Placera rören i en inkubator på 37 °C och inkubera dem i 60 minuter och skaka rören var 10:e minut.
OBS: Att skaka rör noggrant är viktigt för färgning, eftersom det säkerställer fullständig kontakt mellan cellerna och färgämnet för bättre färgresultat. - Efter inkubationen, centrifugera cellerna vid 200 x g, 4 °C i 5 min och aspirera supernatanten noggrant, eftersom cellerna bildar mycket lösa och instabila pellets.
- Återanvända celler i varje rör i 1 ml iskallt PBS kompletterat med 2% FBS och pipett cellerna upp och ner 3-5x för att blanda noggrant. Tillsätt 1 μL 1 mg/ml propidiumidid (PI) till fjädringen av varje rör för att identifiera döda celler.
OBS: Alla procedurer i detta steg bör utföras vid 4 °C för att hämma utflödet av Hoechst 33342 från tumörcellerna. Rören bör skyddas mot direkt exponering för ljus.
3. Analys av flödescytometri
ANM.: Bruksanvisningen för programvaran flödescytometer (se materialförteckningen)beskrivs i detta avsnitt och tilläggssiffrorna 1–10.
- Klicka på KNAPPEN MAPP i programvaran flödescytometer. Klicka på knappen Experimentera och sedan på Nytt experiment (Kompletterande bild 1A,B).
- Klicka på ok-knappen. "Experiment_001" visas under MAPPEN (kompletterande figur 2A,B).
- Klicka på Experiment_001 om du vill ändra mappnamnet till ett visst namn (t.ex. "20191118-SP"). Klicka på Ange. Det nya namnet ("20191118-SP") kommer att visas under FOLDER (Kompletterande figur 3A,B).
- Klicka på knappen Nytt prov om du vill lägga till ett prov i den nya experimentmappen ("20191118-SP"). Klicka på knappen Nytt rör för att lägga till ett rör i provet. Klicka på pilspetsknappen (kompletterande figur 4A-C).
- Klicka på knappen Parametrar och ställ in parametrarna för flödescytometern (kompletterande figur 5).
- Använd en 610 nm dichroic spegel kortpass (DMSP) för att separera utsläppsvåglängderna. Använd ett 450/20 nm BP-filter för att samla in den blå fluorescensen och en EFLP på 675 nm för att samla in den röda fluorescensen.
OBS: Hoechst 33342 är upphetsad med en UV-laser på 355 nm och PI är upphetsad på 488 nm.
- Använd en 610 nm dichroic spegel kortpass (DMSP) för att separera utsläppsvåglängderna. Använd ett 450/20 nm BP-filter för att samla in den blå fluorescensen och en EFLP på 675 nm för att samla in den röda fluorescensen.
- Kör cellproverna på flödescytometern.
SP-celler kan sorteras efter fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) under sterila förhållanden. Totalt ska 100 000–500 000 celler samlas in för uppföljningsexperimenten.- Kör celler färgade med Hoechst 33342 på flödescytometern.
- Placera rör som innehåller celler färgade med Hoechst 33342 på cytometern.
- Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramt, klicka sedan på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "PI-A". Visa punktdiagrammet för framåtriktat spridningspulsområde (FSC-A, X-axel inställd på linjärt läge) jämfört med PI-fluorescensen (Y-axeln inställd på logaritmisk skala). Justera spänningarna för att visa de levande cellerna i höger sida och de icke-levande cellerna, som är ljust färgade med PI, i det övre vänstra hörnet. Upprätta sedan en polygonport för att utesluta döda celler och cellskräp (figur 1A) genom att klicka på polygonportknappen för att gate P1-delmängden, även känd som FSC-A, PI-A-delmängd (Kompletterande figur 6A,B).
- Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramt, klicka på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "FSC-W". Visa punktdiagramt för FSC-A (X-axel) jämfört med fsc-W-axeln (FSC-W, Y-axeln). Högerklicka på prickdiagramt, klicka på P1-knappen under knappen Visa populationer. Klicka på knappen Rektangulär grind om du vill skapa en rektangulär port för att porta P2-delmängden (kallas även FSC-A, FSC-W-delmängd). Detta utesluter celler med stora volymer (kompletterande figur 7A-C och figur 1A).
- Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramt, klicka på X-axeln och ställ in den på "SSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "SSC-W". Visa punktdiagramt för sidospridningspulsområdet (SSC-A, X-axel) jämfört med bredden för sidospridningspulsen (SSC-W, Y-axeln). Högerklicka på prickdiagramt och klicka på P2-knappen under Knappen Visa populationer. Klicka sedan på knappen Rektangulär grind för att skapa en rektangulär grind för att porta P3-delmängden (även känd som SSC-A, SSC-W-delmängd). Detta kommer att erhålla en cellpopulation med enhetlig granularitet (kompletterande figur 8A-C och figur 1A).
- Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramt, klicka på X-axeln och ställ in den på "Hoechst Red-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "Hoechst Blue-A". Visa punktdiagramt i Hoechst Red-A (X-axel) jämfört med Hoechst Blue-A (Y-axel). Högerklicka på prickdiagramt, klicka på P3-knappen under knappen Visa populationer. Klicka på polygonportknappen för att skapa en polygonport för att gate P4-delmängden (även känd som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delmängd). Högerklicka på prickdiagramplotten, klicka på knappen Visa befolkningshierarki för att visa befolkningshierarkin.
OBS: Punktdiagrammet visar tre olika populationer: 1) en G0-G1-faspopulation nära mitten av diagrammet; 2) En S-G2/M-faspopulation nära det övre högra hörnet. 3) SP. Det utbevarande programdokumentet är sedan inhägnat för ytterligare analys(kompletterande figur 9A-D och figur 1A). Om prickdiagramt i Hoechst Red-A mot Hoechst Blue-A inte visar en SP-profil som liknar den som visas i figur 1A,bör spänningarna justeras tills en liknande profil har setts. Under tiden justera alla ovanstående grindar i enlighet därmed. - När du har fastställt sp-cellernas portregion klickar du på Hämta data för att samla in 20 000–100 000 händelser från varje prov för att analysera procentandelen SP-celler ( Kompletterande figur10).
- Kör Hoechst 33342-färgade celler behandlade med blockerare på flödescytometern.
- Placera rör som innehåller blockerare på cytometern och kör celler med samma spänningar och grindar för att ytterligare kontrollera om spänningarna och grindarna väljs på lämpligt sätt.
OBS: Jämfört med Enbart Hoechst 33342 färgning bör endast en mycket liten andel celler, om några, förekomma i det inhägnade området i SP (figur 1B). - Samla in 20 000–100 000 händelser från varje prov för att analysera procentandelen SP-celler.
- Placera rör som innehåller blockerare på cytometern och kör celler med samma spänningar och grindar för att ytterligare kontrollera om spänningarna och grindarna väljs på lämpligt sätt.
- Kör celler färgade med Hoechst 33342 på flödescytometern.
4. Dataanalys
ANM.: Instruktioner för användning av programvaran för flödescytometrianalys (se materialförteckning)beskrivs i detta avsnitt och kompletterande siffror 11–16.
- Kopiera filerna i FCS-format till en dator, öppna programvaran för flödescytometrianalys och dra en exempelfil till programvaran (Kompletterande figur 11A,B).
- Portceller och få procentandelen SP-celler.
- Dubbelklicka på denhär exempelfilen , klicka på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "PI-A". Skapa sedan en polygonport och klicka på OK-knappen för att få delmängden FSC-A, PI-A (Kompletterande figur 12A-E).
- Dubbelklicka på delmängdsfilen FSC-A, PI-A, klicka på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "FSC-W". Skapa sedan en rektangulär grind och klicka på OK för att hämta delmängden FSC-A, FSC-W (Kompletterande figur 13A-E).
- Dubbelklicka på delmängdsfilen FSC-A, FSC-W, klicka på X-axeln och ställ in den på "SSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "SSC-W". Skapa sedan en rektangulär grind och klicka på OK-knappen för att hämta delmängden SSC-A, SSC-W (Kompletterande figur 14A-E).
- Dubbelklicka på delmängdsfilen SSC-A, SSC-W, klicka på X-axeln och ställ in den på "Hoechst Red-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "Hoechst Blue-A". Skapa sedan en polygonport och klicka på OK-knappen för att få Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delmängden(kompletterande figur 15A-E).
- Öppna Layoutredigeraren genom att klicka på knappen Öppna layoutredigeraren. Dra delmängdsfilen SSC-A, SSC-W till Layout editor och klicka sedan på knappen Klicka för att spara layoutfönstret i filen för att spara bildresultaten (Tilläggsbild 16A-C).
- Spara arbetsytan för att behålla gating-informationen när du stänger programvaran.
- Utför t-testanalyser med programvara för statistisk analys för att jämföra skillnaden mellan två grupper. Värdet P-< 0,05 definierades som statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fyra experimentella SP-analyser utfördes enligt denna metod. I den första upptäckte vi andelen SP-celler i MDA-MB-231, som är en trippelnegativ mänsklig bröstcancer cellinje, under normala förhållanden. Efter cellräkning tillsattes Hoechst 33342 i ett rör som innehöll 1 x 106 celler till en slutlig koncentration på 3 μg/ml. Reserpine och Hoechst 33342 tillsattes i ett annat rör till slutkoncentrationerna 40 μM respektive 3 μg/ml. PI lades till i båda rören. Punktdiagramt för FSC-A (X-axel) jämfört med PI-A (Y-axeln) visade tre populationer: 1) en PI-positiv cellpopulation, som representerade de döda cellerna; 2) cellskräp; och 3) den huvudsakliga populationen var PI-negativa celler, som utsattes för ytterligare analys(figur 1A,B). En encellig population som är gated från punktdiagramt FSC-A (X-axel) jämfört med FSC-W (Y-axel) och punktdiagramt för SSC-A (X-axel) jämfört med SSC-W (Y-axel) användes för att analysera andelen SP-celler (figur 1A,B). SP-cellerna var gated från punktdiagramt i Hoechst Red-A (X-axel) jämfört med Hoechst Blue-A (Y-axeln), och deras procentandel var cirka 0,9% i MDA-MB-231 celler (Figur 1A). Reserpine minskade dock kraftigt andelen SP-celler (figur 1B), vilket stöder att portmålningen för SP är korrekt.
Det andra experimentet var att bestämma den lämpliga färgningskoncentrationen av Hoechst 33342 i MDA-MB-435 celler. Efter cellräkning lades Hoechst 33342 till 1 x 106 celler, som suspenderades i 1 ml PBS kompletterat med 2% FBS, till olika koncentrationsgradienter, inklusive 0, 5, 1, 1, 5, 2, 2, 5, 3, 3, 5 och 4 μg/ml. Som visas i figur 2A, när koncentrationen av Hoechst 33342 var för låg (dvs. 0,5, 1, 1, 5 μg/ml), var det svårt att skilja SP-celler från andra cellpopulationer, eftersom många celler var i ett svagt färgat tillstånd. När koncentrationen av Hoechst 33342 var för hög (dvs. 2,5, 3, 3, 5, 4 μg/ml) minskade andelen SP-celler tills den försvann. Således var 2 μg/mL Hoechst 33342 den bästa koncentrationen för SP-analys i MDA-MB-435 celler. För att bestämma rätt blockerare för denna cellinje tillsattes Dessutom Hoechst 33342 och en blockerare (Verapamil eller Reserpine) till 1 x 106 celler, som suspenderades i 1 ml PBS kompletterat med 2% FBS, till slutliga koncentrationer på 2 μg/ml respektive 40 μM. Som visas i figur 2Butvisade cirka 0,4% av cellerna färgämnet efter Verapamil-behandling. Efter Behandlingen med Reserpine sjönk dock förhållandet till cirka 0,1 % (figur 2C). Från detta experiment ansågs Reserpine vara en lämpligare blockerare för denna cellinje.
I det tredje exemplet förbehandlades A549-celler (humana lungadenocarcinomceller) med STAT3-aktivator-Colivelin20 (100 nM) i 48 timmar (h). STAT3-signalvägen är viktig för att främja stamningsegenskaperna hos tumörceller21. Som visas i figur 3ökade andelen SP-celler vid colivelinstimulering.
I det sista exemplet förbehandlades T47D-celler (mänskliga bröstcancerceller) med 0, 1 μM FRA1-hämmare-SKLB816 (även kallad 13an) i 48 h22. FRA1 är en rapporterad gatekeeper av epitelial-mesenchymal övergång (EMT) och deltar i reglering av tumör stemness23. Som visas i figur 4minskade andelen SP-celler på grund av behandling av FRA1-hämmare.
Figur 1: Gating strategi för MDA-MB-231 celler i SP analys. A)Gating strategi för MDA-MB-231 celler, som var färgade med Hoechst 33342 (3 μg/mL) och propidium iodid (PI, 1 μg/mL). B)Gating strategi för MDA-MB-231 celler, som behandlades med Reserpine (40 μM) och färgas med Hoechst 33342 (3 μg/mL) och PI (1 μg/ml). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Optimering av Hoechst 33342 koncentration och val av blockerare i MDA-MB-435 celler. A)SP-analysresultaten för MDA-MB-435-celler, som var färgade med Hoechst 33342 (Hoechst) vid olika koncentrationsgradienter (0, 5, 1, 1, 5, 2, 2,5, 3, 3, 5, 4 μg/ml) tillsammans med PI (1 μg/ml). (B) SP-analysresultatet av MDA-MB-435-celler, som behandlades med Verapamil (40 μM) och färgades med Hoechst 33342 (2 μg/ml) och PI (1 μg/ml). (C) SP-analysresultatet av MDA-MB-435-celler, som behandlades med Reserpine (40 μM) och färgades med Hoechst 33342 (2 μg/ml) och PI (1 μg/ml). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Andelen SP-celler förbättrades av STAT3-aktivatorn i A549-celler. a)SP-analysresultaten för A549-celler som förbehandlats med STAT3-aktivatorn-Colivelin (100 nM) eller dess fordonskontroll (Ctrl)-H2O i 48 timmar. A549 celler behandlade med Reserpine (45 μM) användes som blockerande kontroll. A549 celler var färgade med Hoechst 33342 (7 μg/mL) och PI (1 μg/mL). B)De statistiska resultaten av andelen SP-celler i A549-celler som behandlats med Colivelin (100 nM) och dess fordonskontroll. Data presenteras som medelvärde + standardfel för medelvärdet (SEM), n = 3 för varje grupp. "*" anger P < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Andelen SP-celler hämmades av FRA1-hämmare i T47D-celler. a)SP-analysresultaten för T47D-celler som förbehandlats med SKLB816 (0,1 μM) eller dess fordonskontroll (Ctrl)-DMSO för 48 timmar. T47D-celler behandlade med Reserpine (40 μM) användes som blockerande kontroll. T47D-celler var färgade med Hoechst 33342 (8 μg/ml) och PI (1 μg/ml). B)De statistiska resultaten av andelen SP-celler i T47D-celler som behandlats med SKLB816 (0,1 μM) och dess fordonskontroll. Data presenteras som medelvärde + SEM, n = 3 för varje grupp. "*" anger P < 0,05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.1. (A) Klicka på KNAPPEN MAPP. (B) Klicka på knappen Experimentera och klicka sedan på knappen Nytt experiment. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.2. (A) Klicka på OK-knappen. B) Experiment_001 dyker upp under MAPP. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 3: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.3. (A) Klicka Experiment_001 knappen för att ändra namnet på Experiment_001 till ett visst namn (t.ex. "20191118-SP"). (B) Klicka på knappen Retur. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 4: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.4. (A) Klicka på knappen Nytt prov. (B) Klicka på knappen Nytt rör. (C) Klicka på pilspetsknappen. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 5: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.5. (A) Klicka på knappen Parametrar för att ställa in parametrarna. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 6: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.6.1.2. (A) Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramet, klicka på X-axeln och ställ in det på "FSC-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "PI-A". (B) Klicka på polygonportknappen för att skapa en polygonport för att gate P1-delmängden (även känd som FSC-A, PI-A-delmängd). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 7: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.6.1.3. (A) Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramet, klicka på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "FSC-W". (B) Högerklicka på punktdiagramt och klicka på P1-knappen under Knappen Visa populationer. (C) Klicka på knappen Rektangulär grind för att skapa en rektangulär grind för att porta P2-delmängden (även känd som FSC-A, FSC-W-delmängd). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 8: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.6.1.4. (A) Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramet, klicka på X-axeln och ställ in det på "SSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "SSC-W". (B) Högerklicka på punktdiagrampet och klicka på P2-knappen under knappen Visa populationer . (C) Klicka på knappen Rektangulär grind för att skapa en rektangulär grind för att porta P3-delmängden (även känd som SSC-A, SSC-W-delmängd). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 9: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.6.1.5. (A) Klicka på knappen Punktdiagram för att visa punktdiagramt, klicka på X-axeln och ställ in den på "Hoechst Red-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "Hoechst Blue-A". (B) Högerklicka på punktdiagramt och klicka på P3-knappen under knappen Visa populationer. (C) Klicka på Polygon Gate-knappen för att skapa en polygonport för att gate P4-delmängden (även känd som Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A-delmängden). (D) Högerklicka på punktdiagramt och klicka sedan på knappen Visa befolkningshierarki för att visa befolkningshierarkin. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 10: Instruktioner för flödescytometerprogram stegnummer 3.6.1.6. (A) Klicka på knappen Hämta data och samla sedan in 20 000-100 000 händelser från varje prov. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 11: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.1. (A) Öppna programvaran för flödescytometrianalys och dra in en provfil i programvaran. B)Exempelfilen importeras. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 12: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.2.1. (A) Dubbelklicka på den här exempelfilen. klicka på Y-axeln och ställ in den på "PI-A". (C) Klicka på knappen Skapa en polygonport för att skapa en polygonport. (D) Klicka på OK-knappen för att få delmängden FSC-A, PI-A. E)Undergruppen FSC-A, PI-A erhålls. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 13: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.2.2. (A) Dubbelklicka på delmängdsfilen FSC-A, PI-A. (B) Klicka på X-axeln och ställ in den på "FSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "FSC-W". (C) Klicka på knappen Skapa en rektangulär grind för att skapa en rektangulär grind. (D) Klicka på OK-knappen för att få FSC-A, FSC-W-delmängden. (E) Delmängden FSC-A, FSC-W erhålls. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 14: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.2.3. (A) Dubbelklicka på delmängdsfilen FSC-A, FSC-W. (B) Klicka på X-axeln och ställ in den på "SSC-A"; Klicka på Y-axeln och ställ in den på "SSC-W". (C) Klicka på knappen Skapa en rektangulär grind för att skapa en rektangulär grind. (D) Klicka på OK-knappen för att få delmängden SSC-A, SSC-W. E)Delmängden SSC-A, SSC-W erhålls. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 15: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.2.4. (A) Dubbelklicka på delmängdsfilen SSC-A, SSC-W. (B) Klicka på X-axeln och ställ in den på "Hoechst Red-A"; klicka på Y-axeln och ställ in den på "Hoechst Blue-A". (C) Klicka på knappen Skapa en polygonport för att skapa en polygonport. (D) Klicka på OK-knappen för att få hoechst red-A, Hoechst Blue-A delmängd. (E)Undergruppen Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A erhålls. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 16: Instruktioner för programvara för flödescytometrianalys stegnummer 4.2.5. (A) Klicka på knappen Öppna layoutredigeraren för att öppna layoutredigeraren. (B) Dra exempelfilen SSC-A, SSC-W till Layout Editor. (C) Klicka på knappen Klicka för att spara layoutfönstret i filen för att spara bildresultaten. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga punkter att tänka på för SP-analysen. Den första är valet av en riktig blockerare, till exempel Verapamil eller Reserpine, för varje cellinje, eftersom SP-cellernas "gate" -plats bestäms enligt den position där ett stort antal SP-celler försvinner efter tillsats av blockeraren. För MDA-MB-231-cellinjen fungerar Reserpine bra. Men för andra cellinjer kan olika blockerare fungera bättre.
Den andra är koncentrationen av Hoechst 33342. Andelen SP-celler ökade i och med att färgningskoncentrationen av Hoechst 33342 minskade, vilket de representativa uppgifterna visade. Detta fenomen kan förklaras av färgämnesupptagskinetiken24. Förändringar i färgämneskoncentrationen påverkar anrikningen av Hoechst 33342 i celler. Därför är Hoechst 33342 färgningskoncentration nära relaterad till resultaten av SP-analys. Dessutom varierar upptaget och utvisningen av Hoechst 33342 mellan celltyperna. Således måste korrekta koncentrationer av Hoechst 33342 undersökas för olika cellinjer före SP-analysen.
Den tredje är en bra variationskoefficient (CV) av flödescytometern, vilket också är avgörande för SP-analysen25. UV-laserkraft är ett viktigt kriterium för bättre CV12. Detta protokoll använder en kommersiell flödescytometer (se Materialförteckningen)för att utföra SP-analysen. I detta cuvette-flöde-cell instrument använde vi UV-lasern med en effekt på 15 mW för att få de bästa CV: n. I allmänhet ger en relativt hög UV-laserkraft de optimala CV: erna. Till exempel ger 50–100 mW den optimala Hoechst-signalen på luft-i-luften-instrument12. Vissa lasrar ger lägre UV-effekt, vilket kan minska CV: n. I dessa fall är bra laserjustering avgörande.
Den sista är påverkan av andra faktorer under experimentet. Cellstatus, temperatur, färgningstid, funktion av flödescytometri och andra faktorer kan också påverka sp-analysens proportion och kvalitet. Till exempel kommer förändringar i cellens livskraft under beredningen av cellupphängningar att påverka förhållandet mellan SP-celler. Därför måste de bästa experimentella förhållandena utforskas innan SP-analysen utförs. Med tanke på ovanstående faktorer kan SP-förhållandet för samma cellinje som mäts av olika laboratorier vara annorlunda. Till exempel rapporterades proportionerna för MDA-MB-231-celler och A549-celler vara ~0,1%–4,8%26,27,28,29 respektive ~0,8%–18%30,31,32,33,34.
Forskare kan ändra denna analys för olika applikationer, såsom studier av andra tumör cellinjer, eller primära patient-härledda tumörceller. Om protokollet inte fungerar bra för de celler som testas kan forskarna använda MDA-MB-231-celler som positiv kontroll och färga cellerna enligt de angivna specifikationerna. Eftersom detta protokoll är mycket känsligt för koncentrationen av Hoechst 33342, färgningstemperatur och tid etc., bör forskarna kontrollera alla dessa förhållanden noggrant. Andelen SP i många typer av mänskliga tumör cellinjer är relativt låg (~ 0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Om en alltför hög eller låg andel SP observeras kan det bero på olämpliga koncentrationer av Hoechst 33342 eller blockerare som används. Om problemet verkar vara relaterat till flödescytometern bör tekniskt stöd erhållas.
Även om användningen av SP för att analysera och separera CSCs är mycket effektiv, har den fortfarande vissa begränsningar. Den första är dess höga känslighet för färgningsförhållanden12. Många faktorer, såsom koncentrationen av Hoechst 33342, cellstatus, temperatur, färgningstid, drift av flödescytometri och valet av blockerare, kan påverka kvaliteten på SP-analysen. Den andra är den cytotoxiska effekten av Hoechst 33342. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne, men är giftigt för celler när det når höga koncentrationer och därmed minskar cellaktiviteten37.
Sammanfattningsvis är SP-analys en av de vanligaste metoderna under de senaste åren för att identifiera och rena CSCs i tumör cellinjer. Även om metoden har vissa begränsningar, i avsaknad av specifika CSCs ytmarkörer, är det fortfarande en metod för bekväm, snabb och kostnadseffektiv berikning av CSCs. Denna metod är fördelaktig för att studera CSC:s biologiska funktioner och för identifiering av specifika ytmarkörer. Dessutom, genom att upptäcka effekterna av olika signaler på SP-förhållandet mellan tumörceller, kan det ge ledtrådar till den regulatoriska effekten av dessa signalvägar på CSCs funktioner och underlätta upptäckten av nya mekanismer, som i slutändan kan vägleda den riktade behandlingen av tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 och 81972787; Naturvetenskapliga stiftelsen i Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonder för de centrala universiteten, Nankai University 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
