Summary
De zuiverheid en integriteit van het geïsoleerde RNA is een essentiële stap in RNA-afhankelijke testen. Hier presenteren we een praktische, snelle en goedkope methode om RNA te extraheren uit een kleine hoeveelheid onbeschadigd alvleesklierweefsel.
Abstract
Ongeacht de extractiemethode worden geoptimaliseerde RNA-extractie van weefsels en cellijnen uitgevoerd in vier fasen: 1) homogenisatie, 2) effectieve denaturatie van eiwitten uit RNA, 3) ribonuclease-inactivatie en 4) verwijdering van besmetting uit DNA, eiwitten en koolhydraten. Het is echter zeer omslachtig om de integriteit van RNA te behouden wanneer er hoge niveaus van RNase in het weefsel zijn. Spontane autolyse maakt het erg moeilijk om RNA uit alvleesklierweefsel te extraheren zonder het te beschadigen. Zo is een praktische RNA-extractiemethode nodig om de integriteit van alvleesklierweefsels tijdens het extractieproces te behouden. Een experimentele en vergelijkende studie van bestaande protocollen werd uitgevoerd door het verkrijgen van 20-30 mg rattenvleesklierweefsels in minder dan 2 minuten en het extraheren van het RNA. De resultaten werden beoordeeld aan de hand van elektroforese. De experimenten werden uitgevoerd drie keer voor generalisatie van de resultaten. Het onderdompelen van alvleesklierweefsel in RNA-stabilisatiereagens bij -80 °C gedurende 24 uur leverde RNA met een hoge integriteit op, toen het RNA-extractiereagemiddel als reagens werd gebruikt. De verkregen resultaten waren vergelijkbaar met de resultaten van commerciële kits met spinkolombiningen.
Introduction
Structurele gengegevens kunnen worden getranscribeerd naar een functioneel product door middel van genexpressie. RNA-analyse wordt gebruikt om verschillen in genexpressie over verschillende omstandigheden te ontdekken. Er zijn een aantal methoden om nucleïnezuren als volgt te extraheren: guanidiniumthiocyanaat, extractie via fenol-chloroform, chromatografie op basis van cellulose, extractie door silicamatrices en anion-uitwisseling1,2.
De juiste detectie van genexpressie wordt beïnvloed door de integriteit van RNA geïsoleerd uit weefsels; daarom is het van essentieel belang om de integriteit van RNA geïsoleerd uit weefsels te evalueren voordat verdere tests worden uitgevoerd, omdat aanvullende moleculaire tests op RNA van lage kwaliteit diagnostische toepassingsresultaten in gevaar kunnen brengen. Zo is een hoge integriteit RNA nodig voor moleculaire biologische tests met verschillende diagnostische toepassingen: kwantitatieve RT-PCR, micro-arrays, ribonuclease beschermingstest, noordelijke vlekanalyse, RNA-mapping en cDNA-bibliotheekbouw3,4.
RNA wordt nogal instabiel na lange tijd te zijn gehouden. Lange mRNA-fragmenten van meer dan 10 kb zijn bijzonder gevoelig voor afbraak5,6. Zo moeten onderzoekers rekening houden met verschillende factoren die de integriteit van gezuiverd RNA beïnvloeden. De zuiverheid van RNA moet worden beschermd tegen RNases, eiwitten, genomisch DNA en enzymatische remmerbesmetting. Bovendien moet de beste en aanvaardbare absorptieverhouding van RNA tot UV (260/280) binnen het bereik van 1,8-2.0 liggen met minimale fragmentatie ten opzichte van elektroforese. Recent ontwikkelde laboratoriumtechnieken hebben wetenschappers in staat gesteld om de integriteit van moleculair analysemonster praktischer te evalueren7,8.
Het is veel moeilijker om onbeschadigd RNA uit alvleesklierweefsel te halen dan andere soorten weefsels vanwege de hoge hoeveelheid ribonucleases (RNases). De bestaande extractiemethoden, namelijk de snelle uitwerping van het alvleesklierweefsel uit de buikholte en homogenisatie bij lage temperaturen om RNases te belemmeren , hebben echter ineffectiefgebleken 7,8,,9,10,11,12,13,14.
Het doel van deze vergelijkende experimentele studie is het wijzigen en vergelijken van bestaande methoden om de meest efficiënte methoden te bepalen. Daartoe werden verschillende protocollen van RNA-extractie gewijzigd en vergeleken. Het was specifiek gericht op het bepalen van de minst dure methode die een minimale hoeveelheid pancreasweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring voor deze studie werd verkregen van Shiraz University of Medical Sciences (Goedkeuringsnummer: 93-01-01-7178\03-07-2014).
OPMERKING: Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 250 g. Plaats het flesje met een strook pancreasweefsel ondergedompeld in RNA stabiliserend reagens in een vloeibare stikstoftank op -80 °C en gebruik RNA-extractiereagentiaoplossing om de integriteit van RNA te behouden.
1. Verwijdering van het alvleesklierweefsel van de rat
- Bereid de operatiekamer voor en plaats alle benodigde materialen onder de motorkap.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten (Dressing tangen, Brown-Adson tangen, Iris schaar, en Kleine schaar) in een oven voor ten minste 4 uur bij 240 °C te activeren RNases15. Steriliseren het oppervlak van de operatieplaats met 70% alcohol onder de motorkap.
- Injecteer ketamine/xylazine intraperitoneally met behulp van een insulinespuit [80/8 mg/kg]. Controleer de diepte van de anesthesie door knijpen tenen van de rat voor een gebrek aan reactie.
- Voeg 1 mL RNA-stabilisatiereagemiddel toe in de juiste microbuis (2 mL) om de activering van endonucleases in uitgesneden weefsels te remmen.
- Plaats de rat onmiddellijk op de chirurgische raad (hoofd weg van de chirurg) voor een mid-line incisie.
- Steriliseren het gehele buikoppervlak met 70% alcohol en verwijder rattenhaar met behulp van een haarknipper met #40 messen.
- Maak een V-vorm incisie om de buik te openen van de schaamstreek naar de voorpoten met Dressing tangen, Brown-Adson forceps, Iris schaar, en Littler schaar.
- Draai de buikorganen naar de linkerkant om de alvleesklier bloot te leggen. Vind zorgvuldig het alvleesklierweefsel, dat zich verspreidt in de buikholte. Zoek het gebied onder de milt om de alvleesklier te vinden zonder te worden verward met het vetweefsel.
- Verwijder onmiddellijk 20-30 mg alvleesklier uit de buikholte in minder dan 2 min. Doe het verwijderde weefsel snel in de 2 mL microbuis en snijd het met een steriele frees om de gescheiden weefsels binnen te dringen met RNA-stabilisatiereage.
- Plaats de microbuis in een stikstoftank om onmiddellijk te bevriezen. Bewaar de microbuis 24 uur en16in een vriezer van -80 °C.
- Na 24 uur, breng de kleine stukjes pancreasweefsels naar een ijscontainer.
- Injecteer kaliumchloride (KCl) intracardially voor euthanasie van ratten na de operatie.
2. RNA-extractie
- Steriliseer het oppervlak onder de motorkap met 70% alcohol.
- Doe 1 mL van het RNA-extractiereagens, dat guanidiniumthiocyanaat bevat om RNase te remmen, in de steriele microbuis.
- Breng het gescheiden alvleesklierweefsel over op de microbuis. Breng de microbuis over op de vloeibare stikstof om onmiddellijk te bevriezen.
- Homogeniseer het weefsel met de microtip probe sonicator op 4 °C ingesteld op niveau 20 voor 60 s aan en 5 s uit.
- Incubeer elk gehomogeniseerd monster gedurende 5 minuten bij 4 °C met gemalen ijs om de nucleoproteïnecomplexen volledig gescheiden te laten zijn.
- Verrijk de monsters met 0,2 mL chloroform voor elke 1 mL RNA-extractiereagemiddel. Dop de buis stevig vast en schud hem krachtig voor 15 s.
- Incubeer de buis gedurende 15 minuten op het gemalen ijs (4 °C) om het reagens in drie fasen te scheiden.
- Voer de centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten op +2 tot +8 °C. Breng de kleurloze waterfase over naar een nieuwe microtube.
- Voeg 0,5 mL van 100% isopropanol toe aan de waterige fase. Sluit de buis en vervolgens ten minste 3 keer omkeren om het RNA grondig te mengen.
- Incubeer het monster gedurende 5-10 min op een koude doos (4 °C) om RNA-neerslag mogelijk te maken.
- Voer de centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten op +2 tot +8 °C. Gooi de supernatant weg.
- Verrijk elk van de centrifugebuizen met 1 mL van 75% ethanol.
- Was de RNA pellet door de buis minstens 3 keer om te keren.
- Voer de centrifuge op 7.500 x g op +2 tot +8 °C gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg om de overtollige ethanol uit de RNA-pellet te verwijderen door te drogen.
- Schort de RNA-pellet opnieuw op in diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld RNase-vrij water.
- Geef de oplossing meerdere malen door een pipettentip om de RNA-pellet op te lossen. Vervolgens, incubeer de oplossing voor 10-15 min bij +65 °C.
3. Evaluatie van RNA-integriteit met denaturatie-elektroforese
- Bereid de gelloopbuffer voor: 50 mM NaAc (DEPC behandeld) en 0,5 M EDTA (pH 8.0) in DEPC-behandelde H2O.
- Bereid 5x formaldehyde gel-running buffer (MOPS running buffer): 0.1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Los 20,6 g MOPS op in 800 mL behandeld 50 mM natriumacetaat. Pas de pH aan op 7.0 met 2 N NaOH. Voeg 10 mL DEPC-behandelde EDTA van 0,5 M (pH 8.0) toe. Pas het volume van de oplossing aan op 1 L met DEPC-behandeld water.
- Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm en houd deze op kamertemperatuur uit de buurt van licht omwille van de sterilisatie. De buffer wordt geel met de tijd als het wordt blootgesteld aan licht of is autoclaved. Een strokleurige buffer werkt goed, maar donkerdere niet17.
- Bereid een 1,5% agarose gel18. Voeg voor 50 mL 0,75 g agarose en 31 mL H2O. Magnetron de oplossing in de magnetron gedurende 1 min. Voeg 9 mL formaldehyde en 10 mL 5x MOPS lopende buffer toe.
- Bereid de monsters voor op de gel. Meng het volgende in een steriele microfugebuis:
X μL RNA (tot 30 μg)
2 μL 5x gel-loading buffer
10 μL formamide
4 μL MOPS lopende buffer
1 μL van 0,1 mg/mL EtBr
3 μL formaldehyde 5 x μL DEPC-H2O - Broed de monsters 15 minuten op 65 °C en koel ze af op ijs. Centrifuge voor 5 s totdat alle vloeistof is afgezet.
- Voer de gel 5 minuten uit op 5 V/cm.
- Laad de monsters onmiddellijk in de rijstroken van de gel en dompel de gel vervolgens onder in 1x formaldehyde gel-running buffer. Draaien op 3-4 V/cm19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van de integriteit van RNA in het RNA-extractiereagens volgens een routinematig en gewijzigd chirurgisch protocol zonder RNA-stabilisatiereagens
Onaanvaardbare banden werden waargenomen na de extractie van RNA met het RNA-extractiereagens uit een routine chirurgisch protocol. Lane 1 toont RNA van de lever als een controle. Lane 2 toont de gedegradeerde status van 28S/18S rRNA-banden in totaal RNA verkregen uit een routine chirurgisch protocol. Wanneer de hoeveelheid alvleesklierweefsel werd teruggebracht tot 50 mg (baan 3) of 20-30 mg (baan 4) en de operatie onmiddellijk werd uitgevoerd (gewijzigd protocol) zonder het RNA-stabilisatiereagemiddel, was de RNA-scheiding minder succesvol dan in de controle van het leverweefsel en werden niet-specifieke banden waargenomen.
Evaluatie van de integriteit van RNA-monsters volgens een gewijzigd chirurgisch protocol ondergedompeld in RNA-stabilisatiereagens
De integriteit van RNAs geproduceerd met het RNA extractie reagens is afhankelijk van de bewaartijd en temperatuur (baan 5-8). In vergelijking met de controle leverweefsel, RNA scheiding was niet succesvol wanneer de hoeveelheid pancreasweefsel was 50 mg (baan 5) of 20-30 mg (baan 6). RNA werd onmiddellijk geëxtraheerd nadat het weefsel was ondergedompeld in RNA-stabilisatiereagens. Er werd geen specifieke band waargenomen toen 20-30 mg weefsel werd ondergedompeld in RNA-stabilisatiereagens bij -80 °C gedurende 48 uur en RNA werd geëxtraheerd op basis van het protocol. Volgens de elektroforese resultaten werd het RNA volledig afgebroken (baan 7). Zoals afgebeeld in baan 8, werden aanvaardbare banden (28S/18S rRNA) waargenomen na het onderdompelen van 20-30 mg pancreasweefsel in RNA-stabilisatiereagensagemiddel bij -80 °C gedurende 24 uur, waarna RNA werd geëxtraheerd.
Figuur 1: Beoordeling van de integriteit van RNA geïsoleerd uit pancreasweefsels van ratten met behulp van RNA-extractiereagens volgens de protocollen die in het kader van het onderzoek worden uitgevoerd. Baan 1 toont de integriteit van RNA verkregen uit de lever als een controle. Lane 2 vertegenwoordigt de status van 28S/18S rRNA-banden in totaal RNA verkregen uit een routine chirurgisch protocol. Baan 3 vertegenwoordigt de status van 28S/18S rRNA-banden in totaal RNA verkregen uit een gewijzigd chirurgisch protocol en 50 mg weefsel. Baan 4 vertegenwoordigt de status van 28S/18S rRNA-banden in totaal RNA verkregen uit een gewijzigd chirurgisch protocol en 20-30 mg weefsel. Baan 5 vertegenwoordigt de status van 28S/18S rRNA-banden in totaal RNA verkregen uit een gewijzigd chirurgisch protocol en 50 mg weefsel dat onmiddellijk na ondergedompeld in RNA-stabilisatiereagens wordt geëxtraheerd. Baan 6 toont de integriteit van RNA verkregen uit 20-30 mg pancreasweefsel uit een gewijzigd chirurgisch protocol dat onmiddellijk na het onderdompelen in RNA-stabilisatiereagens wordt geëxtraheerd. Baan 7 toont de integriteit van RNA verkregen uit 20-30 mg weefsel uit een gewijzigd chirurgisch protocol na 48 uur onderdompeling in een RNA-stabilisatiereagens bij -80 °C. Baan 8 toont de integriteit van RNA verkregen uit 20-30 mg weefsel uit een gewijzigd chirurgisch protocol na 24 uur onderdompeling in een RNA-stabilisatiereagensage bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de moleculaire biologie is het van vitaal belang om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen. De aanwezigheid van de ribonuclease enzymen in cellen en weefsels degradeert snel RNA en maakt de extractie complex. RNases zijn stabiele enzymen die functioneren zonder mede-factoren. Kleine hoeveelheden RNase zijn voldoende om RNA te vernietigen. Wanneer het alvleesklierweefsel van de rat uit de buikholte wordt verwijderd, is het noodzakelijk om de chirurgische instrumenten te desinfecteren met sterke detergenten, ze grondig af te spoelen en ze ten minste 4 uur bij 240 °C in een oven te zetten om RNases voor de operatie te inactiveren. Gezien het feit dat het RNase-niveau extreem hoog is in de alvleesklier, wordt de plaats van de operatie gesteriliseerd met NaOH en mild bleekmiddel om de RNases te deactiveren. Terwijl alvleesklierweefsel wordt verwijderd tijdens dissectie, zou het RNA degraderen. Om de efficiëntie te verhogen, moet de dissectie zo snel mogelijk worden voltooidop 20,21,22,23,24.
De alvleesklier is een kritisch weefsel voor homeostatische mechanismen van het lichaam. Vandaar, betere pancreas RNA extractie procedures helpen onderzoekers beter te begrijpen actieve trajecten. Het huidige protocol stelde een model voor voor een efficiënte, eenvoudige en geoptimaliseerde methode voor RNA-extractie uit de alvleesklier. Verschillende gemeenschappelijke RNA extractie methoden van pancreasweefsel werden geëvalueerd. Het was geconcentreerd op het effect van bevroren opslag en RNase remmingsstrategieën die de kwaliteit van RNA beïnvloeden. De twee belangrijkste factoren die van invloed zijn op de integriteit van RNA zijn de duur van de operatie en de hoeveelheid verzameld alvleesklierweefsel. Recente studies hebben aangetoond dat er een positieve correlatie is tussen RNA-afbraak en de hoeveelheid pancreasweefsel8,13,20.
In dit protocol werd 20-30 mg alvleesklierweefsel verkregen in minder dan 2 minuten van de verdoofde ratten. Lange chirurgische stappen kunnen leiden tot activering van endogene endonucleases in de alvleesklier en degraderen het RNA snel. In deze studie werd RNA geïsoleerd uit verschillende monsters met guanidiniumthiocyanaat, en fenolchloroforme extractietechnieken gebruikten vloeibare stikstof om de RNA-activiteit te belemmeren. De methode bereikte drie doelstellingen: snelle permeatie van RNA-stabilisatiereagemiddel in alvleesklierweefsels, bescherming van cellulair RNA en verhoogde bewaartijd. De resultaten waren optimaal toen de monsters met RNA-stabilisatiereagemiddel gedurende 24 uur op -80 °C werden gehouden.
De integriteit van het RNA nam echter aanzienlijk toe toen RNA-stabilisatiereageagentia werden geïntroduceerd. Bovendien was dit proces reproduceerbaar. Een klein deel van de alvleesklier (20-30 mg) werd ontleed tijdens de operatie van verdoofde ratten en ondergedompeld in 1 mL RNA stabilisatie reagens bij -80 °C gedurende 1-2 dagen. Zoals te zien in baan 8, opslag voor 24 uur was de optimale tijd.
De bovengenoemde methoden lieten een kleinere hoeveelheid RNA-stabilisatiereagemiddel toe om in het orgaan door te dringen. Bovendien werd het afbraakproces kort na de experimenten stopgezet omdat de grootte van de ontleede stukken klein was. In dit protocol is de essentiële stap het snijden van het ondergedompelde weefsel in RNA-stabilisatiereagensagemiddel in zeer kleine stukjes zo spoedig mogelijk totdat het de cellen doordringt en de activering van RNase onderdrukt. In de homogeniserende stap is het van cruciaal belang om de productie van bellen in het RNA-extractiereagemiddel te voorkomen en alle stappen bij 4 °C uit te voeren. Het is van cruciaal belang om de aquafase (de fase met RNA) zeer zorgvuldig te scheiden om DNA-besmetting te voorkomen. Hoewel autolyse en de aanwezigheid van endogene RNases intacte RNA-isolatie van de rattenalvleesklier compromitteren, werd de integriteit van RNA gehandhaafd in de voorgestelde pancreasperfusiemethode. De voorgestelde methode is dus een eenvoudige, reproduceerbare en goedkope procedure die kleinere hoeveelheden RNA-stabilisatiereagemiddel vereist dan de andere bestaande methoden.
Zoals elke studie, dit protocol heeft een aantal beperkingen. Ten eerste is de integriteit en opbrengst van verkregen RNA minder dan het gebruik van hele alvleesklierweefsel omdat slechts 20-30 mg weefsel wordt gebruikt. Ten tweede kan een groot aantal monsters niet in één dag worden genomen, omdat RNA-extractie en ook cDNA-synthesetests snel en achtereenvolgens moeten worden uitgevoerd om de afbraak van RNA te verminderen. Ten derde, om onderzoeksprojecten uit te voeren met verschillende rattengroepen, is het essentieel om precies 20-30 mg weefsel uit hetzelfde chirurgische gebied te nemen om variatie van gegevens te verminderen omdat rattenvleesklierweefsel zich volledig in de buikholte verspreidt.
Tot slot, met behulp van RNA extractie reagens oplossing na RNA stabilisatie reagens perfusie is een goed alternatief voor dure en kolom-gebaseerde RNA extractie kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen verklaard.
Acknowledgments
De huidige studie werd financieel ondersteund door de Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Wij danken de heer Zomorodian en de heer Rostami op het departement e-Learning in medische wetenschappen, Virtuele School en Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences voor het bewerken van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J.
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
